Name: Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a usar microscopia de super-resolução GSD para visualizar proteínas de membrana em células de mamíferos fixadas. Este método oferece resolução dez vezes superior à microscopia confocal convencional.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão da AHA a R.E.D (15SDG25560035). Autores gostaria de reconhecer o Dr. Fernando Santana para uso do microscópio Leica SR GSD 3D e Dr. Johannes Hell para gentilmente fornecendo o anticorpo FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.

A recente explosão de tecnologias que permitem a geração de imagens para além do limite de difração ofereceram novas janelas para as complexidades da pilha mamífera sinalização no espaço e no tempo. Essas tecnologias incluem tempestade, STED, PALM, GSD, SIM e suas variantes (por exemplo, dSTORM, FPALM). A engenhosidade dos cientistas por trás destas técnicas permitiu-nos contornar as limitações impostas pelas leis da física que regem a difração de luz. Apesar desta grande realização, cada uma destas técnicas faz...

Reações de sinalização celulares traduzem mudando ambientes internos e externos para iniciar uma resposta celular. Eles regulam todos os aspectos da fisiologia humana, servindo como base para o hormônio e liberação de neurotransmissores, o batimento cardíaco, visão, fertilização e função cognitiva. Interrupção destas cascatas de sinalização pode ter consequências graves na forma das condições fisiopatológicas, incluindo a doença de Alzheimer, Parkinson e câncer. Durante décadas, biológicos e médicos investigadores usaram com sucesso proteínas fluorescentes, sondas e biosensores juntamente com microscopia de fluorescência, como as principais ferramentas para compreender a organização espacial e temporal precisa desses celulares sinais.
Os pontos fortes de técnicas ópticas como epifluorescência, confocal, ou microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total são sua sensibilidade, velocidade e compatibilidade com imagens de células vivas, enquanto a principal limitação é a sua resolução de difração limitada, estruturas de significado ou complexos de proteínas menores que 200-250 nm não podem ser resolvidos. Com o desenvolvimento teórico e prático de super-resolução determinístico (estruturado, por exemplo, emissão estimulada depleção microscopia (STED1), microscopia de iluminação (SIM2) ou estocástica Super-resolução (por exemplo, , fotoativados localização microscopia (PALM3), ou estado fundamental depleção (GSD4,5)), resolução axial e lateral em microscopia de fluorescência foi estendida para além da barreira de difração, a ordem de dezenas de nanômetros. Assim, os investigadores agora têm a capacidade incomparável de Visualizar e compreender como a organização e dinâmica da proteína se traduz em função ao nível molecular perto.
Microscopia de depleção estado fundamental individual molécula de retorno (GSDIM), ou simplesmente GSD como é conhecido, contorna o limite de difração, reduzindo o número de simultaneamente emitindo fluorophores4,5. Luz de laser de alta energia é usada para excitar a amostra com rótulo fluoróforo, bombardeando elétrons com fótons e aumentando a probabilidade de eles passam por um 'spin-flip' e insira o triplet ou 'escuro ' estado do estado excitado4. Isso efetivamente esgota o estado da terra, daí o nome 'terrestres depleção do estado'. No estado triplete, fluorophores não emitem fótons e a amostra aparece mais não ofuscante. No entanto, estes fluorophores estocàstica retornar para o estado do solo e pode passar por vários fótons emitindo as transições de estado excitado-terra antes de retornar ao estado tripleto. Com menos fluorophores emitindo em um determinado momento, rajadas de fótons emitidos a partir fluorophores individuais tornam-se espacial e temporalmente distintas das vizinhas fluorophores. A explosão de fótons pode ser cabido com uma função gaussiana, o centroide calculado que corresponde à posição do fluoróforo com uma precisão de localização que é dependente da abertura numérica (NA) da lente, o comprimento de onda da luz usada para excitação e crucialmente, o número de fótons emitidos por fluoróforo. Uma limitação do GSD é que, uma vez que apenas um subconjunto de fluorophores ativamente emite a qualquer momento, milhares de imagens devem ser recolhidas ao longo de vários minutos para construir um mapa de localização completa. O tempo de aquisição tempo combinado com a exigência de laser de alta potência, significa que a GSD é mais adequado para fixo ao invés de amostras vivas.
Neste artigo, descreve a preparação de amostras fixas para imagem de microscopia de super-resolução de membrana e o retículo endoplasmático (ER)-proteínas residentes (para uma lista de reagentes ver a Tabela de materiaise consumíveis necessários). Exemplos de como este protocolo pode ser facilmente adaptado para quantificar o tamanho e o grau de agrupamento do tipo L voltagem Ca2 + canais (Cav1.2) no sarcolema dos miócitos, ou usado para visualizar a distribuição celular de emergência, são demonstradas. Compreender a distribuição e a organização desses componentes celulares é criticamente importante na compreensão da iniciação, tradução e, finalmente, a função de muitos Ca2 +-dependentes cascatas de sinalização. Por exemplo, canais de Cav1.2 são fundamentalmente importantes para a excitação-contração, acoplamento, enquanto mediada Ca2 + lançamento da emergência é talvez a mais ubíqua cascata de sinalização em células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Para limpar a lamínula</td></tr> <tr><td>#1.5 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Para células de crescimento/processo/imagem</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Diluir para 1x com água desionizada</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Auxilia na adesão celular à laminina</td></tr> <tr><td></td><td>de vidro de coberturaSigma</td><td>114956-81-9</td><td>Auxilia na adesão celular ao vidro de cobertura</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Meios de cultura de miócitos ventriculares</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Meios de cultura celular</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Suplemento de mídia</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Mídia suplemento</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Solução de cultura celular</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente de transfecção transitória</td></tr><tr><td>Ca2+-livre PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Fixação de células</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Elétron Microscopia Sciences</td><td>15710</td><td>Fixação Celular</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Fixação Celular</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA ou outras alternativas de solução de bloqueio existem</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergente para permeabilizar células</td></tr><tr><td>Coelho anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Presente</td><td>N/A</td><td>Existem anticorpos anti-CaV1.2 comerciais, como Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Previne o crescimento microbiano para armazenamento a longo prazo de amostras</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>cloridrato de beta-mercaptoetilamina</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr> <tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td></td><td>Fisher D14-212</td><td>Ingrediente tampão de fotocomutação</td></tr><tr><td>Depressão de vidro slides</td><td>Neolab</td><td>1 - 6293</td><td>Para montar amostras</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Para selar a lamínula</td></tr><tr><td>sec61&beta; - plasmídeo mCherry</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD microscópio 3D</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de bloco de lavagem <td>20 % SEAblock em PBS</td></tr><tr><td>Solução de incubação</td><td></td><td></td> de anticorpos primários <td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, em PBS</td></tr><tr><td>Solução de incubação</td><td></td><td></td> <td>de anticorpos secundários1:1000 em PBS</td></tr></tbody></table>

estado fundamental depleção super-resolução imaging em células de mamíferos

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Avanços na fluorescente microscopia e biologia celular são intimamente correlacionados, com a maior capacidade de Visualizar eventos celulares, muitas vezes levando a saltos dramáticos na nossa compreensão de como as células função. O desenvolvimento e a disponibilidade de microscopia de super-resolução ampliou consideravelmente os limites de resolução óptica de ~ 250-20 nm. Os biólogos não estão mais limitados para descrever interações moleculares em termos de colocalization dentro de uma área de difração limitada, prefiro agora é possível visualizar as interações dinâmicas de moléculas individuais. Aqui, nós esboçamos um protocolo para a visualização e a quantificação de proteínas celulares por microscopia de depleção do estado fundamental para a imagem latente de celular fixo. Nós fornecemos exemplos de duas proteínas de membrana diferentes, um elemento de um membrana plasmática-localizada voltagem-dependente tipo L Ca2 + canal (CaV1.2), o retículo endoplasmático translocon e sec61β. Discutidos são os parâmetros específicos do microscópio, métodos de fixação, foto-interruptor formulação da reserva e armadilhas e desafios de processamento de imagem.

Conforme documentado na introdução, há muitos microscopia de super-resolução diferentes modalidades de imagem. Este protocolo, centra-se na imagem de super-resolução GSD. Imagens representativas e mapas de localização são mostrados na Figura 2 e Figura 3.
A Figura 2 mostra uma célula de COS-7 transfectada com o ER proteína, mCherry-Sec61β e...

Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

O objetivo geral dessa técnica de imagem fluorescente é visualizar e quantificar proteínas celulares em células fixadas com resolução subdifracional, utilizando uma forma de microscopia de super-resolução denominada microscopia de esgotamento do estado fundamental e retorno de molécula individual. Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular e biofísica de membranas, pois contorna a limitação da resolução por difração, permitindo aos pesquisadores definir, visualizar e quantificar com maior precisão a distribuição de proteínas celulares. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite a aquisição de imagens com uma melhoria aproximada de dez vezes na resolução em comparação com abordagens convencionais de microscopia fluorescente, como a microscopia confocal.Realizarão o procedimento Oscar Vivas, pós-doutorando no meu laboratório, e Karen Hannigan, pós-doutoranda no laboratório de Rose Dixon. Para começar, prepare as lamínulas e as células conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, fixe as amostras e realize a imunocitoquímica para marcar a membrana plasmática e/ou as proteínas de membrana intracelulares de interesse.Em seguida, prepare a solução escavengadora de oxigênio Glock adicionando primeiro 12,5 microlitros de uma solução estoque de catalase, 3,5 miligramas de glicose oxidase e 0,5 microlitros de Tris 1 molar a 49,5 microlitros de PBS em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Feche o tubo e vortexe brevemente para dissolver os componentes. Em seguida, centrifugue a solução por três minutos.Agora, prepare a solução de tiol para indução de comutação fotônica dissolvendo a solução de beta-mercaptoetilamina em PBS até uma concentração de 100 milimolares e ajuste o pH para 8,0. Aliquote e armazene a solução de tiol no congelador por até uma semana. Imediatamente antes da aquisição de imagens, misture os componentes de tiol e de eliminação de oxigênio com um tampão salino e mantenha a solução em gelo.Usando 100 microlitros do tampão de comutação fotônica preparado, monte lamínulas contendo células coradas em lâminas com depressão. Em seguida, selar as bordas da lamínula com cola de silicone para evitar a oxidação rápida do tampão de imagem. Aguarde alguns minutos até que a cola de silicone tenha curado completamente, antes da aquisição de imagens.Caso contrário, a lamínula irá deslizar. Para começar, selecione um laser apropriado para iluminar a amostra, com base no fluoróforo escolhido. Para um fluoróforo Alexa 647, utilize um laser de 642 nanômetros.Em seguida, escolha o cubo de imagem dicróico e a lente objetiva apropriados. Abra o software de imagem. Selecione o modo de aquisição 2D e defina o tempo de exposição em 11 milissegundos.Além disso, ajuste o Ganho EM para 300 e selecione um limiar de detecção apropriado. Em seguida, ative o Controle Automático de Eventos e defina o número de Eventos por Imagem como oito. Insira o Tamanho do Pixel como 20 nanômetros.No separador Ferramentas GSD, vá até as opções de Cálculo de Imagem de Alta Resolução e certifique-se de que o Modo de Histograma está selecionado. Para imagens de proteínas na membrana plasmática, selecione o modo TIRF e modifique o ângulo de incidência para determinar a profundidade de penetração. Em seguida, ajuste a intensidade do laser para 100% a fim de enviar elétrons para o estado escuro.Em seguida, selecione Detecção de Molécula Única durante a perfusão e configure para aquisição automática quando a correlação de quadros for 0,20. Para a aquisição, ajuste a intensidade do laser para 50% e o número de quadros de aquisição para 60.000. Então, inicie a captura de imagens.Para quantificar o tamanho do aglomerado de proteínas, abra o arquivo de imagem de um mapa de localização de molécula única com histograma de 10 nanômetros no ImageJ. No menu Imagem, vá até Ajustar e use a opção Automático para otimizar o brilho e o contraste da imagem. Em seguida, no menu Tipo, escolha 8 bits.Em seguida, abra o menu Analisar, clique em Definir Escala e insira os valores mostrados aqui. Depois, no menu Analisar, selecione Definir Medidas e marque a caixa ao lado da opção Área. Volte ao menu Imagem, selecione Ajustar, Limiar e, em seguida, selecione Acima/Abaixo.Mova o valor máximo para 255, o valor mínimo para um e clique em Aplicar. Por fim, abra o menu Analisar e selecione Analisar Partículas. Marque a caixa para selecionar unidades de pixel, exibir resultados e resumir.Em seguida, defina o tamanho de quatro a infinito, selecione a opção Contornos Simples e clique em OK. A célula aqui imagem foi transfectada com a proteína do retículo endoplasmatico, mCherry-Sec61 beta, e imagem usando microscopia TIRF sem limite de difração e microscopia de super-resolução GSD em modo TIRF. Essas curvas representam o diâmetro dos túbulos do retículo endoplasmático. A imagem à direita mostra uma melhoria na resolução lateral e representa uma representação mais precisa da estrutura dos túbulos do retículo endoplasmático.A melhoria na resolução oferecida pela imagem de super-resolução GSD é ainda mais demonstrada nestas imagens, que mostram um miócito cardíaco marcado com um anticorpo anti-CAV 1.2. Utilizando o modo GSD, a melhoria na resolução lateral é acentuada e os agrupamentos separados de canais são mais fáceis de identificar. Após dominado, este protocolo pode ser concluído em menos de três dias.A imagem de super-resolução de uma única célula leva de 10 a 30 minutos, dependendo do número de quadros necessários. Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia eletrônica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual a proteína fluorescente de interesse interage com o complexo ambiente celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, adquirir e analisar amostras para visualizar uma ou mais proteínas celulares por microscopia de super-resolução utilizando esgotamento do estado fundamental seguido pelo retorno individual de moléculas.

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Biology

Biologia

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Informações espaço-temporais sobre proteínas dinâmicas dentro de células vivas são cruciais para a compreensão da biologia. Um tipo de microscopia de super-resolução chamada microscopia de iluminação rápida estruturada em 3D (f3D-SIM) revela informações únicas sobre o anel Z citocinético em bactérias: tanto sua aparência semelhante a um grânulo quanto a dinâmica rápida do FtsZ dentro do anel.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Descrevemos aqui uma combinação da técnica de bicamada lipídica suportada em vidro de formação de sinapses imunológicas com a técnica de imagem de super-resolução de microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários as instruções necessárias para realizar com sucesso essas duas técnicas.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

A microscopia de super-resolução pode fornecer uma visão detalhada da organização dos componentes dentro do complexo sinaptonemal na meiose. Aqui, demonstramos um protocolo para resolver proteínas individuais do complexo sinaptonemal de Caenorhabditis elegans .

Microscopia de super-resolução do complexo sinaptonemal dentro da linha germinal de Caenorhabditis elegans

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)...

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Este protocolo descreve o procedimento para realizar microscopia de localização profunda de molécula única (SMLM) em célula inteira usando um microscópio confocal de disco giratório com reatribuição óptica de fótons, permitindo assim a imagem DNA-PAINT sem a necessidade de óptica personalizada ou iluminação complexa.

Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

Este protocolo detalha as aplicações avançadas de imagem e o gerenciamento de recursos compartilhados de um sistema de microscópio confocal de varredura a laser integrado a um detector de matriz multiplexada para imagens celulares e subcelulares de alta resolução. O fluxo de trabalho permite imagens multimodais desde confocal até super-resolução (~120 nm) dentro de uma única plataforma, tornando a visualização em escala nanométrica mais acessível.

Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Aprenda a usar microscopia de super-resolução GSD para visualizar proteínas de membrana em células de mamíferos fixadas. Este método oferece resolução dez vezes superior à microscopia confocal convencional.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

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