Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

O objetivo geral deste procedimento é produzir cortes ultrfinos em série de forma segura e fácil. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da biologia celular, fornecendo informações estruturais tridimensionais e quantitativas de uma célula inteira ao nível microscópico eletrônico. A principal vantagem desta técnica é que o corte ultrafino em série pode ser realizado sem o uso de um equipamento caro, e imagens de alta resolução podem ser obtidas com este método.

Para iniciar este procedimento, limpe a superfície de uma lâmina de vidro. Em seguida, mergulhe uma metade da lâmina de vidro na solução de Formvar 1,5% na coluna superior do aparelho para fabricação de filme de suporte de Formvar, pressionando a solução com ar através da torneira de três vias usando uma bola de borracha. Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar para reduzir a pressão.

Em seguida, retire a lâmina de vidro do aparelho e seque ao ar para formar uma película na superfície da lâmina. Remova com uma lâmina de barbear as quatro bordas da película na lâmina de vidro. Após soprar sobre a lâmina para facilitar a separação da película da lâmina, solte a película mergulhando lentamente a lâmina de vidro na água em um ângulo horizontal baixo.

Em seguida, recolha o filme de Formvar da água utilizando um suporte de alumínio com orifícios. Para aparar o bloco de espécime com uma lâmina de corte ultrassônica e uma lâmina de barbear sob um microscópio estereoscópico, primeiramente certifique-se de que há células na superfície do bloco observando a ponta do bloco com um microscópio óptico. Em seguida, fixe o bloco de espécime na mandríl e monte a mandríl em uma plataforma de corte.

Reduza os blocos a um tamanho de 0,7 por 1,0 milímetro. Se a resina epóxi for muito dura, primeiro corte a caixa usando uma lâmina de corte ultrassônica, depois continue o corte do bloco com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção do corte.

Para aparar o bloco de espécime com uma lâmina de diamante usando o micrótomo, coloque o porta-bloco de espécime no suporte de espécime do ultramicrótomo. Corte a superfície do bloco com uma lâmina de diamante para aplainamento. Posicione a borda da lâmina de diamante paralelamente à face do bloco de espécime e corte a quantidade mínima da superfície do espécime para não perder nenhum material.

Corte a borda esquerda do bloco usando a faca de corte, girando o estágio da faca 30 graus para a esquerda. Essa borda tornar-se-á o lado superior da amostra no corte em série. Em seguida, corte a face do bloco a cerca de 100 micrômetros da borda esquerda do espécime, girando o estágio da faca 30 graus para a direita.

Essa borda torna-se o lado inferior do espécime no corte seriado. Remova a lâmina de corte e gire o bloco do espécime 90 graus no sentido horário. Posicione uma lâmina para corte ultrafino na platina da lâmina.

Ajuste a superfície do espécime e a borda da lâmina para que fiquem paralelas entre si, utilizando a parte maior da superfície do espécime. Em seguida, aplique fita no porta-bloco e no suporte do porta-bloco do micrótomo e corte a fita na borda. Retire o porta-bloco com o espécime do micrótomo e coloque-o sob o microscópio estereoscópico.

Corte a parte maior do espécime com uma lâmina de barbear, deixando a parte fina da qual serão obtidas as seções seriadas. Torne os lados da seção adesivos aplicando cerca de um microlitro de solução de Neoprene a 0,5% com uma pipeta de Pasteur sobre o espécime a ser usado para o corte seriado. Em seguida, cubra completamente o espécime com a solução de Neoprene. Absorva imediatamente o excesso de solução de Neoprene com um pedaço de papel de filtro colocado próximo ao espécime.

Em seguida, prepare três grades com fendas para coletar cortes seriados. Para isso, dobre o cabo das grades em 60 graus e trate as grades com solução de Neoprene 0,5%. Em seguida, torne as grades hidrofílicas por descarga de plasma.

Coloque o porta-bloco com a amostra de volta no micrótomo na mesma posição, alinhando as partes com fita. Isso mantém a face do bloco e a borda da lâmina perfeitamente paralelas entre si. Em seguida, aproxime a lâmina da amostra.

Após encher o barquinho da lâmina com água, cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para evitar correntes de ar. Inicie o corte do espécime com uma espessura de seção de 200 nanômetros. Após o primeiro corte ser realizado, ajuste a espessura da seção para 70 nanômetros.

Quando o número de cortes seriados atingir 20, ajuste a espessura do corte para 10 nanômetros. Como o micrótomo não pode cortar seções com espessura de 10 nanômetros, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separam da borda da lâmina. Em seguida, ajuste a espessura do corte para 60 nanômetros.

Isso produzirá seções de 70 nanômetros porque a máquina somará a espessura anterior de 10 nanômetros. Por fim, reajuste a espessura das seções para 70 nanômetros e continue cortando até obter seções com 1,8 milímetro de comprimento. Para coletar as seções seriadas, posicione primeiro o laço de sustentação das seções no terceiro grupo de seções.

Em seguida, coloque o laço elevador da superfície da água na platina da faca. Posicione o laço do WSRL logo acima das seções seriadas movendo seu eixo e cabo. Abaixe o laço do WSRL até a superfície da água de modo que o laço circunde as seções.

Empurre o laço para baixo girando o parafuso para baixo, de modo que a superfície da água seja elevada pela tensão superficial. Mova a seção para o centro do laço. Posicione-a no ápice da água e ajuste a direção da seção usando um fio de cabelo.

Recolha grupos de seções tocando-os com uma grade de fenda nua, auxiliada por pinça e mantida paralela à superfície da água. Coloque as grades com as seções, juntamente com uma pequena gota de água, sobre a película de suporte de Formvar. Remova a água em excesso utilizando papel de filtro.

Após as seções estarem completamente secas, rasgue o filme de Formvar ao redor das grades e remova as grades que contêm as seções. Coloque as grades no sulco do tubo de coloração em ordem adequada e cora as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo. Coloque cinco grades no portaespécimes multiprofusão em ordem correta, orientando o eixo longo da fenda da grade perpendicularmente ao eixo do portaespécimes.

Fixe a grade com fixadores de grade e insira o porta-espécime no microscópio eletrônico de transmissão. Prossiga para tirar imagens das células-alvo e de todas as seções celulares em alta ampliação. É mostrada aqui uma vista de baixa ampliação de cinco grades que contêm seções seriadas.

Foram montadas 18 a 25 seções em uma única grade. Observe que as seções estão unidas entre si e possuem a mesma espessura. Aqui são mostradas seções seriadas da miogênese do pericárion.

A figura mostra 12 das 67 seções completas. Verificou-se que esta célula possui um nucleoide grande, composto por fibras de DNA nu, com uma única membrana nucleoide e endossimbiontes que se assemelham a bactérias, mas sem mitocôndrias. Assim, este organismo parece ser uma forma de vida intermediária em evolução do procarioto para o eucarioto.

Mostradas aqui estão seções seriadas de Escherichia coli. A figura mostra 12 seções completas. Curiosamente, descobriu-se que esta célula contém 21.700 ribossomos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar cortes ultrfinos em série. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.