Estimulação transcraniana de elétrica cerebral em roedores alertas

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é permitir a estimulação elétrica transcraniana confiável e repetida em roedores alertas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuromodulação e neuroplasticidade, por meio da estimulação elétrica direcionada de redes cerebrais para melhorar a função motora ou déficits associados. A principal vantagem desta técnica é que ela permite sessões repetidas de estimulação elétrica cerebral não invasiva em roedores alertas, sem induzir desconforto e com mínima interferência nas medidas comportamentais.

Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois encontrar o trajeto correto do tórax até a cabeça para a passagem subcutânea, bem como o preparo ósseo antes da colocação do soquete do eletrodo, geralmente é difícil de realizar para pesquisadores inexperientes. A demonstração visual deste método é fundamental, já que os passos cirúrgicos para a colocação do soquete do eletrodo, bem como o preparo e posicionamento do eletrodo para estimulação, serão cruciais para o sucesso dos experimentos. Nossa candidata a doutora, Stephanie Haschka, auxiliará na realização dos procedimentos de NEBS em ratos alertas.

Apresentador}Comece posicionando o roedor em decúbito ventral sobre a mesa de operação. Desinfete o couro cabeludo raspado com um cotonete embebido em agente antisséptico. Deixe secar ao ar.

Em seguida, após verificar a profundidade da anestesia, corte a pele com um bisturi em uma única linha do nível do olho rostral até o nível do ouvido médio. Em seguida, vire o rato para a posição supina, de modo que o tórax fique exposto, e desinfete o tórax. Estique a pele lateral do tórax direito com dois dedos e faça um corte sagital reto na orientação cranial.

Forme uma bolsa subcutânea desconectando a pele do músculo peitoral maior esquerdo de forma não traumática, abrindo e fechando repetidamente a tesoura pequena. Em seguida, vire o animal sobre seu lado direito e conduza o cabo a partir do canto occipital esquerdo da pele craniana aberta, passando pelo pescoço até sair na bolsa peitoral. Para isso, penetre a fáscia superficial utilizando pinças hemostáticas.

Abra cuidadosamente a pinça homeostática para segurar a extremidade do cabo do eletrodo ligado ao eletrodo de platina, sem permitir que fios afiados se soltem. Puxe o cabo através do túnel até que o eletrodo entre na bolsa, orientado com a ponta de cauterização voltada para a pata traseira esquerda do roedor. Em seguida, retorne o roedor à posição prona.

Em seguida, fixe a placa de platina com um fio sintético trançado estéril não absorvível ao fascículo peitoral pelos orifícios nos dois cantos opostos. Da mesma forma, prenda o cabo à fáscia com um nó solto, formando uma leve alça antes da entrada no túnel tecidual. Por fim, feche a pele com três a quatro pontos cutâneos, dependendo do tamanho do corte.

Comece removendo o periósteo, o tecido conjuntivo localizado nos lados do crânio, com o bisturi, e limpe completamente com cotonetes. Fixe o tecido conjuntivo nos quatro cantos do corte com grampos tipo "bulldog" e, em seguida, deixe-os pendurados lateralmente para manter o campo cirúrgico aberto. A seguir, aplique solução salina 0,9% para limpar a superfície óssea e o tecido com cotonetes.

Em seguida, limpe a superfície do osso com peróxido de hidrogênio a 3%. Use um cotonete para remover qualquer resíduo do periósteo à medida que ele se tornar visível. Como os parafusos de fixação melhorarão a aderência do sedativo, escolha uma broca que se ajuste ao tamanho do parafuso.

Posicione dois buracos trepanados em duas placas ósseas diferentes com uma broca manual prévia e, em seguida, com leve pressão de partículas usando uma broca óssea. Nos casos em que houver um eletrodo implantado, como mostrado neste vídeo, faça um terceiro orifício localizado no osso parietal posterior direito para futura fixação do cabo subcutâneo. Insira os parafusos plásticos nos buracos trepanados e parafuse até sentir a primeira resistência por atrito.

Em seguida, realize mais três giros completos de 180 graus do parafuso. Utilize pinça para verificar a estabilidade do parafuso e adicione mais um giro caso não esteja suficientemente firme. Ligue o ferro de cautério e aqueça previamente por aproximadamente cinco minutos.

Enrole o cabo que sai do túnel tecidual na região occipital ao redor do parafuso parietal direito e, em seguida, corte-o, deixando aproximadamente um centímetro de cabo atrás da enrolagem. Remova cuidadosamente a isolamento na extremidade do cabo com um bisturi. Em seguida, fixe o cabo enrolado ao parafuso e ao osso com cola de cianoacrilato.

Em seguida, aplique uma pequena quantidade da solda livre de chumbo em estanho no conector e nos fios descascados do cabo do eletrodo contralateral, e conecte ambos pressionando brevemente as partes pré-soldadas juntas, tocando a ponta da solda até que a solda em estanho derreta. Remova imediatamente a ponta da solda para evitar aquecimento excessivo do metal no cabo, o que poderia causar danos ao tecido. Para estimulação do córtex motor, utilize um soquete com diâmetro de quatro milímetros.

Utilize uma pinça fina com ponta serrilhada para pegar o soquete personalizado para eletrodo de est, e aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato na borda inferior do soquete. A borda intermedial do soquete deve terminar exatamente na sutura sagital e a borda interna do coddle deve terminar no bregma. Em seguida, pressione levemente o soquete contra o osso até que a cola endureça.

E use uma luz para garantir que o osso na área do soquete não tenha cola refletiva. Após o posicionamento do soquete e com a área futura de estimulação livre de cola, selar a borda lateral do soquete ao tecido vizinho com uma pequena gota de cola de cianoacrilato para evitar uma ponte líquida que poderia causar desvio de corrente nesse local. Em seguida, cobrir todos os parafusos com cola de cianoacrilato.

Em seguida, misture os dois componentes do cimento acrílico em um pequeno tubo de silicone ou vidro. Assim que o material ficar viscoso, aplique-o com uma espátula dental para selar as bordas restantes do soquete ao osso. Por fim, cubra todo o crânio, os parafusos, o cabo do contra-eletrodo e até 1/3 do soquete com cimento acrílico dental.

Após toda a cobertura óssea e a cura do cimento, remova as pinças bulldog e reposicione a pele. Comece preenchendo metade do soquete do eletrodo de tES com salina 0,9% e remova as bolhas de ar. Antes das sessões de tES catódicas, verifique a cloração e, se necessário, reclorine o eletrodo de prata cloreto de prata.

Antes das sessões de tES anodal, remova possíveis depósitos excessivos de cloreto de prata das estimulações anteriores com lixa para permitir uma boa condutividade durante a estimulação. Em seguida, parafuse o capuz do eletrodo de tES. Conecte os cabos aos dois conectores na cabeça.

Em seguida, coloque o roedor na gaiola experimental com os cabos conectados a um conector giratório acima da gaiola, que permite movimento livre. Ligue o estimulador e ajuste os parâmetros de estimulação. Por fim, após o término da estimulação, desconecte os cabos, remova a tampa do eletrodo da cabeça, e limpe e seque o soquete com um cotonete.

Os resultados indicaram que a ativação da micróglia, avaliada por alteração morfológica, ocorreu inicialmente em 31,8 amperes por metro quadrado, enquanto os primeiros sinais de neurodegeneração foram detectados em 47,8 amperes por metro quadrado. As amostras de um a quatro foram classificadas como positivas. A anestesia afetou a magnitude da resposta ao DCS, pois a porcentagem de fatias cerebrais com neurônios degenerativos positivos para fluoro-JC em ratos alertas foi maior em 47,8 amperes por metro quadrado.

Além disso, espera-se que efeitos comportamentais ou moleculares em altas intensidades sejam mecanicamente diferentes em comparação com os efeitos de baixa intensidade. Uma vez dominada, esta técnica, incluindo a colocação do eletrodo torácico, pode ser realizada em 40 a 45 minutos se for executada corretamente. Uma duração mais curta de 10 a 15 minutos geralmente é necessária se nenhum eletrodo contralateral for cirurgicamente posicionado.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como posicionar um conjunto de eletrodos permanente para as diferentes técnicas de simulação NEBS e de como aplicar um eTS em roedores alertas. Não se esqueça de que trabalhar com correntes elétricas pode ser prejudicial para o roedor se os eletrodos não forem preparados adequadamente antes da estimulação. Precauções, como a re-cloração do eletrodo antes da estimulação catódica ou a remoção de detritos antes da estimulação anódica, devem sempre ser tomadas antes de realizar este procedimento.