Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano
4 de dezembro de 2017
É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.
O objetivo deste protocolo é preparar e analisar amostras de líquido cefalorraquidiano humano para análise de LC-MS de peptídeos endógenos. Uma etapa de pré-fracionamento de peptídeos antes de LC-MS aumenta o número de peptídeos identificados e permite a detecção de peptídeos de LCR de abundância relativamente baixa. Os peptídeos endógenos no LCR são moléculas de cálcio que não foram extensivamente exploradas e podem potencialmente incluir novos biomarcadores importantes de distúrbios neurodegenerativos. Este método permite a caracterização extensiva do peptidomo do LCR por espectrometria de massa. As principais vantagens deste método são que ele permite a injeção de peptídeos de LCR de baixa abundância e é compatível com técnicas de marcação isobárica multiplex, tornando-o aplicável para estudos clínicos. Até agora, aplicamos esse método principalmente à análise do líquido cefalorraquidiano. Mas temos dados preliminares indicando que, com pequenas modificações, ele também pode ser usado para análise de amostras de plasma e tecido. Comece descongelando alíquotas de 1,5 mililitro de LCR em temperatura ambiente na batedeira de rolos. Depois de descongelado, transfira o conteúdo para tubos de polipropileno de 10 mililitros. E adicione 80 microlitros de um molar TAB como agente tamponante. Em seguida, adicione 0,65 mililitros de um cloridrato de guanidínio de oito molares para dissolver agregados de proteínas e vórtice suavemente à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, a 60 microlitros de TCEP aquoso de 200 milimolares e incubar a 55
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para análise espectrométrica de massas de peptídeos endógenos no líquido cefalorraquidiano humano (LCR). Ao utilizar filtração com corte de peso molecular, pré-fracionamento cromatográfico e análise espectrométrica de massas, a pesquisa amplia significativamente o peptidoma do LCR conhecido, melhorando a identificação de peptídeos de baixa abundância que poderiam servir como biomarcadores para distúrbios neurodegenerativos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Espectrometria de Massas
- Descoberta de Biomarcadores
Contexto
- Os peptídeos endógenos no LCR são potencialmente significativos na identificação de distúrbios neurodegenerativos.
- Os peptídeos do LCR com baixa abundância não foram amplamente estudados.
- Os métodos existentes forneceram dados limitados sobre o peptidoma do LCR.
Objetivo do Estudo
- Ampliar a identificação e caracterização de peptídeos endógenos no LCR humano.
- Fornecer uma visão mais abrangente do peptidoma do LCR.
- Explorar o potencial de novos biomarcadores em condições neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Espectrometria de massas com pré-fracionamento de amostras de LCR.
- Envolve o descongelamento e processamento de alíquotas de 1,5 mililitro de LCR com reagentes específicos.
- Compatível com técnicas de marcação isobárica multiplexadas.
- Pode ser adaptado para análise de amostras de plasma e tecido com modificações mínimas.
Resultados Principais
- O método permite a detecção de um número significativamente maior de peptídeos em comparação com estudos anteriores.
- Os principais achados indicam a presença de peptídeos de baixa abundância previamente inexplorados.
- Fornece insights que podem levar à descoberta de novos biomarcadores.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma abordagem eficiente para caracterizar o peptidoma do LCR.
- A versatilidade do método abre caminhos para estudos clínicos sobre distúrbios neurodegenerativos.
- Implicações potenciais para o entendimento dos mecanismos neuronais e a identificação de marcadores de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aprimora a detecção de peptídeos endógenos de baixa abundância no líquido cefalorraquidiano humano, um biofluido essencial para a descoberta de biomarcadores de doenças neurodegenerativas. Ao reduzir a complexidade proteica por meio da fracionamento com corte de massa molecular e melhorar a cobertura de peptídeos por meio de pré-fracionamento com RP-HPLC em pH elevado, aumenta a sensibilidade analítica para esforços de validação de alvos. A abordagem auxilia no desvio de riscos mecanicistas ao permitir um perfil mais profundo do peptidoma, o que pode orientar a confiança inicial no alvo e a seleção de biomarcadores preditivos em programas de descoberta de fármacos para o SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de populações endógenas de peptídeos que refletem processos fisiopatológicos do SNC, apoiando a verificação de hipóteses sobre alvos terapêuticos.
- Valor Operacional: Reduz a interferência da faixa dinâmica causada por proteínas abundantes no LCR, melhorando a detecção de peptídeos sinalizadores em baixos níveis, relevantes para a modulação de vias metabólicas.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera padrões reprodutíveis de fracionamento de peptídeos que permitem leituras consistentes por LC-MS/MS para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Compatível com marcação isobárica multiplex, permitindo análise comparativa de peptidomas entre coortes de doenças e controles em fluxos de trabalho de triagem de biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a descoberta de biomarcadores ao identificar peptídeos derivados do LCR que podem estar correlacionados com mecanismos de doenças neurodegenerativas.
- Valor Operacional: Adaptável a amostras de plasma e tecidos com modificações mínimas, apoiando a validação cruzada em pipelines translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a exploração hipótese-dirigida do peptidoma antes das etapas de identificação de compostos promissores e validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia o perfilhamento imparcial de peptídeos endógenos para esclarecer vias associadas a doenças e reduzir riscos na seleção de alvos.
- Triagem: Permite detecção de peptídeos com alta confiança por meio da redução da complexidade da amostra e da melhoria da separação cromatográfica.
- Análises: Gera dados quantitativos de peptídeos com resolução por frações, compatíveis com multiplexação baseada em marcadores para estudos comparativos.
- Pesquisa Translacional: Fornece uma base para o alinhamento de biomarcadores ao associar alterações no peptidoma do LCR a processos neurodegenerativos.
- Reutilização Corporativa: O fluxo de trabalho principal — filtração com limite de peso molecular (MWCO), fracionamento em pH elevado e LC-MS — pode ser padronizado entre laboratórios para análise reprodutível do peptidoma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta o rendimento de identificação de peptídeos e permite a detecção de espécies de baixa abundância que podem servir como indicadores mecanicistas ou de estado da doença.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da pré-fracionamento padronizado e reduz a variabilidade técnica na análise de biofluidos complexos.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança nas decisões de validação de alvos ao expandir o espaço biológico observável no LCR.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização de biomarcadores ajustada ao risco por meio de uma cobertura mais ampla do peptidoma e detecção de sinal aprimorada.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência no manuseio de LCR, inibição de proteases e peptidômica baseada em espectrometria de massas.
- O instrumental deve incluir sistemas de CL-EM/EM capazes de compatibilidade com fracionamento em pH elevado e detecção sensível de peptídeos.
- A padronização entre locais exige seleção consistente de filtros com PMCO definido, concatenação de fracionamentos e parâmetros de identificação baseados em software.
- A adaptação ao plasma ou tecido exige otimização das condições de lise, esgotamento e fracionamento para levar em conta a complexidade distinta da matriz.
- As limitações práticas incluem a perda potencial de peptídeos durante a filtração e a necessidade de controle rigoroso de contaminação devido à análise de alvos de baixa abundância.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
