Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60

O objetivo geral deste procedimento é observar os efeitos do esgotamento de genes específicos de interesse na migração celular. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave na metástase do câncer, como a migração de células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que a migração celular dinâmica seja monitorada em tempo real.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez, quando estávamos observando mudanças na morfologia celular do paciente com TIP60, um supressor de tumor. Comece semeando um milhão de células epiteliais da mama em três mililitros de meio de cultura por placa de 10 centímetros. Adicione 20 minutos de mistura SRINA incubada em temperatura ambiente gota a gota à cultura de células experimental.

Agite manualmente os dois pratos para garantir que as células estejam distribuídas uniformemente antes de colocá-las em uma incubadora de 37 graus Celsius. Após seis horas, substitua os sobrenadantes por oito mililitros de meio de cultura fresco por prato e retorne as culturas à incubadora. Na manhã seguinte, substitua os sobrenadantes por três mililitros de meio de cultura fresco por placa e adicione um segundo adesivo de mistura de SIRNA à cultura de células experimental, como acabamos de demonstrar, agitando a placa para garantir que os reagentes estejam totalmente misturados antes de retornar as células à incubadora.

Em seguida, substitua os sobrenadantes por oito mililitros de meio de cultura fresco após seis horas e incube as culturas durante a noite. No terceiro dia, lave as células uma vez com dois mililitros de BPS por placa e retire as células em ambas as placas com um mililitro de tripson EDTA por prato por 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, pare a reação com quatro mililitros de meio de cultura completo por placa.

Ressuspender as células pipetando e transferir as suspensões celulares para tubos individuais de 15 mililitros. Coletar as células por centrifugação e ressuspender os pellets em cinco mililitros de meio isento de soro por tubo. Após a contagem, dilua ambas as culturas de células para uma concentração de 600.000 células por mililitro e adicione 500 microlitros de células de cada cultura a um poço de uma placa de 24 poços para garantir 100% de confluência.

Quando todas as células tiverem sido semeadas, agite suavemente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme e coloque a placa na incubadora de cultura de células por 24 horas. Para verificar a eficiência de knockdown do gene de interesse, colete as células restantes nos tubos de coleta com outra centrifugação e isole o RNA dos pellets, usando um reagente comercial de acordo com as instruções do fabricante para avaliação quantitativa de PCR em tempo real. Na manhã seguinte, pelo menos uma hora antes de iniciar a imagem de células vivas, ligue o microscópio e o controle de temperatura.

Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o suprimento de gás dióxido de carbono para 5%Quando a câmara atingir 37 graus Celsius, use microscopia de contraste de fase para confirmar se as células estão confluentes e totalmente presas ao fundo dos poços. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para arranhar suavemente uma linha reta em todo o comprimento do centro de cada poço e lave suavemente todos os poços cinco vezes com meio livre de soro para remover as células destacadas. Após a última lavagem, adicione um mililitro de meio livre de soro a cada poço.

Coloque a placa no microscópio stage sob a objetiva de 10 potências e direcione a luz emitida para as oculares em vez da câmera. Ajuste manualmente o foco para localizar cada ferida e as células ao seu redor. Em seguida, retorne a luz emitida de volta para a câmera e use um sistema de observação de células vivas para marcar a posição das feridas e definir as condições de tempo.

Visualize as células para o período de experimento apropriado, abra o primeiro vídeo avi no software de imagem apropriado e abra o plug-in m track j. Clique na guia adicionar para adicionar uma trilha para as células individuais e escolha uma célula na ponta da frente invasiva e uma célula que possa migrar por conta própria. Siga o movimento das células escolhidas no vídeo usando mtrackJ para rastrear seu tráfego.

Em seguida, clique na guia de medição para medir a distância do movimento da célula e salve os vídeos com as faixas no formato avi. Após a depleção de TIP60, as células epiteliais da mama são mais mesenquimais em comparação com as células cultivadas de controle. De fato, a expressão de TIP60, bem como a expressão da molécula de adesão de células epiteliais, diminui significativamente após o tratamento com siTIP60.

Por outro lado, a expressão de genes específicos do condutor de transição epitelial para mesenquimal é aumentada após a depleção de TIP60. A imagem ao vivo das culturas de células após a administração da ferida demonstra uma migração celular mais rápida das células tratadas com siTIP60, em comparação com as culturas siControl, com um aumento significativo na porcentagem de células migratórias observadas em resposta à depleção de TIP60. Além disso, as células siControl se movem como uma folha, enquanto mais movimento de célula única é observado nas culturas siTIP60.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar uma técnica de imagem de células vivas para monitorar mudanças dinâmicas na migração celular.