Preparação do hidrogel injetável à base de quitosana e sua aplicação em cultura de células 3D
September 29th, 2017
Aqui nós descrevemos uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana usando química imina dinâmico. São apresentados métodos para ajustar a força mecânica do hidrogel e sua aplicação em cultura de células 3D.
O objetivo geral deste protocolo é preparar um hidrogel de quitosana injetável para cultura de células tridimensionais para uso em tratamentos terapêuticos. Este método pode responder a perguntas no campo do hidrogel auto-regenerativo, como como fazer um hidrogel auto-regenerativo imergindo todo o caminho e como usá-lo para cultura de células 3D. A minha vantagem desta técnica é que, por meio de hidrogel auto-regenerativo compatível, pode ser preparado de uma forma muito simples, e o uso de uma cultura de células 3D.
Este hidrogel também é injetável, por isso pode ser usado como transportador para terapia celular. Agora o Sr. Yongsan Li mostrará como fazer o hidrogel e como fazer a cultura de células 3D usando este hidrogel. Yongsan Li é nosso aluno de pós-graduação em nosso laboratório.
Para fazer os hidrogéis, primeiro sintetize DF PEG. Em uma capela de exaustão, pesar quatro gramas de peso molecular 4.000 PEG em um balão de fundo redondo e adicionar 100 mililitros de tolueno. Em seguida, para dissolver os polímeros, aqueça a solução.
Depois que todos os polímeros se dissolverem, use um evaporador para remover todos os solventes. Em seguida, repita o processo de misturar tolueno e evaporar mais duas vezes para preparar os polímeros PEG secos. Em seguida, usando um agitador magnético e 100 mililitros de DHF, dissolva os polímeros.
Em seguida, dissolva 0,9 gramas de 4-carboxibenzaldeído na solução. Em seguida, dissolva 0,07 gramas de dimetilaminopirimida na solução. Agora adicione 1,25 gramas de DCC em um tubo de secagem cheio de cloreto de cálcio anidro.
Agora deixe a reação agitar em temperatura ambiente por cerca de 12 horas. No dia seguinte, use 500 mililitros de éter dietílico frio para precipitar os sólidos brancos e use a filtragem a vácuo para coletar os sólidos. Descarte o soluto e seque os sólidos sob boa ventilação.
Em seguida, dissolva os sólidos brancos em 100 mililitros de THF. Quaisquer sólidos brancos insolúveis devem ser filtrados antes de prosseguir. Agora precipite os sólidos dissolvidos usando éter dietílico fresco e frio.
Em seguida, use a filtragem a vácuo para coletar os sólidos e deixe-os secar novamente. Repita esse processo duas a três vezes e, em seguida, coloque os sólidos brancos em um forno de secagem a vácuo para secá-los completamente. O pó branco resultante é o produto final: DF PEG terminado em benzaldeído.
Para encapsular as células no hidrogel para cultura, primeiro dissolva 0,44 gramas de DF PEG em dois mililitros de meio de crescimento celular em um tubo de quatro mililitros. Vortex a mistura em uma solução de 20% em peso. Em seguida, esterilize a solução.
Carregue-o em uma seringa de 10 mililitros e pressione-o através de um filtro retentor de bactérias de 0,22 mícron. Agora misture 0,165 gramas de glicol-quitosana com quatro mililitros de meio de cultura de células, usando um vórtice para fazer uma solução de quitosana a 4% em peso. Em seguida, esterilize a solução usando outro filtro retentor de bactérias de 0,22 mícron.
Em seguida, colha as células, como as células L929 usando tripsina. Lave as células coletadas e ressuspenda-as em meio a 3,75 milhões de células por mililitro. Na etapa seguinte, as células são plantadas em uma matriz 3D.
Seguir essas etapas com precisão é fundamental para produzir sucesso. Agora misture 0,4 mililitros da suspensão celular com 0,4 mililitros de solução de quitosana usando um vórtice. Pipete essa mistura no centro de uma placa de Petri de dois centímetros de diâmetro e pipete 0,2 mililitros da solução DF PEG na placa.
Em seguida, use uma tubulação suave para induzir a formação do hidrogel. Avalie a formação do hidrogel inclinando o prato e observando a viscosidade da solução. Para testar a injetabilidade das células encapsuladas, faça a mesma preparação em uma seringa de 10 mililitros.
Então, depois que o hidrogel se formar, expulse lentamente o hidrogel através de uma agulha de calibre 48 para a placa de Petri. Em seguida, adicione um mililitro de meio de cultura à mistura de células de hidrogel na placa e transfira a placa para uma incubadora para cultura. A cada dois dias, troque a mídia, sobrepondo a cultura de células de hidrogel 3D.
Para preparar as células encapsuladas em hidrogéis para imagem, primeiro enxágue os hidrogéis com um mililitro de PBS duas vezes. Em seguida, corar os hidrogéis com solução de diacetato de fluoresceína e solução de iodeto de propídio. Sobreponha 0,5 mililitros de ambas as soluções no hidrogel e incube o hidrogel por 15 minutos em temperatura ambiente.
Após a breve incubação com as soluções corantes, aspire todos os solventes. Agora observe os hidrogéis usando microscopia confocal, com excitação a 488 nanômetros para visualizar células vivas e excitação a 543 nanômetros para visualizar células mortas. Colete pilhas de imagens com fatias de dois mícrons para validar a distribuição das células no hidrogel.
Células L929. Uma linha celular típica de fibra de vidro de camundongo com uma rigidez tecidual em ambiente in vivo de cerca de 5.600 Pascals foi encapsulada em um hidrogel. Sua viabilidade foi extremamente alta durante todo o processo de cultura e eles alcançaram uma densidade celular notável.
Após sete dias de cultura no hidrogel, o número de células aumentou em 200% Os hidrogéis que foram expelidos para sua placa de cultura de células através de uma agulha de calibre 48 podem se autocurar para reformar um hidrogel integrado após cerca de uma hora. Após sete dias em cultura, essas células também proliferaram dramaticamente. Evidências podem ser encontradas de eventos de fissão celular em que algumas células apareceram divididas em duas.
O ensaio de mortos-vivos mostrou viabilidade muito alta, demonstrando a proliferação celular bem-sucedida no hidrogel 3D após a injeção. Essa taxa de proliferação celular foi de cerca de 3/4 da das células não injetadas após sete dias de cultivo. Portanto, embora a força pura durante a injeção tenha um efeito negativo mensurável, as células injetadas ainda eram bastante proliferativas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve saber como preparar um hidrogel auto-regenerativo e como usar este hidrogel para cultura de células 3D e como entregar a célula com este hidrogel. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se executada corretamente. Após o melhor procedimento, outro método, como injeção in vivo para terapia celular ou administração de medicamentos, pode ser realizado.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para preparar hidrogéis injetáveis à base de quitosana usando química dinâmica de iminas. O foco está em ajustar a resistência mecânica do hidrogel para aplicações em cultura de células tridimensional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomateriais
- Hidrogéis
- Cultura de Células
Fundo
- A quitosana é um biopolímero com potencial em aplicações biomédicas.
- Hidrogéis injetáveis podem facilitar terapias minimamente invasivas.
- Modelos de cultura de células 3D são cruciais para estudar comportamentos celulares.
- Propriedades de autocura melhoram a funcionalidade dos hidrogéis.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método simples para criar hidrogéis de quitosana injetáveis.
- Explorar a aplicação desses hidrogéis na cultura de células 3D.
- Investigar as capacidades de autocura dos hidrogéis.
Métodos Utilizados
- Química dinâmica de iminas para preparação do hidrogel.
- Ajustes na resistência mecânica através de mudanças na formulação.
- Aplicação de hidrogéis em configurações de cultura de células 3D.
- Demonstração do processo de preparação por um estudante de pós-graduação.
Principais Resultados
- Os hidrogéis exibiram propriedades mecânicas ajustáveis.
- A aplicação bem-sucedida em cultura de células 3D foi demonstrada.
- Características de autocura foram confirmadas.
- O método provou ser simples e eficaz.
Conclusões
- Hidrogéis à base de quitosana podem ser facilmente preparados para uso biomédico.
- Esses hidrogéis são adequados para aplicações em terapia celular.
- O estudo contribui para o campo de materiais autocurativos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables the rapid preparation of injectable, self-healing chitosan hydrogels for 3D cell culture, offering a tunable platform that mimics physiological tissue stiffness. The dynamic imine chemistry allows for adjustable gelation kinetics and mechanical properties, supporting reproducible encapsulation of cells such as L929 fibroblasts. This approach addresses early-stage challenges in biomaterial design by providing a versatile, biocompatible system for evaluating cell behavior in a controlled 3D microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular responses in a tunable 3D matrix that mimics native tissue stiffness (~5,600 Pa), supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Facilitates rapid hydrogel formation at room temperature within minutes, allowing high-throughput preparation of standardized 3D culture systems.
- Predictive Value: Self-healing and injectable properties enable assessment of cell resilience under mechanical stress, relevant for delivery-focused target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Hydrogels support live/dead staining and confocal imaging, enabling quantitative viability and proliferation readouts in 3D.
- Reproducibility: Consistent gelation via defined glycol chitosan to benzaldehyde-terminated PEG ratios ensures batch-to-batch uniformity for assay standardization.
- Scalability: Simple mixing and vortex-based preparation allows adaptation to multi-well formats for compound screening in 3D environments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated compatibility with L929 fibroblast encapsulation and sustained proliferation supports use in preclinical models of tissue repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Self-healing after injection (recovery within ~1 hour) reduces concerns about delivery-induced damage, improving confidence in translational potential.
- Biomaterial Platform: Adjustable stiffness and responsiveness to bioactive stimuli allow modeling of disease-relevant microenvironments for preclinical screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early evaluation of cell-material interactions before advancing to in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell proliferation and viability in a defined 3D hydrogel system with tunable mechanical cues.
- Screening: Hydrogel formation is rapid and reagent-efficient, enabling preparation of standardized 3D matrices for compound or genetic perturbation screens.
- Analytics: Compatible with live/dead assays and confocal imaging, providing quantitative, spatially resolved readouts on cell distribution and viability.
- Translational Research: Demonstrated cell proliferation post-injection supports evaluation of delivery strategies in regenerative medicine contexts.
- Enterprise Reuse: The hydrogel platform is reusable across cell types and stimuli, serving as a modular tool for multiple projects in biomaterials and cell therapy research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides a tunable, biomimetic 3D environment that reduces reliance on artificial 2D culture systems, improving physiological relevance.
- Operational Value: Room-temperature gelation, simple mixing, and sterilization via filtration enable rapid, GMP-adaptable preparation without complex equipment.
- Strategic Value: Enables early assessment of delivery-related cell stress, informing go/no-go decisions for cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating cell survival and function in injectable, self-healing matrices before in vivo investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry and sterile technique for synthesis of benzaldehyde-terminated PEG and hydrogel formulation.
- Needs access to standard lab equipment: vortex mixer, syringe filters, centrifuge, and confocal microscopy for validation.
- Standardization of glycol chitosan and DF PEG ratios is critical for reproducible gelation time and stiffness across batches.
- Adaptation to other cell types may require optimization of encapsulation density and crosslinking kinetics.
- While injectable, shear forces during delivery may affect cell viability, necessitating empirical validation for each therapeutic cell type.
