Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

O objetivo geral deste procedimento é fazer seções ultrafinas em série com segurança e facilidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, fornecendo informações estruturais quantitativas e tridimensionais de uma célula inteira no nível microscópico eletrônico. A principal vantagem dessa técnica é que o seccionamento ultrafino em série pode ser feito sem uma máquina cara, e imagens de alta resolução podem ser obtidas com esse método.

Para iniciar este procedimento, limpe a superfície de uma lâmina de vidro. Em seguida, mergulhe metade da lâmina de vidro em solução Formvar a 1,5% na coluna superior do aparelho de filmagem de suporte Formvar, pressionando a solução com ar através da torneira de três vias usando uma bola de borracha. Drenar a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e libertando ar para reduzir a pressão.

Em seguida, retire a lâmina de vidro do aparelho e seque ao ar para formar uma película na superfície da lâmina de vidro. Raspe as quatro bordas do filme na lâmina de vidro com uma lâmina de barbear. Depois de respirar na lâmina para facilitar a separação do filme da lâmina, flutue para fora do filme mergulhando a lâmina de vidro na água lentamente em um ângulo horizontal baixo.

Em seguida, retire o filme Formvar da água usando uma prateleira de alumínio com orifícios. Para aparar o bloco de amostras com uma lâmina de corte ultrassônica e uma lâmina de barbear sob um microscópio estéreo, primeiro certifique-se de que haja células na superfície do bloco, observando a ponta do bloco com um microscópio de luz. Em seguida, monte o bloco de amostra no mandril e monte o mandril em um estágio de corte.

Apare os blocos para um tamanho de 0,7 por 1,0 milímetros. Se a resina epóxi for muito dura, apare a caixa primeiro usando uma lâmina de corte ultrassônica e, em seguida, apare ainda mais o bloco com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção do corte.

Para aparar o bloco de amostra com uma faca de diamante usando o micrótomo, coloque o mandril do bloco de amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo. Corte a superfície do bloco com uma faca de corte de diamante. Defina a borda da faca de diamante paralela à face do bloco da amostra e corte a quantidade mínima de superfície da amostra para não perder nenhuma amostra.

Corte a borda esquerda do bloco usando a faca de corte, girando o estágio da faca 30 graus para a esquerda. Esta aresta se torna o lado superior da amostra no seccionamento serial. Em seguida, corte a face do bloco a cerca de 100 mícrons da borda esquerda da amostra, girando o estágio da faca 30 graus para a direita.

Esta aresta torna-se o lado inferior da amostra no corte em série. Remova a faca de corte e gire o bloco de amostra 90 graus no sentido horário. Defina uma faca de corte ultrafina para o estágio da faca.

Ajuste a superfície da amostra e o fio da faca para que fiquem paralelos um ao outro usando a grande parte da superfície da amostra. Em seguida, aplique fita adesiva no mandril e no suporte do micrótomo e corte a fita no limite. Retire o mandril de amostra do micrótomo e coloque-o sob o microscópio estéreo.

Corte a grande parte da amostra com uma lâmina de barbear, deixando a parte fina da qual as seções seriais serão obtidas: Faça as laterais da seção adesivas usando uma pipeta Pasteur para colocar cerca de um microlitro de 0,5% de solução de neoprene na amostra a ser usada para seccionamento seriado. Em seguida, cubra toda a amostra com solução de neoprene. Absorva o excesso de solução de neoprene imediatamente com um pedaço de papel de filtro colocado perto da amostra.

Em seguida, prepare três grades de fenda para pegar seções seriais. Para fazer isso, dobre a alça das grades a 60 graus e trate as grades com solução de neoprene a 0,5%. Em seguida, faça as grades hidrofílicas por descarga luminescente.

Coloque o mandril do bloco de amostra de volta no micrótomo na mesma posição, alinhando as peças com fita adesiva. Isso mantém a face do bloco e o fio da faca perfeitamente paralelos entre si. Em seguida, aproxime a faca da amostra.

Depois de encher o barco da faca com água, cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para evitar o fluxo de ar. Comece a cortar a amostra com uma espessura de seção de 200 nanômetros. Depois que a primeira seção for cortada, defina a espessura da seção para 70 nanômetros.

Quando o número de seções seriais atingir 20, defina a espessura da seção para 10 nanômetros. Como o micrótomo não pode cortar seções de 10 nanômetros de espessura, nenhuma nova seção aparece e as seções cortadas anteriormente se separam do fio da navalha. Em seguida, defina a espessura da seção para 60 nanômetros.

Isso produzirá seções de 70 nanômetros porque a máquina adicionará a espessura anterior de 10 nanômetros. Por fim, ajuste a espessura da seção de volta para 70 nanômetros e continue cortando até que seções de 1,8 milímetros de comprimento sejam obtidas. Para pegar as seções seriais, primeiro coloque o laço de retenção de seção no terceiro grupo de seções.

Em seguida, coloque o laço de elevação da superfície da água no estágio da faca. Coloque o laço do WSRL logo acima das seções seriais, movendo seu eixo e alça. Abaixe o laço do WSRL na superfície da água para que o laço circunde as seções.

Empurre o laço para baixo girando o parafuso para baixo para que a superfície da água seja elevada pela tensão superficial. Mova a seção para o centro do loop. Posicione-o no ápice da água e ajuste a direção da mecha usando um fio de cabelo.

Pegue os grupos de seções tocando-os com uma grade de fenda nua, que é auxiliada por uma pinça e mantida paralela à superfície da água. Coloque as grades com seções junto com uma pequena gota de água no filme de suporte Formvar. Remova o excesso de água usando papel de filtro.

Depois que as seções estiverem completamente secas, rasgue o filme Formvar ao redor das grades; e remova as grades com as seções. Coloque as grades na ranhura do tubo de coloração na ordem correta e pinte as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo. Defina as cinco grades no suporte de amostra múltipla na ordem correta, orientando o eixo longo da fenda da grade perpendicularmente ao eixo do suporte de amostra.

Fixe a grade com fixadores de grade e insira o suporte da amostra no microscópio eletrônico de transmissão. Prossiga para tirar fotos das células-alvo e de todas as seções celulares em alta ampliação. Aqui é mostrada uma visão de baixa ampliação de cinco grades que carregam seções seriais.

18-25 seções foram montadas em uma grade. Observe que as seções são unidas e têm a mesma espessura. Seções seriadas da miogênese pericariônica são mostradas aqui.

A figura mostra 12 de 67 seções completas. Descobriu-se que esta célula tinha um grande nucleóide que consistia em fibras de DNA nuas com uma única membrana nucleóide e endossimbiontes que se assemelham a bactérias, mas não a mitocôndrias. Assim, este organismo parece ser uma forma de vida intermediária evoluindo de procarionte para eucarioto.

Aqui são mostradas seções seriadas de Escherichia coli. A figura mostra 12 seções completas. Curiosamente, descobriu-se que esta célula contém 21.700 ribossomos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer seções ultrafinas em série. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente.