Name: Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a usar a tecnologia snap chip para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. Este método simplificado elimina a necessidade de spotters complexos e avança a descoberta de biomarcadores proteicos em pesquisa oncológica.

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Agradecemos o Dr. Rob Sladek para o uso dos auxiliares do inkjet. Reconhecemos o apoio final dos institutos canadenses para pesquisa de saúde (CIHR), as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC), Instituto de pesquisa canadense de sociedade cancros e a Fundação do Canadá para a inovação (CFI). Obrigado D.J. suporte de uma cadeira de pesquisa do Canadá.

1. fabricação e armazenamento de fichas de snap <ol><li>método de transferência única ( Figura 1a) <ol><li>ponto táxi soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos e glicerol 20% em tampão fosfato salino (PBS) para uma nitrocelulose (ou um vidro funcionalizado) slide de ensaio com um jato de tinta microarray spotter 13 em uma umidade relativa de 60% (1.2 nL para cada spot) com espaçamento de centro--800 µm. Certifique-se de que o slide é fixado sobre o convés do observador de acordo com um canto (aqui, foi usado o canto inferior esquerdo).</li>
		<li>Incubar o slide manchado ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%.</li>
		<li>Pinça uma junta de módulo de slide com 16 compartimentos no slide do ensaio para dividi-lo em 16 poços. Enxágue o slide três vezes adicionando 80 µ l de PBS contendo 0,1% Tween-20 (PBST) em cada bem e tremendo a 450 rpm num agitador, 5 minutos de cada vez.</li>
		<li>Adicionar 80 µ l de bloqueio soluções para cada um bem e agitar durante 1 h a 450 rpm.</li>
		<li>Remover a junta e seque o slide de ensaio com um fluxo de nitrogênio.</li>
		<li>Consertar um slide de transferência do convés de observador e empurrar o canto inferior esquerdo do slide contra o canto inferior esquerdo do baralho observador. Jato de tinta manchar uma matriz de marcas de alinhamento (uma solução de microesferas de poliestireno) com o mesmo layout que para os táxis.</li>
		<li>Seque as marcas de alinhamento. O slide de transferência da aleta e colocá-lo de volta para o convés do observador, fixação contra o canto inferior esquerdo.</li>
		<li>Preparar o dAb manchando soluções contendo 20 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% de BSA.</li>
		<li>Usando o localizador &#39; s câmera, tire uma foto de uma marca de alinhamento. Implementar esta imagem no programa como um fiducial manchar e obter o sistema de reconhecimento de imagem dos auxiliares do inkjet para identificar a marca mais superior esquerda. Use seu coordenar como o primeiro ponto da matriz dAb. Ponto 8 nL por gota com um espaçamento de centro a centro de 800 µm.</li>
	</ol></li> <li>Método de transferência dupla ( Figura 1b) <ol><li>colocar um slide de transferência 1 no convés de observador de jato de tinta contra o canto inferior esquerdo. Ponto de táxis soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% BSA em PBS a lâmina com um localizador de microarray de jato de tinta em uma umidade relativa de 60% (0.4 nL para cada local e ~ 200 µm de diâmetro). O espaçamento do centro-à-centro é 400 µm.</li>
		<li>Estalar o slide de ensaio de slide com uma nitrocelulose revestido (ou um vidro funcionalizado) transferência usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de táxi para o slide de ensaio.
		<ol><li>Vez todos os seis botões no lado do aparelho de pressão em 90 graus para puxar e travar todos os êmbolos na posição aberta. Introduza o slide de transferência no suporte de slide em seu receptáculo com o canto cortado virado para o pino fixo pogo. Vire o primeiro conjunto de três botões para liberar os êmbolos com o pino de pogo ouro e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.</li>
			<li>Inserir um slide de nitrocelulose revestido no snap aparelhos de ponta-cabeça sentado nos 4 pinos pogo. Virar o segundo conjunto de três botões para libertar êmbolos com o pino prateado e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.</li>
			<li>Fechar o aparelho de pressão, colocando o revestimento superior no suporte do slide usando o alinhamento pilares e buracos para um posicionamento preciso.</li>
			<li>Inserir o aparelho de pressão fechado em sua gaiola e aperte a aba de fechamento completamente para trazer os microarrays face a face e aplicando a pressão adequada. Manter fechado por 1 min.</li>
		</ol></li> <li>Separar os slides. Incube o slide de ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%. Lavar, bloquear e secar o slide de ensaio conforme descrito nas etapas 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Coloque outro slide de transferência sobre o convés do observador de jato de tinta e empurre contra o canto inferior esquerdo. Soluções de ponto dAb contendo 50 ou 100 µ g/mL de anticorpos (ver tabela 1), 20% de glicerol e 1% de BSA em PBS. Certifique-se de que cada ponto é 0.8 nL e o centro--espaçamento entre pontos é de 400 µm.</li>
		<li>Armazenar o ensaio e o slide de transferência. Selo do ensaio e a transferência de slides em um saco hermético contendo dessecante e colocar no congelador-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexado imunoensaios com snap chips <ol><li>recuperar o slide de ensaio do freezer. Deixar o saco selado por 30 min até que o slide vem à temperatura ambiente.</li>
	Série 7-ponto de <li>preparar diluído soluções de amostra por cravação proteínas em PBS contendo 0,05% Tween-20. 
	Nota: Aqui, um factor de diluição de 5-fold é usado. As concentrações inicial para cada proteína estão listadas na tabela 1.</li>
	<li>Preparar soluções de amostra conforme apropriado. Por exemplo, diluir o soro humano 4 vezes em tampão PBST.</li>
	<li>Braçadeira uma junta 16-compartimento do slide ensaio.</li>
	<li>Preencher uma coluna de 8 poços com as soluções de diluição de 7 proteína e uma solução-tampão PBST livre de proteína por pipetagem. Pipetar as soluções de amostra em outros 8 poços no mesmo slide. 
	Nota: podem ser ajustar 80 soluções µ l em cada poço. Mais slides podem ser usados para medir amostras adicionais quando necessário.</li>
	<li>Incubar as amostras num agitador a 450 rpm 1 h à temperatura ambiente ou para pernoite no 4 ° C. lavagem do slide 3 vezes com PBST no agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez. Remova a gaxeta e seque o slide em um fluxo de gás nitrogênio.</li>
	<li>Recuperar o slide de transferência com pinceladas do congelador. Manter o saco selado por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, incubar o slide em uma câmara fechada (por exemplo, caixa de dicas vazio) contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% por 20 min para reidratação.</li>
	<li>Estalar o slide de transferência com o slide de ensaio usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de bagatela. Ver secção 1.2.2 para a operação do aparato snap.</li>
	<li>Separar os slides. Incubar o slide de ensaio em uma câmara fechada contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% para h. 1 braçadeira do slide de ensaio com uma junta de 16-compartimento e enxaguar o slide 4 vezes usando PBST num agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez.</li>
	<li>Pipeta 80 µ l de soluções contendo 2,5 µ g/mL streptavidin fluoróforo na PBS em cada poço. Incubar durante 20 min em uma coqueteleira a 450 rpm.</li>
	<li>Enxaguar o slide 3 vezes com PBST e uma vez com água destilada no agitador a 450 rpm. Remova a gaxeta e seque o slide usando gás nitrogênio.</li>
</ol> 3. Deslize a verificação e análise de dados <ol><li>digitalizar o slide de ensaio com um scanner de microarray de fluorescência usando o laser de 635 nm.</li>
	<li>Extrair a intensidade líquida de cada ponto, usando uma análise de software (por exemplo, o analisador de matriz-pro) 16.</li>
	<li>Calcular o limite de detecção (LOD) de cada proteína usando um software de estatísticas e determinar as concentrações de proteína em amostras de. 
	Nota: O LOD é definida como a intercepção de Y da norma cuEva, incrementada por três vezes o desvio padrão de três ensaios independentes.</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
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</ol>

McGill University apresentou um pedido de patente sobre alguns aspectos desse trabalho com Huiyan Li e David Juncker como inventores.

Neste trabalho, apresentamos uma tecnologia de chip de pressão que faz com que o livre de cross-reactivity multiplex imunoensaios amplamente disponíveis para os pesquisadores com configuração básica experimental. Diferente da existente Microarrays do anticorpo, nenhum observador microarray é necessária para os usuários finais. Tanto single e double métodos de transferência são demonstrados e transferência dupla oferece precisão de alinhamento superior para ~ 40 μm para manchas de 98%, com o maior desalinhamento de 63 µm<...

Um painel de biomarcadores, compreendendo várias proteínas pode fornecer maior sensibilidade e especificidade do que um único biomarcador no diagnóstico de doenças complexas como câncer1,2. O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a padrão-ouro tecnologia utilizada em laboratórios clínicos, alcançar um limite de detecção em baixa pg/mL no plasma, mas os limites para um destino por ensaio3,4,5. Os microarrays do anticorpo foram desenvolvidos para acomodar milhares de ensaios miniaturizados conduzidas em paralelo em um microscópio único slide6,7,8. No entanto, a capacidade de multiplexação desse método é limitada pela reactividade cruzada orientada no reagente, decorrentes da aplicação de uma mistura de dAbs, e torna-se mais problemático com um número crescente de destinos9,10 , 11. Pla et al. afirmaram que a vulnerabilidade resultante de um ensaio de sanduíche multiplex dimensiona como 4N(N-1) onde N é o número dos alvos12.
Para atenuar a reactividade cruzada em Microarrays do anticorpo, o anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido em nosso laboratório para ensaio de sanduíche multiplex12. Anticorpos de captura (táxis) estão manchados em uma carcaça com um localizador de microarray. Após bloqueio amostras são aplicadas na superfície, e então pinceladas individuais são avistadas nos mesmos pontos com o complexo antígeno-táxi. Todos os cenários de reactividade cruzada entre antígenos e anticorpos podem ser atenuados com ACM, e limites de detecção em pg/mL foram alcançados. No entanto, o protocolo de ensaio requer preparação e manchando os dAbs durante os experimentos usando um localizador de microarray no local com alta precisão para efeito de alinhamento, que é caro e demorado, limitando a ampla aplicação desta tecnologia na outros laboratórios. Um ACM portátil, chamado snap chip foi desenvolvido para cross-reactivity-free e livre de observador multiplex sanduíche imunoensaios13,14,15. Táxis e pinceladas são pre-manchadas em um slide de ensaio e um slide de transferência respectivamente em formato de microarray e armazenadas. Durante o ensaio, os slides são recuperados e um microarray de pinceladas são transferidos coletivamente para o slide de ensaio simplesmente estalar dois chips juntos. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagente. Slides de nitrocelulose revestido com uma capacidade de ligação do anticorpo relativamente grande têm sido usados como os slides de ensaio para absorver as gotas de líquido e, assim, facilitar a transferência de reagente, no entanto, os slides são mais caros que microarray e corrediças de vidro normal os scanners compatíveis com lâminas transparentes são necessários para a aquisição do sinal.
Neste trabalho, vamos demonstrar o protocolo da realização de um imunoensaio sanduíche multiplex com um chip de snap. Um aparelho de pressão romance foi desenvolvido para transferência de reagente mais conveniente e confiável de microarray-para-microarray. Importante, aqui nós temos estabelecido o método de transferência de reagente para lâminas de vidro normal com o chip de snap. 1024 pontos com êxito foram transferidos e alinhados numa lâmina de vidro, ampliando significativamente o uso desta tecnologia na maioria dos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Comprimido de solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-conjugated Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio: Estabilizador de Microarray StabilGuard Choice sem BSA</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com nitrocelulose</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com aminosilano</td><td>Schott América do Norte</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Inkjet microarray spotter</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Gaxeta do módulo deslizante</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>grânulos de estabilização de umidade</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Versão 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de microarray de fluorescência</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>Software de bioestatística</td><td>Software GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura de endoglina</td><td>R & D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Endoglin</td><td>R& D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção de endoglina</td><td>R& D Sistemas</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a (ver Tabela 1)</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (ver Tabela 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snap o chip para imunoensaios livre de cross-reactivity e spotter sanduíche multiplexado

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Multiplexado proteína análise mostrou sensibilidade diagnóstica superior e precisão em comparação com proteínas única. Os microarrays do anticorpo permitem milhares de micro escala imunoensaios executados simultaneamente em um único chip. Formato de ensaio sanduíche melhora a especificidade do ensaio, detectando cada alvo com dois anticorpos, mas sofre de reactividade cruzada entre reagentes, limitando assim a sua capacidade de multiplexação. Anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido para a deteção de proteínas multiplexado cross-reactivity-livre, mas requer um caro observador no local para a fabricação de microarray durante os ensaios. Neste trabalho, vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap que transfere o reagente de microarray-para-microarray por simplesmente tirando dois chips juntos, que assim, nenhum observador é necessária durante a incubação da amostra e posterior aplicação de anticorpos de deteção (dAbs) em cima armazenamento de slides pre-manchados, dissociando a preparação de slide da execução do ensaio. Ambos os métodos de transferência de simples e duplas são apresentados para atingir o alinhamento exato entre os dois microarrays e a fabricação de slide para ambos os métodos são descritos. Os resultados mostram que &#60; 40 μm alinhamento foi conseguido com dupla transferência, atingindo uma densidade de matriz de 625 pontos/cm2. Um imunoensaio 50-plexed já foram realizado para demonstrar a facilidade de utilização do chip snap na análise de proteína multiplexado. Limites de detecção de 35 proteínas estão no intervalo de pg/mL.

O procedimento de ensaio para single e double métodos de transferência é mostrado na Figura 1. Na única transferência, os táxis são vistos diretamente no slide do ensaio e as pinceladas são transferidas para o slide de ensaio mediante a utilização de um padrão de espelho dos táxis (Figura 1a). Procedimento de transferência apenas uma é necessário, mas este método sofre de desalinhamento entre os dois microarrays, causada principa...

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar simultaneamente múltiplas proteínas no chip utilizando ensaios imunoenzimáticos do tipo sanduíche de forma isenta de impressão, sem reatividade cruzada entre os reagentes. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área de proteômica quantitativa, como a descoberta e validação de biomarcadores proteicos candidatos em câncer. As principais vantagens desta técnica são a ausência de reatividade cruzada entre anticorpos e antígenos em ensaios sanduíche multiplexados e o fato de os usuários não necessitarem de um spotter microarranjo complexo.Quem demonstrará o procedimento será Heidi Larkin, diretora científica da Parallex BioAssays. Para começar a preparar as lâminas para o método de transferência única, fixe uma nova lâmina de transferência no suporte do microarranjo jato de tinta. Usando uma solução de microesferas de poliestireno ou glicerol a 30%, deposite um arranjo de marcas de alinhamento na borda da lâmina.Utilizando o software do instrumento e a câmera do spotter, tire uma foto das marcas de alinhamento para controle de qualidade. Em seguida, fixe um lâmina de ensaio de nitrocelulose ou vidro funcionaliz

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em...

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

Um ELISA pode ser facilmente convertido para um ensaio de xMAP Luminex e, através dos benefícios da multiplexação, vários anticorpos podem ser rastreados simultaneamente para identificar um par de anticorpos óptima, resultando em aumento da sensibilidade e gama dinâmica, enquanto reduz o custo do ensaio.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

O vídeo mostra a implementação da tecnologia de chip instantâneo para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. A simples ação de encaixar duas lâminas de microarray, cada uma contendo reagentes diferentes, garante a transferência de reagentes sem contaminação cruzada e ajuda a detectar várias proteínas usando imunoensaio sanduíche.

Uma tecnologia Snap Chip para um imunoensaio sanduíche multiplexado livre de reatividade cruzada

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

A presença de toxinas cianobacterianas em reservatórios de água doce para consumo humano é uma grande preocupação para as autoridades de gestão da água. Para avaliar o risco de contaminação da água, este artigo descreve um protocolo para a detecção em campo de cepas de cianobactérias em amostras líquidas e sólidas usando um chip de microarray de anticorpos.

Protocolo experimental para Detectar Cianobactérias Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.

Plataforma Analítica Multimodal em um Chip de Ressonância de Plasmon de Superfície Multiplexada para a Análise de Subconjuntos de Vesículas Extracelulares

A análise de imagens multiplexadas com código de barras tem melhorado recentemente a caracterização do microambiente tumoral, permitindo estudos abrangentes da composição celular, estado funcional e interações célula-célula. Neste artigo, descrevemos um protocolo de coloração e imagem usando o código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos e imagens cíclicas, que permite o uso de uma técnica de análise de imagens de alta dimensão.

Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Aprenda a usar a tecnologia snap chip para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. Este método simplificado elimina a necessidade de spotters complexos e avança a descoberta de biomarcadores proteicos em pesquisa oncológica.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

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