Name: Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a estimar dose de radiação biológica usando o software ADCI para identificação automatizada de cromossomos dicêntricos em imagens de células em metáfase. Este método acelera a biodosimetria.

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Nós estamos gratos ao Dr. Ruth Wilkins, radiobiologia e divisão de proteção à saúde do Canadá e Farrah Flegal, laboratórios nucleares canadenses e seu pessoal de laboratório para acesso aos dados de imagem de metáfase de seus laboratórios de citogenética biodosimetry. Este trabalho foi apoiado por um contrato de compilação no programa de inovação de Canadá a CytoGnomix (n º série EN579-172270/001/SC). A versão inicial do ADCI e desenvolvimento de algoritmos foram apoiados pelo fundo de inovação ocidental; as ciências naturais e engenharia Research Council do Canadá (NSERC Discovery Grant 371758-2009); Serviço de saúde pública dos EUA (DART-DOSE CMCR, 5U01AI091173-0); a Fundação Canadense para a inovação; Cadeiras de pesquisa do Canadá e CytoGnomix Inc.

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PKR e JHMK co-fundou a CytoGnomix, que está comercializando ADCI e detém patentes relacionadas. ILO e BCS são empregados da CytoGnomix. ADCI é protegido por direitos autorais, e o método de localização do centrômero em ADCI é patenteado (nos Pat. N. º 8.605.981; Pat alemão. N. º 112011103687).

Capacidades e limitações do software
O protocolo descrito neste documento introduz o procedimento passo a passo típico usado em ADCI para importar e processar imagens de citogenética metáfase, criar radiação as curvas de calibração e estimar a dose biológico em indivíduos ou amostras expostas ao desconhecido níveis de radiação. No entanto, não é necessário efectuar estas instruções sequencialmente. Por exemplo, muitas amostras de teste de dose desconhecido podem ser processadas e analisaram usando a mesma curva de calibração pré-computadas. Além disso, uma vez que a transformação está completa, a seleção de imagem e DC modelos de filtragem podem ser iterada pelo usuário. Aplicação de um modelo de seleção de imagem adequado depende das características e qualidade dos dados da imagem de metáfase, que por sua vez, baseia-se tanto sobre o protocolo de laboratório usado para preparar as células e os critérios de rigor usados para selecionar células com automatizado sistemas de captura de metáfase. Morfologias cromossomo diferirão entre laboratórios de citogenéticos e biodosimetry, e assim, os modelos de seleção de imagem devem ser avaliados pelo usuário para determinar se os modelos de seleção de imagem predefinidos fornecidos com o software serão adequados para produzir estimativas de dose exata, ou se personalizado modelos com usuário-definido os limites precisam ser criados. Baseado em nossa experiência, a eficácia dos modelos de seleção de imagem é influenciada pela origem e qualidade das imagens celular. Os usuários podem projetar seus próprios critérios de seleção de imagem usando diferentes combinações de filtros para eliminar falsos positivos DCs e modelos de seleção de imagem e os correspondentes valores de limiar para selecionar as imagens desejadas. Há flexibilidade na entrada de curvas de calibração e estimativa de dose, como coeficientes da curva linear-quadrática e frequências de DC podem ser modificados ou introduzidos manualmente.
Embora o software é totalmente automatizado, imagens podem ser revistas e selecionadas manualmente. Esse recurso está disponível para incluir ou remover imagens individualmente processadas através da função de visualizador de microscópio na GUI do principal. No entanto, devido à automação, o software é significativamente mais eficiente em comparação com o manual de Pontuação de imagens metafase e contando DCs. Uma amostra composta de 1000 imagens pode ser processada em (tiff) de 20 a 40 min (jpg) em uma estação de trabalho de desempenho de vários núcleos. Este software será particularmente útil em situações críticas de tempo ou trabalho intensivos, como eventos em que vários indivíduos foram expostos ou eram suspeitos de ter sido exposto à radiação, ou onde o tempo-sensíveis diagnostica e tratamento as decisões são críticas.
Deteção de precisos e exatos alto throughput da DCs, bem como a estimativa de dose são necessários para a avaliação de radiação autônoma. Outras alternativas disponíveis para o software não cumprir os dois desses requisitos. Uma análise citogenética assistida por usuário, com base em imagem (DCScore, Metasystems17) sistema requer verificação manual de candidato DCs, devido a um erro de alto taxa atribuível a não corrigida sobreposições entre cromossomos e o sistema não determina dose de radiação. DCScore não seria tão eficaz como ADCI em um evento de radiação que envolvem um grande número de indivíduos potencialmente expostos. Sistemas de microscópio de grande abertura podem coletar imagens de várias células de metafase18, no entanto, eles não analisá-los. Software de20 "Estimativa de Dose" e "CABAS"19 podem gerar calibração curvas e estimativa de dose, mas não marcam DCs. Outros ensaios de biodosimetry que não são baseados na análise de DC incluem H2AX de fluorescência, sondas de hibridação in situ da fluorescência com DNA alvo para específicos cromossomos, expressão gênica, ensaio de micronúcleo e urina e biomarcadores respiratórias. Esses métodos são menos específica e menos sensível para radiação ionizante, podem ser mais caros, em alguns casos, são mais demorados e geralmente não têm sido padronizados através de vários laboratórios de referência. A maioria destas técnicas não detectam radiação estável respostas, então não podem ser utilizados para a avaliação de longo prazo (&#62; pós-exposição de 7 dias) da dose de radiação. Por outro lado, isto pode avaliar os indivíduos acima de pós-exposição de 90 dias e pode processar dados de qualquer microscópio do laboratório de citogenética sistema de imagem. No entanto, se uma amostra é desenhada &#62; 4 semanas pós-exposição, sensibilidade é reduzida devido a decadência de aberrações dicentric1,2,3 e o software atualmente não corrigir frequências de DC para atrasos na amostragem indivíduos expostos.
Este software tem algumas limitações. Modelos de seleção de imagem existente selecione imagens de metafase aceitável na maior parte, mas em alguns casos, não conseguem eliminar imagens insatisfatórias, o que podem reduzir a precisão da detecção de DC. É ainda uma pergunta aberta como projetar um modelo de seleção de imagem satisfatória que elimina todas as células em metafase inadequados. O software fornece estimativas precisas para amostras expostas a doses mais elevadas de radiação (≥ 2 Gy). Apesar do considerável progresso na redução do número de falsos positivos de DCs16, esses objetos não foram eliminados. Reduzir as células de metafase qualidade em baixa dose de radiação (especialmente &#60; 1 Gy) são mais propensas a falsos positivos na detecção DC. Portanto, amostras de baixa dose não foram incluídas ao gerar a curva de calibração utilizada para estimativa da dose de amostras de teste HC. No entanto, se uma curva contendo amostras de baixa dose é desejada, um valor mais baixo de SVM Sigma reduz falsas acusações positivas em amostras de baixa dose mas pode resultar em menor rendimento de DC em amostras de alta dose. Figura 8 compara a curva HC usada para estimativa da dose (Sigma = 1,5) com uma curva de calibração ajuste com amostras de dose adicional de baixo valor de sigma inferior SVM (1.0). Em amostras com um número insuficiente de células em metafase e/ou imagens de metáfase de má qualidade, pode não ser possível estimar com precisão os riscos biológicos em dose baixa, potencialmente resultando em desvios da física dose superior a 0,5 Gy.
O software com precisão não pode avaliar tipos de radiação se suas curvas dose-resposta melhores se ajustar a um modelo linear ou quase linear. Até então, ele foi testado somente com amostras expostas a - X e raios gama. Se outra fonte de radiação é examinada, os usuários devem assegurar amostras de teste e de calibração são expostas ao mesmo tipo de radiação. O software usa a máxima verossimilhança ou mínimos quadrados de encaixe para construir uma curva de dose-resposta, usando um modelo linear-quadrática. Atualmente, não há nenhuma opção para impor uma estrita curva linear caber, apropriado para exposições de partículas de alta energia, no entanto essa funcionalidade estará disponível no futuro.
Desenvolvimento futuro
Nossos esforços estão focados em melhorar os modelos de seleção de imagem e dose exata medida, em particular das amostras expostos a doses de radiação de baixa. As versões subsequentes do software fornecerá medições de erro padrão em estimativas de dose e intervalos de confiança sobre as curvas de calibração. Além disso, uma versão de alto-desempenho-computação do software para o supercomputador Blue Gene (BG/Q, IBM) está em desenvolvimento para uma avaliação atempada de indivíduos expostos em um evento de massa-baixa radiação. Alguns componentes do software já foram testados e implantados nesta plataformaLass = "xref" > 11.

Radiação biodosimetry usa marcadores biológicos, principalmente cromossômicas aberrações como dicentric cromossomos (DCs) e translocações cromossómicas para medir o que os indivíduos são expostos a doses de radiação. Uma dose biologicamente absorvida pode ser diferente da dose física medida por instrumentos devido à variabilidade entre indivíduos. Da mesma forma, a radiação de uma certa dose de física pode produzir diferentes exposições biológicas devido a condições subjacentes fisiológicas ou ambientais. Conhecimento da dose biológico é de particular importância para o diagnóstico e o tratamento.
O ensaio de DC é o padrão-ouro da Organização Mundial de saúde (OMS) e da Agência Internacional de energia atômica (AIEA) para avaliar a exposição de radiação biológica nas pessoas. Foi o primeiro ensaio recomendado pela AIEA e quem para avaliação de dose de radiação. Frequência de DC é relativamente estável por aproximadamente 4 semanas após a exposição de radiação1 e sua correlação quantitativa com dose de radiação emitida é exata, que fazem DCs o biomarcador ideal. A relação entre a dose de radiação (referenciado em unidades de Gray [Gy]) e frequência DC (referida como número de DCs por célula) pode ser expressa como uma função linear-quadrática.
O ensaio de DC a citogenética tem sido o padrão da indústria para cerca de 55 anos2. Isso foi realizado manualmente, exigindo 1-2 dias para analisar os dados do microscópio de uma amostra de sangue. Várias centenas a vários milhares de imagens são necessários para estimar com precisão a exposição à radiação, dependendo da dose3. Em doses superiores a 1 Gy, AIEA recomenda um mínimo de 100 DCs ser detectado. Análise de imagens de metafase 250-500 é uma prática comum em laboratórios de citogenética de biodosimetry. Para amostras com exposições &#60; 1 Gy, 3.000-5.000 imagens são sugeridas devido as menores probabilidades de formação de DC. Em ambos os casos, é uma tarefa de trabalho intensivo.
Laboratórios de citogenética biodosimetry criar seus próprios in vitro as curvas de calibração de biodosimetry de radiação antes de avaliar doses biológicos em amostras do teste. Amostras de sangue de indivíduos normais, do controle são expostas à radiação e linfócitos são cultivados e preparados para análise de cromossomos metáfase. Usando estas amostras, biológicos doses recebidas são calibrados para as doses de físicas conhecidas emitidas por uma fonte de radiação padrão. Depois de imagens de célula metáfase são gravadas, especialistas examinar imagens, contam DCs e calcular as frequências de DC para cada amostra. Uma curva de calibração é construída por uma curva linear-quadrática para as frequências de DC se encaixam todas as doses. Em seguida, exposições em amostra de indivíduos podem ser inferidas pela correspondência entre as frequências de DC para as doses calibradas na curva, ou especificando-os na fórmula quadrática linear correspondente.
Nós automatizamos ambos a detecção de DCs e determinação para acelerar esse processo usando software de dose. Automatizado Dicentric identificador de cromossomo e Dose estimador (ADCI) usa imagem baseada em aprendizagem de máquina técnicas de processamento para detectar e discriminar dicentric cromossomos (DCs) de cromossomos monocentric (MCs) e outros objetos e automatiza a radiação estimativa de dose. O software visa significativamente reduzir ou eliminar a necessidade de verificação manual das contagens de DC e acelerar a estimativa da dose através da automação. Ele foi desenvolvido com a participação dos laboratórios de biodosimetry de referência em saúde Canadá (HC) e laboratórios nucleares canadenses (CNL). Seus comentários irão garantir que o desempenho continuará a cumprir critérios AIEA para este ensaio.
O software executa as seguintes funções: 1) filtragem DCs e selecionar imagens de célula ideal metáfase para análise, reconhecimento do cromossomo 2), detecção de DC e determinação de frequência de DC e 3) estimar a dose de radiação de dose calibrada, dados de citogenética de radiação. Este software processa grupos de imagens metáfase da mesma individuais (denominados uma amostra), conta o número de DCs em cada usando image técnicas de processamento e retorna a dose estimada de radiação recebida por cada amostra em unidades de Grays (Gy).
O software foi projetado para lidar com uma variedade de estruturas de cromossomo, contagens e densidades. No entanto, o algoritmo executa otimamente em imagens de metafase contendo um complemento completo perto de cromossomos bem separados, linear4. Imagens contendo altamente sobrepostos conjuntos de cromossomas, várias células, células em metafase incompleta, irmã separação de cromátides irmãs, núcleos, objetos não-cromossômicas e outros defeitos podem reduzir a precisão do algoritmo. Dedicado a modelos de seleção de imagem e outra segmentação objeto limiares podem filtrar a maioria das imagens sub-ótimas e DCs positivos falsos.
Detecção de dicentric cromossomo é executada quando uma imagem é processada. O algoritmo tenta determinar quais objetos em uma imagem são cromossomos e em seguida, localiza as duas regiões mais prováveis de serem centrómeros em cada cromossoma. Em seguida, uma série de diferentes suporte Vector Machine (SVM) modelos de aprendizagem distinguir cromossomas como DCs ou normal, monocentric cromossomos. Os modelos SVM diferem em sensibilidade e especificidade da deteção de DC (ver passo 3.1.4 abaixo), que pode afetar as frequências de DC que são determinadas em uma amostra.
ADCI processos conjuntos de Giemsa (ou DAPI) manchadas de imagens digitais da metáfase (em formato TIFF ou JPG) para uma ou mais amostras. O software analisa DCs em amostras de calibração e amostras de teste. As doses de físicas (em Gy) de amostras de calibração são conhecidas e são usadas na geração de uma curva de calibração. As doses de físicas e biológicas de indivíduos com riscos desconhecidos são inferidas pelo software a partir da curva de calibração gerado pelo computador. Embora os laboratórios utilizem técnicas comparáveis, as curvas de calibração de laboratórios diferentes muitas vezes variam3. Ambas as amostras de teste e a curva de calibração do mesmo laboratório devem ser processadas para a estimativa da dose exata em amostras do teste.
Este software oferece velocidade, precisão e escalabilidade que endereços a produtividade necessária para manipular um evento em que muitos indivíduos simultaneamente devem ser testados. Ele foi desenvolvido a partir de 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Uso de hardware de computador recentes, nesta área de trabalhoSoftware de PC pode processar e estimativa de dose de radiação em uma amostra de 500 equivalentes de genoma metáfase em 10-20 min 4do paciente. O código é baseado em um conjunto de segmentação de imagem proprietária e máquina de aprendizagem de algoritmos para análise de cromossomos. Especialista em análise de cada cromossomo 3 Gy radiação deu ADCI exatidões comparáveis. Em um conjunto de 6 amostras de exposições desconhecidas (anteriormente utilizadas em um exercício de proficiência internacional), o software calcula-se doses dentro de 0,5 Gy dos valores obtidos pela revisão manual dos mesmos dados pelo HC e CNL, satisfazendo as exigências da AIEA para triagem biodosimetry. Além disso, a padronização interlaboratorial e, finalmente, a reprodutibilidade da dose estima benefício de ter um DC comum, automatizado, marcando o algoritmo. No entanto, o software permite personalização de imagem critérios de filtragem e seleção, permitindo diferenças nos métodos de preparação de cromossomo e fontes de calibração de radiação a ser tidos em conta.
Este software é uma interface de usuário gráfica (GUI) - sistema que analisa conjuntos de imagens de cromossomo contendo Giemsa (ou DAPI) - manchado células em metafase para anormalidades que resultar da exposição a radiações ionizantes. Os conjuntos de imagens são fotografados digitalmente com um sistema de microscópio de luz (ou epifluorescente) e cada conjunto corresponde a uma amostra diferente. O software utiliza técnicas para detectar e discriminar DCs de MCs e outros objetos de processamento de imagem. Filtros de segmentação empiricamente derivados então automaticamente eliminam falsos positivos DCs sem afetar a verdadeiras DCs. Finalmente, o software automaticamente filtra imagens indesejáveis com base em várias propriedades de imagem encontradas imagens de má qualidade metáfase com modelos de seleção de imagem pré-computadas (ou especificado pelo usuário). Estas imagens incluem aqueles que contêm excessiva ou insuficiente número de objetos "barulhentos", vários cromossomos sobrepostos, imagens faltando cromossomas da metafase, um número excessivo de irmã cromátides irmãs4. Os dados de imagem automaticamente curadoria são usados para gerar a curva de calibração da dose de amostras de dose de radiação conhecida e são usados para estimar as exposições das amostras de teste expostas a doses desconhecidas.
Saída do software pode ser vista e salvo como: saída 1) baseado em texto exibida no console, 2) parcelas que podem ser salvos como imagens e 3) relatórios em formato HTML. Muitos aspectos do software são personalizáveis para atender às necessidades específicas de diferentes laboratórios. Laboratórios individuais geralmente fornecem tanto calibração e teste de amostras preparadas e coletados baseiam no protocolo citogenética validado em laboratório. Isto mantém a uniformidade da preparação da amostra e permite que as curvas de calibração geradas a partir de amostras de calibração a ser significativamente aplicada para testar amostras derivadas usando o mesmo protocolo. As curvas de calibração também podem ser criadas a partir de coeficientes da curva ou frequências de DC em doses definidas. As estimativas de dose mais precisas são obtidas por filtragem de imagens de qualidade inferiores e falsos positivos DCs (FPs). Seleção de subconjuntos de imagem ideal dentro de cada amostra é realizada usando 'Modelos de seleção de imagem' que eliminam subpar imagens que tendem a apresentar FPs. Uma série de modelos previamente validados são incluídos com o software, no entanto adicionais modelos com limiares personalizados e filtros podem ser criados e salvos, pelo usuário.
Uma vez que o software é carregado com êxito, é apresentada a interface principal de usuário gráfica (GUI) (ver Figura 1). A partir desta interface, amostras, cada um composto por uma pasta de arquivos de imagem de célula em metáfase, podem ser selecionados e processados para identificar DCs, curvas de calibração podem ser criadas e comparadas e dose de exposição de radiação de amostras pode ser determinada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56245/56245fig1.jpg"> 
Figura 1: Os principais setores do usuário Interface gráfica incluir: uma lista de amostras (1), uma lista de calibração de curvas (2), o processo da fila (3), que monitora o status da detecção de DC em cada conjunto de imagens de cada amostra, uma trama Exiba (4), que resume as estatísticas ou outras propriedades quantitativas de um conjunto de imagens em um console (5) que contém o texto descritivo como saídas de cada operação executada pelo programa ou as curvas de calibração e amostras. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56245/56245fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Identificador Cromossômico Dicêntrico Automatizado e Estimador de Dose (ADCI)</td><td>O software CytoGnomix</td><td>NA</td><td>ADCI é lançado em um arquivo de pacote de instalação binária para Microsoft Windows 7, 8, 8.1 e 10; 235 Mb de armazenamento em disco são necessários para uma instalação típica. O software foi testado com processadores Intel ou AMD x86-64; recomenda-se pelo menos 1 Gb de RAM. As análises foram comparadas em um computador configurado com um processador Intel I7 e 16 Gb de RAM. A operação do ADCI requer uma licença ativa e um dongle de hardware baseado em USB, que deve permanecer conectado enquanto o software está em execução. O dongle codifica a data de expiração do software. Cada vez que o software é iniciado, essa data é lida. O software permitirá o acesso ao programa se a data e hora atuais precederem o carimbo de data e hora de expiração. A extensão de uma licença de software expirada pode ser realizada obtendo um novo dongle ou renovando a licença com uma chave atualizada na inicialização.</td></tr><tr><td>Imagens digitais de núcleos de células metafásicas</td><td>Exemplos: Metasystems, Leica Microsystems</td><td>M-Search (Metasystems), software Cytovision (Leica)</td><td>Formato TIFF de alta resolução; normalmente >250 imagens digitais geradas com um sistema de captura de imagens de microscópio (objetiva de ampliação mínima de 63X, ocular de ampliação de 10X).</td></tr><tr><td>MSI Leopard Pro (recomendado, opcional)</td><td>Estação de trabalho de desempenho Micro-Star International</td><td>MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro</td><td>Multi-core.</td></tr></tbody></table>

biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação dicentric cromossomo (adci) e estimativa de dose

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Dose de radiação biológica pode ser estimado de frequências dicentric cromossomo em células em metafase. Realizar estes ensaios citogenéticos dicentric cromossomo é tradicionalmente um processo manual, trabalhoso, não adequado para lidar com o volume de amostras que podem exigir o exame na sequência de um evento de massa baixa. Software automatizado Dicentric identificador de cromossomo e Dose estimador (ADCI) automatiza este processo examinando conjuntos de metafase imagens utilizando técnicas de processamento de imagem baseado em aprendizado de máquina. O seleciona software imagens apropriadas para análise removendo imagens impróprias, classifica cada objeto como um Centrómero contendo cromossomo ou não-cromossomo, mais distingue cromossomos como monocentric cromossomos (MCs) ou dicentric cromossomos (DCs), determina a frequência DC dentro de uma amostra e estima a dose de radiação biológico, comparando a frequência de DC de amostra com as curvas de calibração calculadas usando amostras de calibração. Este protocolo descreve o uso do software ADCI. Normalmente, ambos calibração (dose conhecida) e conjuntos de teste (dose desconhecida) de imagens de metáfase são importados para realizar a estimativa da dose exata. Imagens ideais para análise podem ser encontrados automaticamente usando filtros de imagem predefinidos ou também podem ser filtradas por meio de inspeção manual. O software processa imagens dentro de cada amostra e frequências de DC são calculadas em diferentes níveis de rigor para chamar DCs, usando uma abordagem de aprendizagem de máquina. As curvas de calibração linear-quadrática são geradas com base em frequências de DC em amostras de calibração expostas a doses físicos conhecidos. Estimam-se doses de amostras de teste, expostas a níveis de radiação incerto de suas frequências de DC usando estas curvas de calibração. Relatórios podem ser gerados mediante pedido e fornecem o resumo dos resultados de uma ou mais amostras, de uma ou mais curvas de calibração ou de estimativa de dose.

O ensaio de cromossomo dicentric citogenética (DC) quantifica a exposição a radiações ionizantes. O software automatizado Dicentric identificador de cromossomo e o estimador de Dose com precisão e rapidamente estima biológica dose de DCs em células em metafase. Ele distingue monocentric cromossomos e outros objetos de DCs e as estimativas de dose de radiação biológica da frequência de DCs.

Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

O objetivo geral deste protocolo baseado em software é estimar com precisão e rapidez a dose biológica total de radiação no corpo a partir de cromossomos dicêntricos encontrados em conjuntos de imagens de células em metáfase previamente filtradas automaticamente, utilizando técnicas de processamento de imagem baseadas em aprendizado de máquina. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a resposta a um evento de exposição em massa à radiação. A análise rápida de um grande número de amostras será necessária para determinar a dose de radiação.A principal vantagem deste software é a automação do filtro de imagens, da geração de curvas de calibração, da detecção de cromossomos dicêntricos e da estimativa da dose de radiação. Essas são tarefas tradicionalmente demoradas e que exigem muito trabalho. Embora este método possa fornecer informações sobre a biodosimetria citogenética da radiação, ele também poderia ser aplicado para selecionar as melhores imagens cromossômicas para análises diagnósticas de doenças genéticas herdadas e adquiridas.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando começamos a desenvolver métodos de análise de imagens cromossômicas para pontuar automaticamente a fluorescência dentro de duas imagens de hibridização. Colegas haviam indicado que a capacidade atual de testar múltiplos indivíduos expostos também era muito limitada. Abra o software e crie uma nova amostra a partir do menu.Em seguida, selecione a pasta que contém as imagens de metáfase a serem analisadas. No aviso, forneça um ID exclusivo para identificar a amostra. Apenas caracteres alfanuméricos, sublinhados e traços podem ser utilizados.Em seguida, forneça uma descrição da amostra, se desejado. Repita este processo para adicionar conjuntos adicionais de imagens de amostras. Um mínimo de três conjuntos de amostras de calibração é necessário para a análise, mas utilize sete ou mais para obter bons resultados.Eles devem abranger de zero a cinco gray de exposição à radiação. Após carregar todas as amostras, selecione-as na lista de amostras e adicione-as à fila de processamento. Em seguida, processe todas as amostras para identificar várias propriedades em cada imagem.O progresso do processamento é exibido. Após a conclusão do processamento, clique na marca de seleção verde e salve as amostras processadas como arquivos de amostra. Antes de prosseguir, é recomendável visualizar as imagens processadas no Visualizador de Imagens de Metáfase.Destaque amostras da lista e abra o visualizador. Em seguida, navegue pelas imagens. Dentro do visualizador de imagens, podem ser aplicados filtros.Vários modelos de seleção de imagens são fornecidos com o software. A filtragem irá analisar as propriedades identificadas durante o processamento. Se desejado, um modelo personalizado pode ser criado do zero e salvo para uso repetido.Se o Assistente de Calibração de Curva descrito na próxima seção for utilizado, o modelo será aplicado durante essa etapa. Use o Assistente de Calibração de Curva para analisar os arquivos de amostras do processo. Para um bom ajuste da curva, inclua pelo menos sete amostras de calibração, variando de zero a cinco tons de cinza.Na primeira página do macro Assistente, marque com um X cada amostra de calibração desejada. Para cada amostra de calibração, especifique a dose de radiação no campo de texto adjacente. Na página seguinte, selecione um modelo predefinido de seleção de imagem.Na próxima página, selecione um valor Sigma SVM na caixa suspensa. Recomenda-se um valor de 1,4 ou 1,5 para estimativas de dose superiores a um gray. Caso contrário, utilize um valor de 1,0.Na página final, revise todas as opções selecionadas. Se elas parecerem corretas, finalize o processo de seleção. Agora, aparecerá um diálogo preenchido previamente para criar uma curva.Especifique uma identidade exclusiva para a curva na caixa de texto e, em seguida, pressione Validar dados para garantir que o conteúdo da lista de dose-resposta esteja formatado corretamente. Verifique se todos os campos da lista de dose-resposta estão destacados em verde, o que indica dados válidos. Em seguida, envie os dados para análise usando o botão OK e siga as instruções para salvar os resultados.Para realizar a análise de estimativa de dose, inicie a macro Assistente encontrada no menu Estimativa de Dose. Primeiro, selecione uma curva de calibração previamente criada na caixa suspensa. Suas propriedades aparecerão abaixo.Na próxima página, alterne as amostras de teste com exposição desconhecida para incluí-las na estimativa da dose. Na próxima página, revise a descrição e as propriedades do modelo de seleção de imagem aplicado durante a geração da curva de calibração. Cada amostra deve ser analisada utilizando o mesmo modelo.Ao estimar a dose de uma amostra exposta a uma quantidade desconhecida de radiação, recomendamos fortemente que o mesmo modelo de seleção de imagem seja aplicado a esses dados, correspondendo ao modelo utilizado na geração da curva de calibração de dose. Na próxima página, certifique-se de que o mesmo valor de Sigma SVM usado durante a geração da curva de calibração preencha os campos. Faça correções, se necessário.Na página final, revise todas as opções selecionadas. Se elas estiverem corretas, finalize o processo de seleção e pressione OK na janela predefinida do calculador de dose para realizar a estimativa de dose. Os resultados da estimativa de dose são exibidos na janela de console em formato de tabela para cada amostra de teste em grays.Junto com os dados tabulares, serão exibidos gráficos dos dados mostrados na área de plotagem. Após inserir uma amostra, preparar sua curva de calibração ou estimar uma dose, é aconselhável gerar um relatório de amostra, de curva ou de dose para criar um registro completo de sua análise. Agora, gere um Relatório de Estimativa de Dose.Quando solicitado, forneça um nome para o relatório ou use a opção de navegação para modificar uma pasta de relatório existente. As capacidades de auditoria, problemas de integridade do arquivo de log e opções estatísticas são analisadas no protocolo textual. O software foi testado usando amostras de imagens citogenéticas expostas à radiação ionizante obtidas dos laboratórios de biodosimetria da Health Canada e dos Canadian Nuclear Laboratories.Essas amostras foram geradas e analisadas manualmente por especialistas em ambos os laboratórios. O software utilizou filtros automatizados de seleção de imagens nas amostras para eliminar uma grande variedade de imagens inutilizáveis. No exemplo atual, as 250 melhores imagens foram automaticamente selecionadas para cada amostra.C foi excluído porque continha cromossomos sobrepostos em excesso, e D possui um número excessivo de cromátides-irmãs separadas. O software pode classificar incorretamente alguns objetos como cromossomos dicêntricos, como o objeto dois. Isso infla as contagens de dicêntricos nas amostras.Os filtros de falsos positivos excluem esses objetos dos cálculos da frequência de dicêntricos. Após a filtragem, as ocorrências de cromossomos dicêntricos em uma população de células de uma amostra irradiada seguem uma distribuição de Poisson, em comparação com o conjunto de dados não filtrado. As estatísticas de qui-quadrado de adequação ao modelo mostraram que os resultados provenientes dos dados filtrados são muito mais confiáveis.No final das contas, as medições automatizadas estavam dentro de 0,3 cinza das doses pontuadas manualmente, com algumas exceções. Uma amostra que apresentou baixa qualidade de ajuste à distribuição de Poisson não foi precisa. Essa era uma amostra de qualidade inferior.Continha muitas imagens com cromossomos dicêntricos incorretamente classificados, resultantes da separação de cromátides-irmãs. No entanto, os resultados da análise automatizada ainda estavam dentro dos limites de triagem especificados pela AIEA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o software para selecionar automaticamente imagens ideais utilizando modelos de seleção de imagens, criar curvas de calibração, realizar a detecção automatizada de cromossomos dicêntricos na estimativa de dose de radiação e gerar relatórios.Uma vez dominada, esta técnica pode estimar a dose de uma amostra contendo 500 imagens em metáfase em 10 a 20 minutos a partir de um conjunto existente de imagens de células em metáfase. É importante lembrar de utilizar a funcionalidade automatizada fornecida pelo software. A seleção manual de imagens é possível.No entanto, fazer isso reduz a eficiência e pode não ser tão reproduzível quanto os procedimentos automatizados. Esta técnica permitirá que pesquisadores na área de biodosimetria explorem novas questões na pesquisa de radiação envolvendo estudos populacionais que anteriormente não poderiam ser realizados de forma prática.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Estamos desenvolvendo uma técnica de exposição dinâmica adaptativa utilizando o nosso sistema digital de varredura do feixe de raios-X. Em vez de expor um objeto de maneira uniforme, a exposição é adaptada dependendo da opacidade do objeto. Aqui nós mostramos um experimento sobre um fantasma antropomórfico, que resultou em uma economia dose de 30%.

X-ray através da redução da dose de exposição Adaptive em Imaging fluoroscópicas

Um número cada vez maior de dispositivos de terapia de radiação oferecem a vantagem de proporcionar a dose muito pequenas através de vigas para o tumor, permitindo uma maior conformidade e doses mais altas por fracção. Muitos detectores diferentes pode ser usado para a dosimetria desses pequenos campos. No presente estudo, o efeito da recombinação de iões é investigada para uma câmara de ionização líquida, usando um sistema de radioterapia estereotáxica.

Caracterização dos Efeitos de recombinação em uma Câmara de ionização líquido usado para a dosimetria de um Acelerador Radiosurgical

Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Este protocolo detalha a preparação clinicamente implementável de biosamples de PBMC e plasma de alta qualidade no local do ensaio clínico que pode ser usado para análise de biomarcadores translacionais.

Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

Este documento descreve um novo protocolo de dosimetria para irradiações celulares usando equipamentos de raio-X de baixa energia. As medições são realizadas em condições que simulam condições reais de irradiação celular, tanto quanto possível.

Dosimetria para Irradiação Celular usando instalações de raios-X ortovoltage (40-300 kV)

A dosimetria de radiação fornece uma técnica para aumentar a precisão dos experimentos pré-clínicos e garantir que as doses de radiação fornecidas estejam intimamente relacionadas aos parâmetros clínicos. Este protocolo descreve medidas a serem tomadas em cada fase durante experimentos de radiação pré-clínico para garantir o design experimental adequado.

Comissionamento irradiador e dosimetria para avaliação de parâmetros de α e β de LQ, esquema de dosagem de radiação e depoimento de dose in vivo

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

O fluxo de trabalho de citomorfologia digital automatizada do sangue periférico e da medula óssea é descrito. Após preparação padronizada da esfregação e coloração, um scanner captura imagens de amostras. Softwares com IA localizam, registram e classificam preliminarmente células nucleadas, seguidos por revisão de especialistas. O foco está em classificações celulares críticas erradas com potencial para diagnóstico equivocado.

Fluxo de trabalho para citomorfologia digital automatizada de sangue periférico e medula óssea, com consideração de classificações celulares críticas erradas

Aprenda a estimar dose de radiação biológica usando o software ADCI para identificação automatizada de cromossomos dicêntricos em imagens de células em metáfase. Este método acelera a biodosimetria.

Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose

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