Name: Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a obter seções ultra-finas seriadas de microrganismos para microscopia eletrônica de transmissão sem equipamentos caros. Este método acessível fornece informações estruturais tridimensionais de células inteiras.

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Agradecemos sinceramente Shigeo Kita, por suas valiosas sugestões e discussão. Agradecemos também a John e Sumire Eckstein para sua leitura crítica do manuscrito.

Nota: As amostras utilizadas neste estudo foram microorganismos, rapidamente congelados com propano em nitrogênio líquido, congelam substituídos em acetona contendo 2% de tetróxido de ósmio e incorporado em epóxi resina1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparação do filme de apoio (Figura 1-3)
Nota: Filme de suporte prateado Formvar é preparado usando o método de molde-em-vidro19.
<ol><li>Adicionar 100 mL de 1,5% Formvar no dicloreto de etileno, para um aparelho de fabricação de Formvar (Figura 1). Mergulhe metade de uma lâmina de vidro (76 x 26 x 1,3 mm) em solução de Formvar na coluna superior do aparelho, pressionando a solução com o ar através de 'um' usando uma bola de borracha19.<ol>
<li>Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar através de 'b' para reduzir a pressão. Retire a lâmina de vidro do aparelho e seco no ar para formar uma película na superfície do vidro slide. Use uma lâmpada de incandescência para acelerar a secagem do filme Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de raspar as quatro bordas do filme sobre a lâmina de vidro com uma lâmina de barbear (Figura 2a) e respirando para o slide para facilitar a separação do filme do slide20, flutuam o filme na água por imersão da lâmina de vidro para o água lentamente em um ângulo horizontal baixo (cerca de 10°, Figura 2b).</li>
	<li>Colher-se o filme de Formvar da água usando um rack de alumínio (30 x 25 x 3 mm) com furos (4 mm de diâmetro) (Figura 3a). Manter o rack com o filme de Formvar num exsicador até à utilização (Figura 3b).</li>
</ol>2. corte o bloco de amostra com uma lâmina de corte ultra-sônico e uma lâmina de barbear 21 sob um estereomicroscópio (Figura 4)
<ol><li>Certifique-se de que existem células na superfície do bloco, observando a ponta do bloco com um microscópio de luz (figura 4a).</li>
	<li>O bloco de amostra no mandril (suporte de bloco) e montagem do mandril em um palco de aparamento21 (figura 4b). Nesta fase de aparamento tem um mecanismo de iluminação na parte de trás do espécime.</li>
	<li>Apare o bloco para um tamanho de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Uma vez que a resina epóxi é muito difícil, apare os blocos primeiro usando uma lâmina de corte ultra-sônico. A lâmina de corte ultra-sônico é uma máquina recém introduzida, e os blocos são facilmente cortados. Então corte o bloco ainda mais com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção de corte (consulte a Figura 5 d, Figura 8).</li>
</ol>3. corte o bloco de amostra com faca de diamante usando o micrótomo (Figura 5)
<ol><li>Defina o bloco de amostra chuck no porta-amostra do ultramicrotome. Coloque o espécime 90° no sentido anti-horário contra a posição real quando ultrafinos de seccionamento serial é realizada (ver Figura 5D).</li>
	<li>A superfície do bloco de corte com uma faca de corte de diamante (ver Figura 5 d). Definir a navalha de diamante paralelas na face do bloco de amostra e corte a quantidade mínima da superfície de amostra para não perder qualquer espécime (Figura 5D). Nota: Este passo é feito para suavizar a superfície da amostra. A parte da superfície do espécime da parte magro permanece intacta (por conseguinte, esta parte não brilha como um espelho, Figura 5D), para não perder nenhuma parte da amostra para seccionamento serial. Isto é porque o espécime é exposto na superfície do bloco.</li>
	<li>Coloque um espelho (corte de Mesa, M) no palco faca para monitorar o corte do bloco de amostra (Figura 5C).</li>
	<li>Corte a borda esquerda (isso se torna o lado superior, Figura 5D, da amostra no seccionamento serial) do bloco usando faca de aparar girando o palco faca 30 ° para a esquerda (Figura 5a).</li>
	<li>Corte o rosto de bloco em cerca de 100 µm da borda esquerda da amostra (este torna-se o lado inferior da amostra no seccionamento serial, Figura 5D), rodando o palco faca 30 ° para a direita (Figura 5b). Nota: As seções seriais serão cortadas da parte magro da amostra de cerca de 90 nm x cerca de 1 mm de tamanho. A grande parte será usada para ajustar a superfície da amostra e a navalha, tal que eles são paralelos. Depois de ajustar a superfície do espécime para ser paralela à borda da faca, o grande parte será removida com uma lâmina de barbear. Cortando os lados superiores e inferiores da amostra usando o micrótomo, ambos os lados da amostra se tornar suave e exatamente paralelos uns aos outros (Figura 5D), que é necessário para obter as seções de fita reta e ininterrupta.</li>
</ol>4. ajustar a borda de superfície e faca de espécime para que eles enfrentam paralelo a outro 21
<ol><li>Remover a faca de corte e rodar o bloco de amostra 90° no sentido horário.</li>
	<li>Defina uma faca de corte ultrafino para a fase de faca.</li>
	<li>Ajuste a superfície da amostra e a navalha para que eles enfrentam paralelos uns aos outros usando a grande parte da superfície do espécime. Nota: A grande parte da amostra é usada para o ajuste porque a face de corte de seccionamento serial é tão pequena, que dificulta a ajustar a borda de superfície e faca de amostra usando esta parte só, especialmente no sentido vertical. Assim, usando a grande parte da amostra facilita o ajuste.</li>
</ol>5. espalhar a solução do neopreno do bloco de amostra (Figura 6)
<ol><li>Para colocar o chuck espécime em exatamente a mesma posição que a posição original, aplique a fita sobre o chuck e o chuck titular do micrótomo e cortar no limite do (Figura 6a).</li>
	<li>Retire o espécime chuck do micrótomo e colocá-la sob o microscópio estereoscópico (Figura 6b). Corte a grande parte da amostra com uma lâmina de barbear, deixando a parte de magro, do qual seriais seções serão obtidas.</li>
	<li>Com uma pipeta Pasteur, solte cerca de 1 µ l 0.5% do neopreno solução (Figura 6b) para a amostra a ser usada para o seccionamento serial, para fazer o adesivo de lados de seção. Cobrir o espécime com solução de neopreno. Absorva a solução de neopreno excesso imediatamente com um pedaço de papel de filtro colocado perto da amostra. Uma fita de seções é essencial para tirar fotos das seções de celular serial e cola neopreno é muito útil para furar as seções junto.</li>
	<li>Preparar 3 fenda grades (tamanhos de fendas: médio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos os lados 0,2 x 2,2 mm) (Figura 6C) para pegar seriais seções dobrando o punho das grades para 60 °, tratando as grades com solução de neoprene de 0,5% e fazendo as grades hidrofílico por de descarga do fulgor22.</li>
</ol>6. fazer seções seriais (Figura 7-9)
<ol><li>Lugar do bloco de amostra chuck volta em micrótomo na mesma posição como 5.1 (Figura 6a), alinhando as peças gravadas. Isso mantém a face do bloco e o fio da navalha perfeitamente paralelos uns aos outros. Depois trago a faca perto da amostra.</li>
	<li>Encha o barco de faca com água.</li>
	<li>Cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para impedir o fluxo de ar (Figura 7). Nota: O fluxo de ar durante o seccionamento ultrafinos e recuperação das seções, muitas vezes causar problemas. A tampa de plástico tem três buracos: um buraco é para as lentes do binóculos, e outros dois furos são para os braços permitir a operação enquanto a tampa estiver ligada. O braço de madeira é usado para a colocação de braços enquanto fazia um trabalho delicado, como recuperar seriais seções com grades. O braço de madeira é colocado em tabelas diferentes da tabela micrótomo (Figura 7, setas), para não transmitir a vibração das mãos do operador para o micrótomo.</li>
	<li>Comece a cortar a amostra em espessura de corte de 200 nm (Figura 8). Configuração em espessura de 200 nm poupará tempo em trazer a faca para a superfície da amostra.</li>
	<li>Após a primeira seção é cortada, definir a espessura de corte de 70 nm (Figura 8).</li>
	<li>Quando o número de seções seriais atinge 20 (precisamente falando, depois os alcances de fita cerca de 1,8 mm; o número de seções varia de acordo com a largura das seções), definir a espessura de corte de 10 nm (Figura 8), continuando a cortar. Nota: Desde o micrótomo não pode cortar 10 nm de espessura seções, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separaram da borda de faca. É importante obter grupos de seções separadas (Figura 9) para pegar seriais seções para evitar a dificuldade em separar seções manualmente usando um par de fios de cabelo. Desde o campo de visão no microscópio de elétron da transmissão é de 2,0 mm, seções devem ser no máximo 1,8 mm de comprimento.</li>
	<li>Definir a espessura de corte de 60 nm (Figura 8). Isto produzirá 70 seções nm (Figura 8), porque a máquina irá adicionar a espessura de nm 10 anterior.</li>
	<li>Definir a espessura de corte para 70 nm (Figura 8) e continue o corte até 1.8 mm-longo seções são obtidas.</li>
	<li>Repita 6,6-6,8 até cinco seções longas de 1,8 mm são obtidas (Figura 9). Geralmente fazemos cinco grupos de seção, desde há cinco suportes de amostra no microscópio eletrônico de transmissão disponíveis em nosso laboratório, mas cinco não é o limite.</li>
</ol>7. pegar seriais seções (Figura 10-12)
<ol><li>Coloque a 'seção-exploração loop'23 (diâmetro interno do loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sobre o terceiro grupo de seção (Figura 10b). Nota: É necessário recuperar as seções na ordem de sua corte para tirar fotos na ordem correta. No entanto, desde há cinco grupos de seção do barco de faca, isso muitas vezes Obtém confundindo quais os grupos que são. Colocando o loop no terceiro grupo, torna-se claro que os dois grupos perto do operador são o primeiro e o segundo e os dois distantes do operador são os grupos IV e v (Figura 10b). Isto impedirá que mistura-se a ordem.</li>
	<li>Coloque a ''água de superfície-sensibilização loop23 (WSRL, diâmetro interno do loop: 4,0 mm) (Figura 11a) na fase de faca (Figura 11b). O WSRL vai ficar firmemente no palco faca porque é equipado com um imã na parte inferior.<ol>
<li>Coloque o loop do WSRL acima as seções seriais movendo seu eixo e o punho. Baixe o loop do WSRL na superfície da água para que o laço circunda as seções.</li>
		<li>Empurre o loop através do parafuso para baixo para que a superfície da água irá disparar pela tensão de superfície (figuras 11-c-d). Mover a seção para o centro do laço, posicioná-lo no ápice da água e ajustar a direção da seção usando um fio de cabelo21.</li>
		<li>Buscar grupos de seção de tocá-lo com uma fenda-grade nua, que é realizada por uma pinça e mantida paralelo à superfície da água (Figura 11 d). É importante para as seções tocar na grelha em primeiro lugar, não a água, colocar seções precisamente no centro da grade (Figura 11 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque as grelhas com seções juntamente com uma pequena gota de água sobre o Formvar suporte filme16 (Figura 12) e remover o excesso de água usando papel de filtro. Nota: Enrugamento do filme suporte é muitas vezes um problema quando seções são captadas usando uma grade com suporte de filme, porque a membrana (seções) toca a membrana (filme de apoio) diretamente. O problema de ficar com rugas no filme de apoio é significativamente reduzido, colocando uma grade de seção-rolamento juntamente com uma pequena gota de água sobre o suporte de Formvar filme16.</li>
</ol>8. coloração de seções16,24 (Figura 13)
<ol><li>Após as seções são completamente seco, rasgar o filme de Formvar ao redor das redes e retire as grades as seções do rolamento.</li>
	<li>Definir as grades na ranhura do tubo coloração16 na ordem correta (Figura 13) e mancha seções com uranilo acetato e chumbo citrato24. Nota: Há um sulco de 0,6 mm de profundidade ao longo do eixo do tubo de corte com uma lâmina de barbear. O tubo é útil para impedir a quebra acidental de suporte filmes quando usando uma pinça, uma vez que a manipulação direta de grades não é necessária durante o processo de coloração e lavagem16.</li>
</ol>9. observação das seções seriais (Figura 14)
<ol><li>Defina as 5 grades no porta-amostra multi na ordem correta (Figura 14a), orientando o eixo longo da grade fenda perpendicular ao eixo de suporte do espécime. As alças (setas) das grades não tem que ser cortado, porque os 'grade-fixadores' não tocará as alças.</li>
	<li>Fixar as grelhas com 'grade-fixadores' (Figura 14b) e introduza o suporte de amostra o microscópio eletrônico de transmissão. Nota: Muitas vezes é útil tomar baixa ampliação de imagens de todas as seções de célula (Figura 15) para achar interessante microorganismos ou células em bom estado com nenhuma contaminação e com boa fixação, antes de tirar fotos da célula alvo.</li>
	<li>Tire fotos das células alvo em todas as seções de célula em alta ampliação.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado aqui não requer nenhum equipamento caro. Requer apenas um rack de alumínio (Figura 3), grades de três-fenda (Figura 6C), seção-exploração loops (Figura 10a), loop de água de superfície-sensibilização (Figura 11a) e um tubo de coloração (Figura 13). Há muitas características do presente método. A grande parte da amostra é usada para ajustar a borda de su...

Técnica de corte apropriada serial ultrafino é indispensável para o estudo de células e componentes celulares tridimensionalmente em nível microscópico elétrons. Temos estudado a dinâmica do corpo de polo do eixo no ciclo celular de células de levedura e revelou alterações morfológicas da sua ultra-estrutura durante o ciclo celular e o tempo de duplicação1,2,3, 4,5. Em 2006, cunhou uma nova palavra 'structome' combinando 'estrutura' e '-ome' e definiu-o como o 'informações quantitativas e tridimensional estrutural de uma célula inteira em nível microscópico elétrons' 6,7.
Pela análise de structome, que requer técnica de seccionamento serial ultrafino, verificou-se que uma célula de levedura Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis tinha cerca de 200.000 ribossomos7,8, um Escherichia coli célula tinha 26.000 ribossomas9, uma célula de Mycobacterium tuberculosis tinha 1.700 ribossomas10 e bactérias de espiral Myojin tinham apenas 300 ribossomas11. Esta informação é útil na estimativa não somente a taxa de crescimento em cada organismo, mas também na identificação das espécies9.
Análises posteriores, structome levado à descoberta de um novo organismo; Parakaryon myojinensis foi encontrado no fundo do mar na costa do Japão, cuja estrutura de célula era um intermediário entre aqueles de procariotas e eucariotas12,13,14,15. Presentemente, técnica de corte ultrafino serial é considerada tão difícil que levaria muito tempo para dominar. Neste estudo, nós desenvolvemos um método confiável, no qual qualquer um pode executar seccionamento ultrafinos serial sem dificuldade.

<table><tbody><tr><td>Aparelho de fabricação de Formvar</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>652</td><td>L 180 x P 180 x A 300 mm</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Matsunami Co. Ltd.,</td> <td>Osaka-76</td> <td>x 26 x 1,3 mm</td></tr><tr><td>Rack de alumínio com furos de 4 mm</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>658</td><td>L 30 x P 25 x A 3 mm, Consulte este papel</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon Co. Ltd., Iluminação</td> LED <td>Tokyo-SMZ</td> <td>645</td></tr><tr><td>para estereomicroscópio</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo-SM-LW</td><td></td> <td>61 Ji</td></tr><tr><td>Estágio de corte</td><td>Sunmag Co.Ltd., Mecanismo</td> <td>de</td> <td>inclinação de Tóquio equipado, consulte este papel</td></tr><tr><td>Iluminação LED para estágio de corte</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tóquio-Consulte</td><td></td> <td>este papel</td></tr><tr><td>Lâmina de corte ultrassônica</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>5240</td><td>EM-240, Consulte este papel</td></tr><tr><td>Faca de diamante para aparar</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suíça-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Faca de diamante para corte ultrafino</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suíça-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems,</td><td></td> <td>Vienna-Ultracut S</td></tr><tr><td>Corte de mesa</td><td>Leica Microsystems, solução Vienna-Mirror</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5% Neoprene W</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Grade especial de níquel de 3 fendas</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>2458</td><td>Consulte este artigo</td></tr><tr><td>Grade especial de cobre de 3 fendas</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>2459</td><td>Consulte este artigo</td></tr><tr><td>Laço de retenção de seção</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>526</td><td>Consulte este artigo</td></tr><tr><td>Laço de elevação da superfície da água</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>527</td><td>Consulte este artigo</td></tr><tr><td>Tubo de coloração</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tóquio</td><td>463</td><td>Consulte este artigo</td></tr><tr><td>Suporte de várias amostras</td><td>JEOL Co. Ltd., Tóquio-EM-11170</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., microscópio</td> eletrônico <td>de</td> <td>transmissão</td> de Tóquio</tr></tbody></table>

um método para a obtenção de seções ultra-finas serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observação de células e componentes da célula em três dimensões em alta ampliação em microscopia eletrônica de transmissão exige a preparação de seções ultra-finas seriais do espécime. Ainda preparar seções ultra-finas seriais é considerado muito difícil, é bastante fácil... se for usado o método adequado. Neste trabalho, mostramos um procedimento passo a passo para a obtenção de segurança seriais seções ultra-finas de microorganismos. Os pontos-chave deste método são: 1) para usar a grande parte da amostra e ajustar a borda de superfície e faca de amostra, de modo que eles são paralelos uns aos outros; 2) para cortar seções seriais em grupos e evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda; 3) usar um 'loop' seção-exploração e evitar mistura-se a ordem dos grupos seção; 4) para usar um loop de' água de superfície-sensibilização' e certifique-se que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades; 5) para usar o suporte de filme em um rack de alumínio e torná-lo mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do filme suporte; e 6) para usar um tubo de coloração e evitar quebrar acidentalmente os filmes de apoio com uma pinça. Este novo método permite a obtenção de seções ultra-finas seriais sem dificuldade. O método torna possível analisar estruturas celulares dos microorganismos em alta resolução em 3D, que não pode ser alcançado usando o método de ultramicrotome de fita de coleta automática e bloco-rosto serial ou microscópio eletrônico de varredura de feixe de íon focalizado.

Neste protocolo, fenda três grades foram usados para pegar seriais seções. As grades são feitas de níquel ou cobre. As seções seriais são colocadas na ranhura do meio. As fendas em ambos os lados são necessárias para ver as seções quando pegá-los com a grade. Para manter as grades paralelas com as seções seriais quando pegá-los com uma pinça (Figura 11 d), o punho é dobrado (Figura 6C, direita). Uma pequena alça é vantajosa para ...

Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir cortes ultrfinos em série de forma segura e fácil. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da biologia celular, fornecendo informações estruturais tridimensionais e quantitativas de uma célula inteira ao nível microscópico eletrônico. A principal vantagem desta técnica é que o corte ultrafino em série pode ser realizado sem o uso de um equipamento caro, e imagens de alta resolução podem ser obtidas com este método.Para iniciar este procedimento, limpe a superfície de uma lâmina de vidro. Em seguida, mergulhe uma metade da lâmina de vidro na solução de Formvar 1,5% na coluna superior do aparelho para fabricação de filme de suporte de Formvar, pressionando a solução com ar através da torneira de três vias usando uma bola de borracha. Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar para reduzir a pressão.Em seguida, retire a lâmina de vidro do aparelho e seque ao ar para formar uma película na superfície da lâmina. Remova com uma lâmina de barbear as quatro bordas da película na lâmina de vidro. Após soprar sobre a lâmina para facilitar a separação da película da lâmina, solte a película mergulhando lentamente a lâmina de vidro na água em um ângulo horizontal baixo.Em seguida, recolha o filme de Formvar da água utilizando um suporte de alumínio com orifícios. Para aparar o bloco de espécime com uma lâmina de corte ultrassônica e uma lâmina de barbear sob um microscópio estereoscópico, primeiramente certifique-se de que há células na superfície do bloco observando a ponta do bloco com um microscópio óptico. Em seguida, fixe o bloco de espécime na mandríl e monte a mandríl em uma plataforma de corte.Reduza os blocos a um tamanho de 0,7 por 1,0 milímetro. Se a resina epóxi for muito dura, primeiro corte a caixa usando uma lâmina de corte ultrassônica, depois continue o corte do bloco com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção do corte.Para aparar o bloco de espécime com uma lâmina de diamante usando o micrótomo, coloque o porta-bloco de espécime no suporte de espécime do ultramicrótomo. Corte a superfície do bloco com uma lâmina de diamante para aplainamento. Posicione a borda da lâmina de diamante paralelamente à face do bloco de espécime e corte a quantidade mínima da superfície do espécime para não perder nenhum material.Corte a borda esquerda do bloco usando a faca de corte, girando o estágio da faca 30 graus para a esquerda. Essa borda tornar-se-á o lado superior da amostra no corte em série. Em seguida, corte a face do bloco a cerca de 100 micrômetros da borda esquerda do espécime, girando o estágio da faca 30 graus para a direita.Essa borda torna-se o lado inferior do espécime no corte seriado. Remova a lâmina de corte e gire o bloco do espécime 90 graus no sentido horário. Posicione uma lâmina para corte ultrafino na platina da lâmina.Ajuste a superfície do espécime e a borda da lâmina para que fiquem paralelas entre si, utilizando a parte maior da superfície do espécime. Em seguida, aplique fita no porta-bloco e no suporte do porta-bloco do micrótomo e corte a fita na borda. Retire o porta-bloco com o espécime do micrótomo e coloque-o sob o microscópio estereoscópico.Corte a parte maior do espécime com uma lâmina de barbear, deixando a parte fina da qual serão obtidas as seções seriadas. Torne os lados da seção adesivos aplicando cerca de um microlitro de solução de Neoprene a 0,5% com uma pipeta de Pasteur sobre o espécime a ser usado para o corte seriado. Em seguida, cubra completamente o espécime com a solução de Neoprene. Absorva imediatamente o excesso de solução de Neoprene com um pedaço de papel de filtro colocado próximo ao espécime.Em seguida, prepare três grades com fendas para coletar cortes seriados. Para isso, dobre o cabo das grades em 60 graus e trate as grades com solução de Neoprene 0,5%. Em seguida, torne as grades hidrofílicas por descarga de plasma.Coloque o porta-bloco com a amostra de volta no micrótomo na mesma posição, alinhando as partes com fita. Isso mantém a face do bloco e a borda da lâmina perfeitamente paralelas entre si. Em seguida, aproxime a lâmina da amostra.Após encher o barquinho da lâmina com água, cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para evitar correntes de ar. Inicie o corte do espécime com uma espessura de seção de 200 nanômetros. Após o primeiro corte ser realizado, ajuste a espessura da seção para 70 nanômetros.Quando o número de cortes seriados atingir 20, ajuste a espessura do corte para 10 nanômetros. Como o micrótomo não pode cortar seções com espessura de 10 nanômetros, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separam da borda da lâmina. Em seguida, ajuste a espessura do corte para 60 nanômetros.Isso produzirá seções de 70 nanômetros porque a máquina somará a espessura anterior de 10 nanômetros. Por fim, reajuste a espessura das seções para 70 nanômetros e continue cortando até obter seções com 1,8 milímetro de comprimento. Para coletar as seções seriadas, posicione primeiro o laço de sustentação das seções no terceiro grupo de seções.Em seguida, coloque o laço elevador da superfície da água na platina da faca. Posicione o laço do WSRL logo acima das seções seriadas movendo seu eixo e cabo. Abaixe o laço do WSRL até a superfície da água de modo que o laço circunde as seções.Empurre o laço para baixo girando o parafuso para baixo, de modo que a superfície da água seja elevada pela tensão superficial. Mova a seção para o centro do laço. Posicione-a no ápice da água e ajuste a direção da seção usando um fio de cabelo.Recolha grupos de seções tocando-os com uma grade de fenda nua, auxiliada por pinça e mantida paralela à superfície da água. Coloque as grades com as seções, juntamente com uma pequena gota de água, sobre a película de suporte de Formvar. Remova a água em excesso utilizando papel de filtro.Após as seções estarem completamente secas, rasgue o filme de Formvar ao redor das grades e remova as grades que contêm as seções. Coloque as grades no sulco do tubo de coloração em ordem adequada e cora as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo. Coloque cinco grades no portaespécimes multiprofusão em ordem correta, orientando o eixo longo da fenda da grade perpendicularmente ao eixo do portaespécimes.Fixe a grade com fixadores de grade e insira o porta-espécime no microscópio eletrônico de transmissão. Prossiga para tirar imagens das células-alvo e de todas as seções celulares em alta ampliação. É mostrada aqui uma vista de baixa ampliação de cinco grades que contêm seções seriadas.Foram montadas 18 a 25 seções em uma única grade. Observe que as seções estão unidas entre si e possuem a mesma espessura. Aqui são mostradas seções seriadas da miogênese do pericárion.A figura mostra 12 das 67 seções completas. Verificou-se que esta célula possui um nucleoide grande, composto por fibras de DNA nu, com uma única membrana nucleoide e endossimbiontes que se assemelham a bactérias, mas sem mitocôndrias. Assim, este organismo parece ser uma forma de vida intermediária em evolução do procarioto para o eucarioto.Mostradas aqui estão seções seriadas de Escherichia coli. A figura mostra 12 seções completas. Curiosamente, descobriu-se que esta célula contém 21.700 ribossomos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar cortes ultrfinos em série. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Fonte: Lutz, D., et.al.  Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero do cérebro e da medula espinhal de camundongos em desenvolvimento. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra a preparação e análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de uma seção do cérebro de um filhote de camundongo. O protocolo começa com tecido fixado em tetróxido de ósmio embebido em resina, seguido de corte preciso para isolar a região de interesse e ultramicrotomia...

Análise ultraestrutural de uma seção cerebral de camundongo usando microscopia eletrônica de transmissão

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras com baixo número de células para análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET).

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Este relatório descreve um protocolo de preparação de amostras e condições específicas de imagem para a realização de tomografia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes biológicos espessos.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

Aqui, nós fornecemos um, de baixo custo fácil, e protocolo de tempo-eficiente para corrigir quimicamente o tecido cerebral dos primatas com fixador acroleína, permitindo a preservação a longo prazo que seja compatível com imunohistoquímica pré-incorporação para microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Descrevemos a fixação, incorporação de parafina e técnicas de corte finas para biofilmes microbianos de colônia. Em amostras preparadas, padrões de expressão de subestrutura e repórter de biofilme podem ser visualizados por microscopia.

Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Aqui mostramos como usar o dispositivo de congelamento de sanduíches para congelamento rápido de espécimes biológicos, incluindo bactérias, leveduras, células cultivadas, células isoladas, tecidos animais e humanos e vírus. Também mostramos como preparar espécimes para seção ultrathin após congelamento rápido.

Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Este protocolo de vídeo ilustra como realizar a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes virológicos. Para obter os melhores resultados, as amostras são preparadas por congelamento de alta pressão e subsequente substituição por congelamento.

Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

Aprenda a obter seções ultra-finas seriadas de microrganismos para microscopia eletrônica de transmissão sem equipamentos caros. Este método acessível fornece informações estruturais tridimensionais de células inteiras.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

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