Estimulação transcraniana de elétrica cerebral em roedores alertas

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é permitir a estimulação elétrica cerebral transcraniana confiável e repetida em roedores alertas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuromodulação e neuroplasticidade por estimulação elétrica direcionada de redes cerebrais para melhorar a função motora ou déficits. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite sessões repetidas de estimulação elétrica cerebral não invasiva em roedores alertas sem induzir desconforto e a mínima interferência de suas medidas comportamentais.

Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque encontrar o caminho correto para o tunelamento do tórax à cabeça, bem como a preparação óssea antes da colocação do soquete do eletrodo, é muitas vezes difícil de realizar para investigadores inexperientes. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas cirúrgicas para a colocação do soquete do eletrodo, bem como a preparação e colocação do eletrodo para estimulação, serão cruciais para o sucesso dos experimentos. Nossa doutoranda, Stephanie Haschka, ajudará na realização dos procedimentos NEBS em ratos alertas.

Apresentador}Comece colocando o roedor no peito na mesa de operação. Desinfete o couro cabeludo raspado com um cotonete embebido em agente anti-séptico. Deixe secar ao ar.

Depois de verificar a profundidade da anestesia, corte a pele com um bisturi em uma linha do nível do olho rostral até o nível da orelha média. Em seguida, vire o rato para uma posição supina para que o peito fique exposto e desinfete o peito. Estique a pele lateral do tórax direito com dois dedos e faça um corte sagital reto na orientação craniana.

Forme uma bolsa subcutânea desconectando atraumaticamente a pele do músculo peitoral maior esquerdo, faça isso abrindo repetidamente a tesoura pequena. Em seguida, vire o animal do lado direito, faça um túnel no caminho do cabo do canto occipital esquerdo da pele aberta da cabeça ao longo do pescoço para sair na bolsa peitoral. Penetrando na fáscia superficial usando pinças homeostáticas.

Abra cuidadosamente a pinça homeostática para agarrar a extremidade do cabo do eletrodo conectado ao eletrodo de platina sem permitir que fios afiados se percam. Puxe o cabo através do túnel até que o eletrodo entre na bolsa orientada com o ponto de cauterização voltado para o membro posterior esquerdo do roedor. Em seguida, vire o roedor de volta para a posição de bruços.

Em seguida, fixe a placa de platina com uma sutura sintética estéril trançada não absorvível na fáscia peitoral nos dois orifícios de canto opostos. Da mesma forma, prenda o cabo à fáscia por um nó solto formando um leve laço antes da entrada do túnel de tecido. Por fim, feche a pele com três a quatro suturas cutâneas, dependendo do tamanho do corte.

Comece raspando o periósteo, o tecido conjuntivo do crânio para os lados com o bisturi e limpe bem com cotonetes. Fixe o tecido conjuntivo nos quatro cantos do corte com grampos de buldogue e deixe-os pendurados lateralmente para manter o campo de cirurgia aberto. Em seguida, aplique solução salina a 0,9% para limpar a superfície óssea e o tecido com cotonetes.

Em seguida, limpe a superfície óssea com peróxido de hidrogênio a 3%. Use um cotonete para remover qualquer resíduo do periósteo à medida que se torna visível. Como os parafusos de fixação melhorarão a aderência sedativa, escolha uma broca adequada ao tamanho do parafuso.

Coloque dois burburas em duas placas ósseas diferentes pré-perfurando com uma broca manual e, em seguida, por uma leve pressão de partícula com uma broca óssea. Nos casos de eletrodo implantado, como mostrado neste vídeo, faça um terceiro orifício localizado no osso parietal posterior direito para futura fixação do cabo tunelizado. Coloque os parafusos de plástico nos burburas e aperte até sentir o primeiro atrito.

Em seguida, execute três voltas adicionais de 180 graus com os parafusos. Use uma pinça para verificar a estabilidade do parafuso e adicione mais uma volta se não estiver apertado o suficiente. Ligue o ferro de cauterização e pré-aqueça por aproximadamente cinco minutos.

Enrole o cabo que sai do túnel de tecido occipitalmente ao redor do parafuso parietal direito e, em seguida, corte-o deixando aproximadamente um centímetro de cabo atrás do enrolamento. Retire cuidadosamente o isolamento na extremidade do cabo com um bisturi. Em seguida, fixe o cabo enrolado ao parafuso e ao osso com cola de cianoacrilato.

Em seguida, aplique uma pequena quantidade da cinta de estanho sem chumbo no conector e nos fios desencapados do cabo do contra-eletrodo e conecte ambos pressionando brevemente as duas partes pré-cauterizadas juntas enquanto toca a ponta de cauter até que a cauter de estanho derreta. Remova a ponta de cauterização imediatamente para evitar o aquecimento excessivo do metal do cabo com danos subsequentes ao tecido. Para estimulação do córtex motor, use um soquete de quatro milímetros de diâmetro.

Pegue o soquete do eletrodo tES feito sob medida com uma pinça de ponta serrilhada fina e aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato na borda inferior do soquete. A borda intermedial do alvéolo deve terminar diretamente na sutura sagital e a borda interna do coddle deve terminar na bregma. Em seguida, pressione o soquete brevemente no osso até que a cola endureça.

E use uma luz para garantir que o osso dentro da área do soquete não tenha cola reflexiva. Depois que o alvéolo estiver no lugar e a futura área de estimulação estiver livre de cola, sele a borda lateral do alvéolo ao tecido vizinho com uma pequena gota de cola de cianoacrilato para evitar uma ponte de fluido que possa levar ao desvio de corrente neste local. Em seguida, cubra todos os parafusos com cola de cianoacrilato.

Em seguida, misture os dois componentes ao cimento acrílico em um pequeno tubo de silicone ou vidro. Assim que se tornar viscoso, aplique-o com uma espátula dentária para selar as bordas restantes do alvéolo ao osso. Por fim, cubra todo o crânio, parafusos, cabo do contra-eletrodo e até 1/3 do soquete com cimento acrílico dental.

Depois que todo o osso estiver coberto e o cimento endurecido, remova os grampos do buldogue e reposicione a pele. Comece enchendo o soquete do eletrodo tES com solução salina a 0,9% e remova as bolhas de ar. Antes das sessões catódicas, verifique a cloração e, se necessário, clore novamente o eletrodo de prata e cloreto de prata.

Antes das sessões de tES anódicas, remova possíveis depósitos excessivos de cloreto de prata de estímulos anteriores com uma lixa para permitir uma boa condutividade durante a estimulação. Em seguida, enrosque a tampa do eletrodo tES. Conecte os cabos aos dois conectores no cabeçote.

Em seguida, coloque o roedor na gaiola experimental com os cabos conectados a um giro acima da gaiola que permite o movimento livre. Ligue o estimulador e ajuste os parâmetros de estimulação. Finalmente, após o término da estimulação, desconecte os cabos, desparafuse a tampa do eletrodo na cabeça e limpe e seque o soquete com um cotonete.

Os resultados indicaram que a ativação da microglia avaliada pela alteração morfológica ocorreu primeiro a 31,8 amperes por metro quadrado, enquanto os primeiros sinais de neurodegeneração foram detectados a 47,8 amperes por metro quadrado. As amostras de um a quatro foram classificadas como positivas. A anestesia afetou a magnitude da resposta ao DCS, pois a porcentagem de fatias cerebrais com neurônios degenerados positivos para fluoro-JC em ratos alertas foi maior em 47,8 amperes por metro quadrado.

Além disso, espera-se que os efeitos comportamentais ou moleculares em altas intensidades sejam mecanicamente diferentes em comparação com os efeitos de baixa intensidade. Uma vez dominada, essa técnica, incluindo a colocação do eletrodo torácico, pode ser feita em 40 a 45 minutos se for executada corretamente. Geralmente, é necessária uma duração mais curta de 10 a 15 minutos se nenhum contraeletrodo for colocado cirurgicamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colocar um eletrodo permanente configurado para as diferentes técnicas de simulação NEBS e como aplicar um eTS em roedores alertas. Não se esqueça de que trabalhar com correntes elétricas pode ser prejudicial para o roedor se os eletrodos não forem preparados o suficiente antes da estimulação. Precauções como recloração do eletrodo antes da estimulação catódica ou remoção dos detritos antes da estimulação anódica devem sempre ser tomadas antes de realizar este procedimento.