Name: Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda a induzir lesão retiniana focal por laser em Danio rerio e monitorar mudanças celulares in vivo. Este método permite estudar regeneração retinal e respostas das células de Müller glia em tempo real.

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Agradecemos Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD pela sua entrada de científica no que estabelece o modelo e Federica Bisignani pela sua excelente assistência técnica.

todos os experimentos aderiu à instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisas da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e respeitar os regulamentos relacionados das autoridades governamentais.
 1. animais <ol><li>TgBAC manter (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 estirpe de (AB) com idade entre 6-9 meses em condições normais na água com uma temperatura de 26,5 ° C e um ciclo claro/escuro de 14/10 h 18.</li>
	<li>Seguir as orientações de cuidados com animais das instituições envolvidas para as experiências em animais após aprovação pelas autoridades governamentais.</li>
</ol> 2. Anestesia sistêmica reversível <ol><li>Prepare a solução-mãe de sal de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato etílico (tricaina) dissolvendo-se 400 mg de pó tricaina em 97,9 mL de água do aquário e 2,1 mL de 1 M de Tris tampão salino (TBS). Ajustar o pH 7.0 com 1 M Tris (pH 9) e loja a 4 ° C, no escura acima de um mês. 
	Nota: Tricaina deve ser preparada em água como as condições de vida natural do animal, de preferência água de tanque original deve ser usada.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe 01:25 na água do tanque e use imediatamente.</li>
	<li>Colocar o zebrafish em uma placa de Petri contendo 50 mL de solução de anestesia, até que eles ficam imobilizados e não respondem aos estímulos externos (aproximadamente 2-5 min, dependendo do peso e idade) de 10 cm.</li>
	<li>Transferir cada peixe com a mão a um titular de pin de silicone feito sob medida para o tratamento a laser ( figura 1A). 
	CUIDADO! Os peixes podem permanecer anestesiados fora do tanque para até 10 min só.</li>
	<li>Para reverter anestesia após o tratamento e/ou imagem, coloque o peixe-zebra no recipiente contendo água de tanque.</li>
	<li>Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.</li>
</ol> 3. Lesão Focal na Retina a laser Nota: A 532 nm laser diode é usado para criar danos focais de luz na retina do zebrafish. A montagem experimental do laser permite o estabelecimento de uma lesão da retina focal pode ser reproduzido no zebrafish adulto.
<ol><li>Configurar a potência de saída do laser: 70 mW; diâmetro de antena: 50 µm; a duração do pulso: 100 ms. cuidado! O uso do laser requer proteção pessoal apropriada e rotulagem da área de.</li>
	<li>Aplicar 1-2 gotas de hidroxipropilmetilcelulose 2% topicamente no olho antes do tratamento e usar uma lente de laser do fundo de 2,0 mm para concentrar o feixe do laser-com o objetivo na retina. 
	CUIDADO! gotas de hidroxipropilmetilcelulose são viscosas e pode causar problemas em respirar se continua as brânquias.</li>
	<li>Pontos de laser lugar quatro em torno do nervo óptico à esquerda do olho e usar o olho direito, tratado como controle interno.</li>
</ol> 4. Na vivo Imagem latente da morfologia retiniana <ol><li>no dia 0, Visualizar a retina zebrafish diretamente após a indução do laser sem revivê-los da anestesia. Em todos os outros pontos de tempo, empregar a anestesia geral (ver secção 2: anestesia sistêmica reversível). Coloque o zebrafish imobilizado em um suporte de pino de silicone feito sob medida ( Figura 1 B, b. 1).</li>
	<li>Para obter imagens ideais, cortar uma lente de contato do hydrogel comercialmente disponíveis para caber o olho de peixe-zebra (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, espessura de centro = 0,4 mm) por meio de um furador. Preencha a superfície côncava da lente com metilcelulose e coloque sobre a córnea.</li>
	<li>Equipar o sistema OCT com uma lente de lâmpada de fenda sem contato 78D.</li>
	<li>Foco imagem infravermelha (IR) no IR + modo OCT ( Figura 2A) para visualizar o fundo do olho e levar o IR fotos clicando o &#34; adquirir &#34; botão ( Figura 2B) para localizar o manchas na retina usando o sistema de laser &#39; software s.</li>
	Modo de <li>Visualize uma seção tridimensional das camadas da retina no OCT + IR e tirar as fotos, clicando o &#34; adquirir &#34; botão ( Figura 2B). Observar a gravidade da lesão na camada nuclear externa (ONL) (ver secção 3: lesão focal na retina a Laser) nestas imagens.</li>
	<li>Reverter anestesia, após o tratamento e/ou imagem de lugar o zebrafish em um recipiente contendo água de tanque.</li>
	<li>Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.</li>
	<li>Executar semelhante na vivo imagens da morfologia da retina no dia 1, 3, 7, 14 e semana 6.</li>
</ol> 5. Hematoxilina &#38; eosina (H &#38; E) coloração <ol><li>eutanásia zebrafish por submersão em frio (4 ° C) solução de anestesia no gelo pelo menos 10 min e enucleate os olhos imediatamente, por meio de pequenas pinças curvas.</li>
	<li>Corrigir os olhos todo em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C para 20 h e desidrata-se em seguida as amostras em uma série gradual do álcool (xileno 100% por 5 min duas vezes, etanol 100% por 5 min duas vezes, etanol 96% por 3 min duas vezes e etanol 70% 3 mi n uma vez). 
	CUIDADO! PFA pode ser irritante para os olhos, nariz e faixa respiratória superior. PFA é um conhecido carcinógeno humano e um risco reprodutivo suspeito.</li>
	<li>Incorporar as amostras em parafina, corte 5 µm seções ao nível da cabeça do nervo óptico e montá-los em lâminas de vidro.</li>
	<li>Mancha as seções deparaffinized com solução de hematoxilina ácida 0,1% por 5 min e mergulhe os slides duas vezes em água destilada depois mergulhar as lâminas em uma mistura de ácido clorídrico (2 mL 25% HCl em 250 mL água destilada água) e amoníaco (amônia 25% 2 mL em 250 mL de mistura água destilada). Manchar as seções com eosina G solução aquosa 0,5% por 3 min após o desenvolvimento da coloração por água da torneira durante pelo menos 10 min. a hematoxilina</li>
	<li>Montar as lâminas desidratadas em meio de montagem de resina acrílica e observar as lâminas ao microscópio de luz.</li>
</ol> 6. Imuno-histoquímica para a ativação de MC <ol><li>aqueça as seções deparaffinized no buffer de recuperação de antígeno (Tris-EDTA + 0,05% de detergente não-iônico, pH 9.0) para 3 min em um navio apropriado ou um microondas por 10-15 min e lavar três vezes com TBS para 5 min cada.</li>
	<li>Círculo, as seções com um silicone pen e adicionar 100 µ l obstrui a solução (TBS + soro normal de cabra 10% + 1% albumina de soro bovino, pH 7,6) em temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Mancha com anticorpo policlonal de coelho de proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) e com antiglutamina sintetase (GS) anticorpo monoclonal de rato, ambos em uma diluição de 1: 200 (40 µ l por amostra). Incube o slide em uma câmara umidificado a 4 ° C durante a noite. Lavar três vezes com TBS + 0.1% Tween 20 por 5 min cada.</li>
	<li>Visualização de acabamento com o apropriado anticorpos secundários. Este protocolo utilizado uma cabra de anti-coelho IgG H &#38; anticorpo secundário L verde para GFAP e um anti-rato de cabra IgG H &#38; vermelho brilhante L para GS, ambos em uma diluição de 1: 500 em temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Montar as lâminas com meio de montagem contendo DAPI e observar os slides sob o microscópio de fluorescência.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Regeneração/degeneração da retina no zebrafish foi investigada por abordagens diferentes, como de morte celular mediada por cytotoxin22, lesão mecânica23e lesões térmicas24. Utilizamos um laser de díodo 532 nm para danificar a retina do zebrafish. Desse modo, nosso modelo oferece várias vantagens. Por exemplo, rapidamente criamos uma área bem definida de lesões localizadas na retina exterior, especificamente na camada de fotorreceptores. Além disso, ...

Visão é, provavelmente, o sentido mais essencial do ser humano e sua deficiência tem um alto impacto sócio-económico. No mundo industrializado, doenças degenerativas da retina representam a maioria da perda de visão e cegueira entre a população adulta de1. Retinite pigmentosa (RP) é a causa herdada mais comum de cegueira em pessoas entre as idades de 20 e 60, afetando aproximadamente 1,5 milhões de pessoas em todo o mundo2,3. É uma família heterogénea de desordens hereditárias da retina, caracterizada por perda progressiva dos FOTORRECEPTORES (PRs) seguido de degeneração do epitélio pigmentar da retina e, posteriormente, gliose e remodelação de neurônios interna4. O curso da doença pode ser explicado pela perda incremental a dois tipos de células PR, geralmente começando com as hastes, que são responsáveis pela visão acromática na penumbra e os cones, que são essenciais para cor visão e acuidade visual5. Um defeito único gene é suficiente para causar a RP. Até agora mais de 130 mutações em mais de 45 genes têm sido associadas com a doença6. Isto leva a diferentes fenótipos de doença e é uma razão que a terapia genética é não-generalizáveis e, portanto, uma abordagem terapêutica intrincada. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens terapêuticas gerais para tratar os degenerations retinais em cegueira doenças.
Degeneração da retina, muitas vezes envolve a perda do PR; Portanto, a morte celular de PR é uma característica dos processos degenerativos na retina7. Já foi demonstrado que a morte de célula PR estimula Müller glia célula (MC) ativação e proliferação8. MCs, o tipo de célula glial principais na retina vertebrado, foram considerados uma vez como nada mais do que uma "cola" entre os neurônios da retina. Nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado que os MCs agir como mais do que mera estrutural suportam9. Entre as diferentes funções, MCs também participem neurogênese e reparar10. Com efeito, em resposta a fatores diffusible da retina degeneração, MCs aumentam significativamente a expressão de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Portanto, GFAP rotulagem pode ser usado como um marcador para ativação de MC como uma resposta secundária a lesão da retina e degeneração11.
Recentemente, nós desenvolvemos uma adaptação do romance de lesões focais, usando um laser para induzir a degeneração da retina no peixe-zebra (Danio rerio). Lesão focal é vantajoso para o estudo de certos processos biológicos, como a migração de células no local da ferida e o momento exato de eventos que ocorrem durante a regeneração da retina12. Além disso, o zebrafish tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças entre o seu sistema visual e o dos outros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de humanos e teleósteos retinae exibem algumas diferenças. Por conseguinte, humanos e zebrafish retinae contêm as mesmas classes de célula principais organizadas no mesmo padrão em camadas, onde sensor de luz fotorreceptores ocupam a camada mais externa, enquanto os neurônios de projeção da retina, as células ganglionares, residem nas intimidades camada neuronal, proximal à lente. Os interneurônios da retina, o amacrine, bipolar e células horizontais, localizar-se entre o fotoreceptor e gânglio célula camadas13. Além disso, a zebrafish retina é cone-dominado e, portanto, mais próximo da retina humana que, por exemplo, a retina de roedor intensivamente estudada. Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é a neurogênese persistente na retina de peixe e regeneração da retina após danos. No zebrafish, MCs podem dedifferentiate e mediar a regeneração em retina lesada14,15. Frango, MCs têm alguma capacidade também para re-introduzir o ciclo celular e dedifferentiate. Após lesão da retina em peixes adultos, MCs adoptarem certas características do progenitor e células-tronco, migram para o tecido danificado da retina e produzem novos neurônios16. Gene expressão perfilação de mamíferos MCs revelou inesperadas semelhanças com progenitores da retina, e evidência de potencial neurogênica intrínseca de MCs no frango, roedores e retina humana está crescendo17. No entanto, porque a resposta regenerativa em aves e mamíferos é menor comparada com a resposta robusta em peixes não é ainda compreendida. Portanto, compreender os mecanismos de reparação endógena no zebrafish pode sugerir estratégias para estimular regeneração da retina em mamíferos e seres humanos. Empregar o mecanismo de reparação endógena de MCs como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de pacientes com degeneração da retina teria um impacto notável para a nossa sociedade.
Neste documento, nós fornecemos as etapas necessárias para empregar o modelo de degeneração/regeneração em pesquisa oftálmica. Primeiro enfocamos induzindo focal danos na retina marcante, em seguida, sobre as imagens dos eventos, desenvolvendo-se no local da lesão e finalmente revelador envolvimento dos MCs adjacentes. O protocolo geral é relativamente fácil de executar e abre uma grande variedade de possibilidades para avaliar a retina depois.

<table><tbody><tr><td>Solução de hematoxilina ácida</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, EUA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G solução aquosa 0,5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Suíça</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho para cabras H& L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Suíça</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Suíça</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de cabra</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Lente de contato de hidrogel</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Suíça</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>Tricaine-A5040</td><td>, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Alemanha</td><td>n.a.532</td> <td>nm laser</td></tr><tr><td>Mouse anticorpo monoclonal anti-GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha</td><td>n.a.Version</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal anti-GFAP para coelhos</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, EUA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de pino de silicone</td><td>Huco Vision AG Suíça</td><td>n.a.Corte</td> <td>à mão a partir do tapete de silicone da bandeja de esterilização em conformidade.</td></tr><tr><td>Lâmpada de fenda BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Suíça</td><td>n.a.Adaptador</td><td></td> de</tr> <tr><td>lâmpada de fenda</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, EUA</td><td>n.a.Superfrost</td><td></td></tr> <tr><td>Plus lâminas de vidro</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemanha</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Alemanha</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris tamponado com solução salina (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D lente de lâmpada de fenda sem contato</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, EUA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Lente laser de fundo de olho</td><td>Ocular Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Reino Unido</td><td>R2100-EU</td><td>Steamer</td></tr></tbody></table>

ativação de células da müller glia em um modelo de regeneração no zebrafish e degeneração retiniana induzida por laser

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é o potencial ao longo da vida da retina teleósteos para retina neurogênese e regeneração após danos graves. Investigar os caminhos de regeneração no zebrafish pode trazer novas perspectivas para desenvolver estratégias inovadoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina em mamíferos. Neste documento, enfocamos a indução de uma lesão focal da retina exterior no zebrafish adulto por meio de um laser de díodo 532 nm. Uma lesão localizada permite investigar os processos biológicos que ocorrem durante a degeneração da retina e regeneração diretamente na área de danos. Usando a tomografia de coerência óptica não-invasiva (OCT), fomos capazes de definir a localização da regeneração subsequente danificada área e monitor in vivo. Com efeito, imagens OCT produz imagens de alta resolução, transversais da retina zebrafish, fornecendo informações que anteriormente só existiam disponíveis com análise histológica. A fim de confirmar os dados de outubro em tempo real, realizaram-se cortes histológicos e resposta regenerativa após a indução da lesão da retina foi investigada por imuno-histoquímica.

OCT em tempo real: a fim de analisar o papel dos MCs na reparação da retina, usamos um modelo de lesão laser induzindo uma zona bem delineada de danos na retina zebrafish. O site do dano foi fotografado por meio da OCT na vivo pela primeira vez (dia 0) dentro de 60 minutos após a lesão (Figura 3). Para compensar o sistema ótico do olho de peixe, uma lente de contato feito por foi colocada sobre a córnea. Imediatamente após o tratamen...

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como monitorar alterações celulares in vivo após um dano retiniano focal induzido por laser em peixe-zebra. Este modelo pode ajudá-lo a responder perguntas-chave sobre a regeneração retiniana, tais como alterações morfológicas, cinética e tipos celulares envolvidos. A principal vantagem desta técnica é que, ao induzir uma lesão focal, os processos biológicos podem ser investigados diretamente no local da lesão.Embora este método possa fornecer informações sobre a regeneração da retina de Zebrafish, ele também pode ser aplicado para estudar o mecanismo de reparo em diferentes modelos animais. Prepare uma solução estoque de anestésico dissolvendo 400 miligramas de pó de tricaina em 97,9 milímetros de água de tanque e 2,1 milímetros de TBS um molar. Ajuste o pH para 7,0 com tris um molar em pH 9.Para preparar a solução de trabalho, dilua a solução estoque de tricaina na proporção de 1 para 25 em água de tanque e transfira 50 mililitros para uma placa de Petri. Em seguida, coloque os peixes-zebra na solução anestésica por dois a cinco minutos, até que fiquem imóveis e não respondam a estímulos externos. Transfira cada peixe manualmente para um suporte de silicone personalizado para o tratamento a laser.A anestesia apropriada é fundamental para o bem-estar do animal e para o sucesso do procedimento. Portanto, a solução fresca de tricaina é essencial, e o tempo fora da água não deve exceder muito os 10 minutos. Configure a potência de saída do laser de 532 nanômetros ajustado para 70 miliwatts, a duração do pulso para 100 milissegundos e o diâmetro aéreo para 50 mícrons.Em seguida, aplique uma a duas gotas de hidroxipropil metilcelulose a 2% no olho. Ao aplicar a metilcelulose no olho, certifique-se de que a solução viscosa não entre nas brânquias. A seguir, use uma lente de laser de fundo de 2 milímetros para focar o feixe de mira do laser na retina.Posicione quatro pontos laser ao redor do nervo óptico no olho esquerdo e use o olho direito, não tratado, como controle interno. Imediatamente após a indução a laser, posicione o peixe-zebra ainda anestesiado em um suporte de pinos de silicone especialmente fabricado na área de imagem. Para obter imagens ideais, corte uma lente de contato de hidrogel comercialmente disponível com um furador de modo que se ajuste ao olho do peixe-zebra.Cubra a superfície côncava da lente com metilcelulose e, em seguida, posicione-a sobre a córnea. Equipe o sistema de tomografia de coerência óptica com uma lente de lâmpada de fenda não contactante 78D. Foque a imagem infravermelha no modo IR mais OCT para visualizar o fundo do olho.Em seguida, obtenha as imagens de IR clicando no botão de aquisição para localizar os pontos do laser na retina. Depois, visualize uma seção tridimensional das camadas da retina no modo IR combinado com OCT e capture as imagens clicando no botão de aquisição. Observe a gravidade da lesão na camada nuclear externa nessas imagens.Para reverter a anestesia após o tratamento e a imagem, coloque os peixes-zebra em um recipiente contendo água do aquário. Para apoiar a recuperação, crie um fluxo de água fresca do aquário sobre as brânquias movendo os peixes-zebra para frente e para trás na água. Imediatamente após o tratamento a laser, um sinal hiper-reflexivo difuso foi localizado na retina externa.Estendia-se desde o epitélio pigmentado da retina até a camada plexiforme externa. O sinal hiperrefletivo difuso está ausente na retina do olho controle não lesado. Um sinal hiperrefletivo difuso semelhante foi detectado no primeiro dia após a lesão.Após o terceiro dia, esse sinal difuso tornou-se mais organizado e denso. Foi observado consistentemente na camada nuclear externa, estendendo-se até a camada de fotorreceptores. Após a primeira semana, houve uma diminuição significativa no tamanho médio da lesão, sendo detectado apenas um pequeno sinal hiper-refletivo.A partir do dia 14 até o ponto temporal mais tardio investigado, os pontos do laser deixaram de ser visíveis nas imagens de IR e OCT, e a morfologia da retina é comparável ao lado controle, visto aqui. A coloração com H&E foi empregada para investigar a extensão e a cinética da degeneração e regeneração retiniana. Esta imagem mostra a seção controle.Esta imagem mostra a coloração com H&E três dias após a lesão, quando a perda máxima de fotorreceptores é aparente. Foi realizada imunohistoquímica para visualizar os marcadores de células gliais, sintetase da glutamina, em vermelho, e proteína ácida fibrilar glial, em verde. Esta imagem mostra uma retina controle onde há pouca fluorescência verde, o que é indicativo de GFAP.O sinal de GFAP foi regulado para cima no terceiro dia após a lesão, enquanto o sinal vermelho da glutamina sintetase permaneceu inalterado. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de dois fótons, bem como análises celulares e moleculares, podem ser realizados para estudar o envolvimento de células moleculares nos mecanismos endógenos de reparo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir danos focais à retina de peixe-zebra e monitorar in vivo os processos degenerativos e regenerativos subsequentes.

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um procedimento para induzir degeneração da retina em peixes-zebra adultos usando lesão a laser. O laser tem como alvo as células fotorreceptoras da retina, desencadeando a morte celular e um processo degenerativo. Esse dano ativa as células da glia de Müller (MG), levando à sua desdiferenciação em progenitores de células-tronco que auxiliam na regeneração da retina.

Modelagem da degeneração e regeneração da retina em peixe-zebra usando uma lesão focal a laser

Fonte: Lahne, M., et.al. Cultura de explantes retinianos de peixe-zebra transgênicos adultos para imagens de células vivas por microscopia multifotônica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra imagens de células vivas da migração nuclear glial de Muller em explantes retinianos de peixe-zebra embebidos em agarose após danos por fotorreceptores induzidos por luz. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) liberado por fotorreceptores danificados ativa as células gliais de Muller, desencadeando a...

Imagem de células vivas da migração nuclear glial de Muller durante a regeneração da retina do peixe-zebra

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Aqui demonstramos quantificação de mento de retina e de regeneração e seu impacto na função visual usando N-metil-N -nitrosourea no peixe-zebra adulto. Perda da acuidade visual e um decréscimo no número de fotorreceptores foram seguidos por proliferação na camada nuclear interna. Regeneração morfológica e funcional completa ocorreu 30 dias após o tratamento inicial.

Metilnitrosouréia (MNU) induzida Retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais

Manipulações direcionadas para causar estresse direcionado ou morte em células individuais têm sido relativamente difíceis de realizar. Aqui, uma abordagem de ablação com resolução de célula única para estressar e matar seletivamente células individuais em cultura de células e animais vivos é descrita com base em um laser UV confocal padrão.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Aprenda a induzir lesão retiniana focal por laser em Danio rerio e monitorar mudanças celulares in vivo. Este método permite estudar regeneração retinal e respostas das células de Müller glia em tempo real.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

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