Name: Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a visualizar a dinâmica mitocondrial em oligodendrócitos usando fatias organotípicas de cérebro e microscopia confocal. Este método permite estudar respostas celulares em ambiente nativo.

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Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås para acesso à célula de laboratório e equipamentos, pessoal de Janelia Biologia Molecular compartilhada recursos para a produção de vírus e do plasmídeo e Koen Vervaeke para obter assistência com medições de potência do laser. Este trabalho foi financiado pela Associação Norueguesa de saúde, Conselho Norueguês de pesquisa e os equipamentos de microscopia foi financiado pelo Norbrain.

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

O protocolo para fazer culturas de organotypic descritas aqui é uma versão modificada de18 do protocolo descrito por De Simoni e Yu (2006)5. As mudanças mais importantes foram esboçadas abaixo. Tampão Tris é adicionado ao meio de cultura, o que melhora a sobrevivência das fatias quando fora da incubadora durante a transdução viral e mudança do meio de célula. O procedimento de esterilização para confetti também mudou. Enquanto outros protocolos esterilize confetti em autocl...

Matéria de branco do cérebro é composta de axônios de células nervosas envolvidos em mielina, uma membrana de plasma estendida especializada formada pelos oligodendrócitos. Mielina é necessária para a propagação do potencial de ação rápida e confiável e sobrevivência a longo prazo dos dendritos, e uma perda de mielina pode causar disfunção neurológica. Apesar de sua importância, as propriedades de oligodendrócitos são menos conhecidas em comparação com os neurônios e astrócitos. Consequentemente, menos ferramentas foram desenvolvidas para estudar oligodendrócitos.
Viva de imagem das organelas celulares como mitocôndrias, retículo endoplasmatic (ER) ou diferentes estruturas vesiculares podem ser útil para estudar as mudanças dinâmicas nas organelas ao longo do tempo. Tradicionalmente, imagem latente de oligodendrócitos vivos foi realizada em monoculturas1,2. No entanto, oligodendrócitos em monocultura não exibir o compacto de mielina, e organotypic ou fatias de cérebro aguda podem, portanto, ser uma opção melhor, ao estudar o movimento de organelas e localização. Localização de pequenas organelas e proteínas na bainha de mielina pode ser desafiador devido à curta distância entre o dendritos axônio e a bainha de mielina circundante. Assim, procedimentos de imunocoloração microscópica luz sozinho não têm a resolução espacial para discriminar entre organelas na bainha de mielina e os dendritos axônio. Isso pode ser resolvido por transdução viral com genes para proteínas fluorescentes organela-alvo conduzidos pelos promotores de tipo específico de célula. As vantagens são uma expressão de célula específica e esparsa, que permite a avaliação precisa da localização da organela e dinâmica. Animais transgénicos também podem ser usados para atingir uma organela-alvo específicos de célula expressão3. No entanto, a produção e a manutenção de animais transgénicos é caros e geralmente não oferece a expressão esparsa que pode ser alcançada por métodos virais.
O método descrito aqui usa transdução viral de oligodendrócitos com proteínas fluorescentes mitocondrial-alvo (dsred ou verde proteína fluorescente, GFP) conduzido pelo promotor de proteína básica da mielina (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) para Visualizar mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro. Além disso, a expressão de uma outra proteína fluorescente no citoplasma (GFP usado junto com o mito-dsred ou tdtomato usado com mito-GFP) é usado para permitir a visualização da morfologia celular, incluindo os compartimentos citoplasmáticos da bainha de mielina. O protocolo inclui o procedimento para fazer fatias de cérebro de organotypic (uma versão modificada do protocolo descrito por De Simoni, Yu, 2006,4,5). Em seguida, descrevemos o procedimento da imagem latente lapso de tempo para estudar o movimento mitocondrial. Este procedimento usa um microscópio confocal ereto com uma troca contínua do meio da imagem latente, uma configuração que permite fácil aplicação de drogas ou outras alterações médias durante a imagem latente. O procedimento da imagem latente lapso de tempo pode ser executado em qualquer microscópio confocal, com algum equipamento extra para manter vivas as fatias conforme descrito abaixo. O protocolo também contém várias dicas para otimizar imagens e reduzir a fototoxicidade.
Por último, uma maneira rápida e simples para visualizar a mielina imaculada pela microscopia Confocal reflectância (núcleo) é descrita. Isso pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido desenvolvidas para mielina imagem sem qualquer coloração necessária, mas a maioria destes requerem específico equipamento e conhecimentos6,7,8. O procedimento descrito aqui usa as propriedades reflexivas da bainha de mielina e é uma versão simplificada de comprimento de onda único-excitação de microscopia de reflectância espectral de Confocal (Pontuação, no qual vários comprimentos de onda de laser é combinadas para visualizar mielina) 9. núcleo pode ser feito em qualquer microscópio confocal que tem um laser de 488 nm e um filtro de emissão 470-500 nm bandpass ou um filtro de emissão ajustável.

<table><tbody><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Agulhas usadas para entrada e saída de gás</td></tr><tr><td>bioóxido</td> de banho Lâmpadas de pipeta da <td>marca AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr>Lâmpadas de pipeta<td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>Queimador de</td></tr><tr><td>Bunsen (queimador de propano líquido)</td> <td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de cabos para controladores de aquecedor</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106</td><td>Controlador de temperatura - parte do termômetro</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 para incubadora</td></tr><tr><td>Tampa de vidro, quadrada Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>Para anexar sob o banho para imagens ao vivo. Sele com cola ou vaselina.</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Delicada</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Para dissecação</td></tr><tr><td>Caneta Diamond scriber</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro descartáveis Pasteur 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Pipetas de vidro</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de aço inoxidável de borda dupla</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#7200</td><td>Lâmina de barbear para vibratomo</td></tr><tr><td>Solução salina equilibrada de Earle (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Círculos de papel de filtro</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300,220</td><td>Papel de filtro usado para filtração de PFA</td></tr><tr><td>Fun tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>Use para conectar/ajustar a posição de entrada e saída no banho</td></tr><tr><td>Toalha de mão C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, Plana para Câmara RC-41,</td> <td>Warner Instruments</td><td>&nbsp; 64-1418</td><td>Harpa para segurar confetes no banho. Corte os fios antes de usar com fatias organotípicas. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, Modelo 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Capuz de fluxo laminar</td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado por calor</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR Membrane, PTFE,&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>Confete&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax com HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro Colher Microscopia Heyman Tipo B</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>62411-B</td><td>Espátula pequena e arredondada com extremidade afiada para dissecção</td></tr><tr><td>Unidade de filtro Millex-GP</td> Unidade de filtro <td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>Seringa Inserção</td></tr> de <tr><td>cultura de células Millicell, 30 mm</td><td>Inserções</td><td>de cultura de</td><td>células</td>PICM03050 Millipore</tr><tr><td>Minipuls 3 Módulo de controle de velocidade</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte do módulo de controle (conecte ao cabeçote de dois canais)</td></tr> <tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta</td><td>Surface Thermo&nbsp; Placa</td><td>de</td><td>Cultura</td>140675 Fischer Scientific</tr><tr><td>Suspensão de Nistatina</td><td>Objetivo Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>Objetiva de imersão em água usada para imagens ao vivo. (WD=2.5mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, granular</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de perfusão PC-R</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp; 15280000E</td><td>Banho para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Placa de Petri Grande&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri 92x16 mm&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>Placa de Petri média&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td> <td>pequena de 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado com solução salina (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>comprimidos R2 Cabeça de dois canais&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte da cabeça de dois canais (requer módulo de controle)</td></tr><tr><td>Espátulas redondas/planas, aço inoxidável</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Espátula grande para dissecção</td></tr><tr><td>Papel de areia</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>Opcional, para alisar pipetas de vidro quebrado</td></tr><tr><td>Tesoura,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Tesoura grande para dissecção</td></tr><tr><td>Tesoura, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Tesoura pequena e afiada para dissecação</td></tr><tr><td>Lâmina de gema de borda única</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#71972</td><td>Lâmina de barbear de borda única</td></tr><tr><td>Aquecedor de solução única em linha SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102 Controlador de</td><td>temperatura - peça do aquecedor</td></tr><tr><td>Unidade de filtro Steritop-GP, 500 ml, 45mm</td> Filtro <td>de SCGPT05RE</td><td>Millipore</td><td>para esterilizar soluções</td></tr><tr><td>Super cola de precisão</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de bisturi cirúrgico nº 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td>Controlador de temperatura <td>de lâmina de bisturi arredondado</td> <td>209</td></tr><tr><td>TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100</td><td>Controlador de temperatura para imagens ao vivo (requer aquecedor de solução e montagem de cabos)</td></tr> <tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>incubadora jacketed água série II</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>incubadora</td></tr></tbody></table>

visualização e imagem ao vivo do oligodendrocyte organelas em fatias organotypic cérebro usando microscopia confocal e vírus adeno-associado

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Os neurônios dependem a isolação elétrica e suporte trófico de oligodendrócitos microambiental. Apesar da importância de oligodendrócitos, as ferramentas avançadas atualmente utilizadas para estudar os neurônios, apenas parcialmente foram tomadas por pesquisadores do oligodendrocyte. Células específicas do tipo de coloração por transdução viral é uma abordagem útil para estudar a dinâmica de organela ao vivo. Este artigo descreve um protocolo para a visualização de mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro por transdução com vírus adeno-associado (AAV), carregando genes mitochondrial proteínas fluorescentes alvo sob o controle transcricional de o promotor de proteína básica da mielina. Inclui o protocolo para fazer organotypic fatias de cérebro de rato coronal. Segue um procedimento para Time-Lapse de imagem de mitocôndrias em seguida. Esses métodos podem ser transferidos para outras organelas e podem ser particularmente útil para estudar organelas na bainha de mielina. Finalmente, descrevemos uma técnica prontamente disponível para visualização de mielina Imaculada em fatias vivos pela microscopia Confocal reflectância (núcleo). Núcleo não requer nenhum equipamento extra e pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo.

Organotypic fatias de cérebro que foram cultivadas e transfectadas conforme descrito acima mostraram uma distribuição esparsa de oligodendrócitos corticais expressando mito_dsred e GFP. Imunocoloração com anticorpos contra Olig2 e MBP confirmou que a expressão era específica de oligodendrócitos (Figura 1).
Para geração de imagens ao vivo, oligodendrócitos transduzidos foram reconhecidos por sua morf...

Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

O objetivo geral desta transdução viral e gravação com lapso de tempo é visualizar o movimento das mitocôndrias de oligodendrócitos em fatias cerebrais organotípicas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área dos oligodendrócitos, como a forma como os oligodendrócitos e seus organelos respondem a alterações no ambiente local. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece informações detalhadas sobre a estrutura dos oligodendrócitos e a dinâmica dos organelos em uma preparação onde todas as diferentes células cerebrais estão presentes e os oligodendrócitos produzem mielina compacta. Transduza os oligodendrócitos em culturas de fatias no sétimo dia in vitro. Primeiro, aspire 1,3 microlitros de AAV diluído por fatia. Certificando-se de que o exterior da ponteira da pipeta esteja seco, segure a pipeta acima da córtex o mais próximo possível, sem tocar a fatia com a ponteira, e empurre lentamente a solução para fora da pipeta. Quando a solução tocar a fatia, mova a ponteira da pipeta sobre a córtex para espalhar a solução por toda a área cortical. Depois que todas as fatias em um único recipiente tiverem sido transduzidas, devolva o recipiente ao incubador e rep

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualização e imagem ao vivo de organelas de oligodendrócitos em fatias cerebrais organotípicas usando vírus adeno-associado e microscopia confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a imagem de mitocôndrias de oligodendrócitos em fatias de cérebro de camundongos organotípicos. A fatia é colocada dentro de uma câmara de banho com circulação contínua de fluido e temperatura controlada. Depois de configurar vários parâmetros do microscópio confocal, imagens...

Imagem confocal do movimento mitocondrial dentro de oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias cerebrais

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizando a morfologia dos astrócitos usando a iontoforese amarela de Lúcifer. J. Vis. Exp. (2019).  Este vídeo demonstra o uso de iontoforese de corante fluorescente para estudar a morfologia de astrócitos em fatias fixas de cérebro. Ele detalha a perfuração do soma do astrócito com um eletrodo para fornecer um corante aniônico e hidrofílico no citoplasma sob uma corrente de baixa voltagem, permitindo que o corante se difunda e rotule o soma e os ramos. A...

Visualizando a morfologia dos astrócitos usando iontoforese de corante fluorescente em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Para abordar mecanismos de desmielinização e apoptose neuronal em lesões corticais de distúrbios inflamatórios desmielinizantes, diferentes modelos animais são usados. Descrevemos aqui uma abordagem ex vivo usando células T CD8+ específicas de oligodendrócitos em fatias cerebrais, resultando em morte oligodendroglial e neuronal. Aplicações potenciais e limitações do modelo são discutidas.

Um Ex vivo Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Aprenda a visualizar a dinâmica mitocondrial em oligodendrócitos usando fatias organotípicas de cérebro e microscopia confocal. Este método permite estudar respostas celulares em ambiente nativo.

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

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