Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como monitorar as alterações celulares in vivo após um dano retiniano focal induzido por laser no peixe-zebra. Este modelo pode ajudá-lo a responder a questões-chave da regeneração da retina, como alterações morfológicas, cinética, bem como tipos de células envolvidas. A principal vantagem dessa técnica é que, ao induzir uma lesão focal, os processos biológicos podem ser investigados diretamente no local da lesão.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a regeneração da retina do peixe-zebra, ele também pode ser aplicado para estudar o mecanismo de reparo em diferentes modelos animais. Prepare uma solução estoque de anestésico dissolvendo 400 miligramas de pó de tricaína em 97,9 milímetros de água do tanque e 2,1 milímetros de TBS de um molar. Ajuste para pH 7,0 com um tris molar em pH 9.

Para fazer a solução de trabalho, dilua a solução estoque de tricaína de 1 a 25 em água do tanque e transfira 50 mililitros para uma placa de Petri. Em seguida, coloque o peixe-zebra na solução anestésica por dois a cinco minutos até que fique imóvel e não responda a estímulos externos. Transfira cada peixe manualmente para um suporte de alfinete de silicone feito sob medida para tratamento a laser.

A anestesia adequada é fundamental para o bem-estar do animal e o sucesso do procedimento. Portanto, a solução de tricaína recém-preparada é fundamental e o tempo fora da água não deve exceder 10 minutos. Configure a potência de saída do laser discado de 532 nanômetros para 70 miliwatts, a duração do pulso para 100 milissegundos e o diâmetro da antena para 50 mícrons.

Em seguida, aplique uma a duas gotas de 2% de hidroxipropilmetilcelulose no olho. Ao aplicar metilcélula no olho, certifique-se de que a solução viscosa não entre nas brânquias. Em seguida, use uma lente laser de fundo de olho de 2 milímetros para focar o feixe de mira do laser na retina.

Coloque quatro pontos de laser ao redor do nervo óptico no olho esquerdo e use o olho direito, não tratado, como controle interno. Imediatamente após a indução do laser, coloque o peixe-zebra ainda anestesiado em um suporte de pino de silicone personalizado na área de imagem. Para obter imagens ideais, corte uma lente de contato de hidrogel disponível comercialmente para se ajustar ao olho do peixe-zebra por meio de um furador.

Preencha a superfície côncava do cristalino com metilcelulose e coloque-a sobre a córnea. Equipe o sistema de tomografia de coerência óptica com uma lente de lâmpada sem contato 78D. Focalize a imagem infravermelha no modo IR mais OCT para visualizar o fundo do olho.

Em seguida, tire as fotos IR clicando no botão adquirir para localizar os pontos de laser na retina. Em seguida, visualize uma seção tridimensional das camadas da retina no modo IR mais OCT e tire as fotos clicando no botão adquirir. Observe a gravidade da lesão na camada nuclear externa nessas imagens.

Para reverter a anestesia após o tratamento e a imagem, coloque o peixe-zebra em um recipiente contendo água do tanque. Para apoiar a recuperação, crie um fluxo de água fresca do tanque sobre as brânquias, movendo o peixe-zebra para frente e para trás na água. Imediatamente após o tratamento com laser, um sinal hiper-reflexivo difuso foi localizado na retina externa.

Estendia-se do epitélio pigmentado da retina até a camada plexiforme externa. O sinal hiper-reflexivo difuso está ausente na retina do olho controle não lesionado. Um sinal hiper-reflexivo difuso semelhante detectado no primeiro dia após a lesão.

Após o terceiro dia, esse sinal difuso tornou-se mais organizado e denso. Foi consistentemente visto na camada nuclear externa, estendendo-se para a camada fotorreceptora. Após a primeira semana, houve uma diminuição significativa no tamanho médio da lesão, e apenas um pequeno sinal hiper-reflexivo foi detectado.

A partir do dia 14 até o último ponto de tempo investigado, os pontos de laser não eram mais visíveis nas imagens de infravermelho e OCT, e a morfologia da retina é comparável ao lado de controle, visto aqui. A coloração H & E foi empregada para investigar a extensão e a cinética da degeneração e regeneração da retina. Esta imagem mostra a seção de controle.

Esta imagem mostra a coloração de H & E três dias após a lesão, quando a perda máxima dos fotorreceptores é aparente. Foi realizada imuno-histoquímica para visualização dos marcadores de células gliais, glutamina sintetase, em vermelho, e proteína glial fibrilar ácida, em verde. Esta imagem mostra uma retina de controle onde há muito pouca fluorescência verde, o que é indicativo de GFAP.

O sinal GFAP foi regulado positivamente no terceiro dia após a lesão, enquanto o sinal da glutamina vermelha sintetase permaneceu inalterado. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de dois fótons, bem como análises celulares e moleculares, podem ser realizados para estudar o envolvimento de células moleculares em mecanismos de reparo endógeno. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir danos focais à retina do peixe-zebra e monitorar in vivo os seguintes processos degenerativos e regenerativos.