Avaliar defeitos de obstrução do trato urinário junção por injeção de corante azul de metileno

O objetivo geral deste procedimento é determinar as obstruções das junções do trato urinário por meio da injeção de corante de metileno nos rins. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento do rim e do trato urinário inferior, como a conexão da bexiga uretal. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método simples para visualizar a estrutura do trato urinário no pior dos casos de desenvolvimento de massa, permitindo a análise do desenvolvimento do trato urinário.

Para iniciar o experimento, meça 0,1 grama de pó de azul de metileno. Dissolva o azul de metileno em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS e vortex a mistura. Em seguida, filtre a solução de azul de metileno de 10 miligramas por mililitro com um filtro de seringa para eliminar o entupimento durante a injeção.

Em seguida, monte um conjunto de veias estéreis do couro cabeludo com uma seringa descartável de três mililitros e encha a seringa com três mililitros de solução filtrada de azul de metileno. Limpe as tesouras e pinças de dissecação com 70% de etanol. Para coletar embriões perinatais em E18.5 ou E19.5, primeiro eutanasiar camundongos prenhes usando inalação de dióxido de carbono.

Em seguida, realize a luxação cervical de acordo com as diretrizes do NIH. Em seguida, pulverize etanol 70% na superfície abdominal ventral do animal. Em seguida, usando a tesoura de dissecação estéril e fórceps, abra a cavidade abdominal ventralmente.

Levante todo o útero e separe-o do corpo nas pontas dos chifres uterinos. Em seguida, enxágue todo o útero com 1x PBS em uma placa de Petri. Corte o útero segmentalmente com uma tesoura de dissecação e remova a decídua placentária com uma pinça de dissecação para expor os embriões e sacos vitelinos.

Remova o saco vitelino primeiro e, em seguida, remova a membrana amniótica com uma pinça de dissecação para liberar os embriões perinatais. Decapite o embrião com uma tesoura de dissecação. Prenda o embrião com sua superfície ventral para cima em um microscópio de dissecação equipado com uma câmera digital para imagens.

Colete sua cauda para genotipagem. Usando uma pinça, rasgue cuidadosamente a pele para abrir a cavidade abdominal do embrião. Em seguida, remova cuidadosamente o excesso de órgãos e tecidos, como fígado, estômago e intestinos, com uma pinça, cortando-os ou puxando-os para fora para expor os rins, os ureteres e a bexiga que estão localizados dorsalmente.

Absorva o excesso de sangue do embrião dissecado com compressas de gaze estéreis e continue a injeção de corante. Remova as bolhas na agulha e no tubo expelindo a solução de azul de metileno da ponta da agulha por pressão hidrostática. Levante a seringa que contém a solução de corante acima do nível da ponta da agulha para iniciar o fluxo.

Em seguida, abaixe a seringa para interromper o fluxo. Em seguida, insira a agulha na pelve renal perto do ureter proximal, tomando cuidado para não perturbá-la depois de colocada. Realize a injeção de corante em um rim para determinar sua obstrução do trato urinário.

Após a inserção de uma agulha na pelve renal, o sucesso deste teste deve ser inserida uma agulha na pelve renal em direção ao ureter, sem passar pelo rim nem em direção ao vaso sanguíneo. Levante a seringa cerca de 20 centímetros para fornecer pressão hidrostática e deixe fluir 15 a 16 microlitros da solução corante. Em seguida, monitore a cor azul do corante, começando primeiro na pelve renal, depois no comprimento do ureter e, finalmente, no lúmen da bexiga.

Coloque a seringa para baixo para interromper o fluxo de corante e remova a agulha do rim. Faça um registro da hidronefrose do rim, hidroureter e a posição final da solução de corante em um caderno de laboratório. Por fim, execute a injeção do rim contralateral e deixe o corante fluir por 20 segundos no total.

Tire imagens do rim, do ureter e da bexiga traçadas com solução de corante usando a câmera e o programa de imagem conectado a um microscópio estéreo. Após a injeção em um rim, o corante azul de metileno flui da pelve renal através do ureter e para a bexiga, resultando em uma cor azul visível no ureter e no lúmen da bexiga. Um azul mais forte aparece no lúmen da bexiga devido a um fluxo mais longo cerca de 20 segundos após a injeção de ambos os rins com corante, indicando a ausência de obstrução da junção do trato urinário no segundo sistema urinário.

Ao injetar um hidroureter anormalmente dilatado, a posição final da solução de corante não é clara. E a obstrução da junção ureterovesical ou UVJO não pode ser verificada apesar da ausência do corante no lúmen da bexiga porque o hidroureter anormal foi danificado no meio. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de calcular os embriões perinatais do saco corante para obter o sistema urinário intacto.

E remova as bolhas para não bloquear o fluxo de corante.