Name: Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda o método CORALINA para produzir bibliotecas de gRNA em larga escala a partir de qualquer DNA usando digestão enzimática com nuclease microcócica. Esta técnica econômica simplifica a construção de bibliotecas para telas CRISPR.

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Os autores gostaria de agradecer sua entrada Prof. Dr. Stephan Beck e Prof Dr. Magdalena Goetz, ajudar e apoiar no desenvolvimento do método de CORALINA, Maximilian Wiessbeck e Valentin Baumann para comentários úteis. O trabalho foi apoiado pelo DFG (STR 1385/1-1).

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
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<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

CORALINA pode ser usado para gerar bibliotecas de gRNA em grande escala por digestão controlada nuclease do ADN alvo e clonagem de fragmentos encalhados dobro resultantes a granel. Inferência estatística indica que muitos mais do que 107 sequências de gRNA individuais já foram com sucesso clonadas usando o protocolo na mão9. CORALINA pode ser personalizado de várias maneiras. A escolha do modelo de DNA define a região de destino e a complexidade máxima da biblioteca gerada. Usando este protocolo, bibliotecas CORALINA anteriormente foram geradas de humano e DNA genômico de rato9. Resultados representativos aqui apresentados retratam a geração de uma biblioteca CORALINA de DNA purificado de BAC. Personalização pode ser alcançada pela escolha de gRNA expressão vetorial e vinculador sequências. Anteriormente, nós testamos três pares diferentes de comprimentos de vinculador de assembly de Gibson, com pequenas variações na eficiência9.
Devido a sua origem a partir de DNA em massa digerida, protospacer de CORALINA gRNAs geralmente não são exatamente 20 bp em comprimento, mas mostrar uma distribuição de comprimento, com uma média que depende de ambos os parâmetros da digestão MNase, bem como o tamanho da excisão feita a partir do gel de página s. representativo exemplo mostrado na Figura 2B e C, retrata fragmentos com um comprimento médio entre 19 e 27 bp. Em nossa experiência, o comprimento dos fragmentos é fielmente preservado pelo gRNA gerado protospacer9. Enquanto fragmentos menores do que 20 bp deve ser evitado devido à taxa mais elevada do alvo de gRNAs resultante, mais fragmentos são provavelmente muito menos de um problema para aplicações a jusante, uma vez que tem sido demonstraram que gRNAs com protospacers, enquanto 45 bp são ainda funcional,9.
As duas etapas mais críticas no protocolo CORALINA são a seleção de tamanho de fragmentos MNase-digerido e passos de clonagem. Geração de fragmentos que são muito curtos (por exemplo, média abaixo de 18 bp) ou incorporação de muitos vetores de expressão vazia gRNA processará a biblioteca inútil. Assim, é importante otimizar a etapa de digestão de MNase (Figura 2A), para monitorar a excisão (Figura 2B, C), verificar para a digestão completa do backbone vector gRNA e não incluindo controles nenhum fragmento em todo o protocolo. Cuidados especiais também tem que ser tomado para preservar a representação da biblioteca gRNA. Em geral, um gargalo comum de geração de biblioteca é a transferência eficiente de plasmídeos em bactérias para a amplificação. Assim, grandes quantidades de bactérias com excelente competência e um grande número de eventos electroporation individuais são necessários para atingir um elevado número de clones de gRNA.
Novas estratégias para a produção de biblioteca de gRNA será necessárias colher todo o potencial de rastreio baseado em CRISPR abordagens durante as próximas décadas. Há uma demanda significativa por métodos de baixo custo, simples e customizáveis gerar bibliotecas em grande escala, um pré-requisito para fazer triagem passível de um maior número de sistemas modelo e diferentes abordagens de engenharia baseada em CRISPR. CORALINA constitui um primeiro passo para isso. Os usos potenciais são múltiplos, especialmente para produzir abrangentes bibliotecas de genomas, cDNA derivados bibliotecas de sistemas modelo menos comuns, bibliotecas altamente concentradas e experimentais set-ups no quais diferentes proteínas CRISPR (com diferente PAM requisitos) são usados em combinação.
Ao contrário de outros métodos, CORALINA gera todos os possíveis gRNAs da entrada DNA. No entanto, uma desvantagem do método é que gRNAs falta a necessária sequência PAM também estão incluídos na biblioteca, uma característica que ele compartilha com um segundo método enzimático para a geração de biblioteca gRNA CRISPR-comer (tabela 1). A escolha do método ideal para geração de biblioteca gRNA depende das especificações da análise planejada experiência, especialmente a natureza (genic, regulamentar, intergênica) e o tamanho da região de destino (locus único, várias regiões, todo o genoma). Vemos uma cabeça especial em usar CORALINA quando um grande número de não-codificantes ou regiões reguladoras estão a ser analisados, se não houver informações de sequência incompleta ou não confiáveis (sistemas modelo exótico, misturas de espécies (por exemplo, microbiomes) ou obtidos experimentalmente entrada), se as endonucleases CRISPR diferentes são combinadas ou se saturando a análise é realizada em um locus curto e definido (por exemplo, representada por BACs).

A adaptação do sistema CRISPR/Cas9 bacteriana como uma ferramenta de direcionamento molecular causou a mais recente revolução na biologia molecular. Nunca foi tão fácil de manipular a cromatina em locais definidos de genômicas. Aplicações comuns de CRISPR incluem de mutações do gene alvo1, genoma engenharia2, Epigenoma edição3, ativação transcricional e4de silenciamento do gene. Uma vantagem particular do sistema CRISPR é que suas aplicações não estão limitadas a sites de candidatos bem estudado, como bibliotecas de gRNA fazem menos tendenciosas telas possível. Estas facilitam a descoberta dos loci funcionais no genoma sem qualquer conhecimento prévio de experimental. No entanto, construção de biblioteca de gRNA baseia-se atualmente principalmente na síntese de oligo-nucleotide e existem opções limitadas para comprar gRNA bibliotecas que não são de humanos ou regiões de origem ou destino do mouse fora abra frames de leitura. Assim, embora CRISPR telas já provaram ser incrivelmente potente5,6,7,8, todo o seu potencial ainda não tenha sido explorado.
Para superar a limitação de duas estratégias de gRNA clássica geração métodos foram desenvolvidos recentemente. Ambos são baseados em digestão enzimática controlada do DNA alvo, em vez de depender de síntese do oligonucleotide personalizado. Enquanto CORALINA9 emprega micrococcal nuclease, o método alternativo disponível apenas atualmente, comedores de CRISPR10, faz uso de enzimas de restrição (HpaII, ScrFeu, Bfaeu e Mmeeu). Importante, ambas as técnicas podem ser aplicadas a qualquer entrada DNA, que serve como a fonte de gRNA protospacer sequências. Enquanto o método CRISPR-comendo emprega uma estratégia para diminuir o número de clonado gRNAs cujos sítios alvos não são seguidos pelo necessário S.pyogenes PAM (protospacer motivo adjacente), que gera apenas uma pequena fração de todos os possíveis gRNAs funcionais para uma determinada região. CORALINA, por outro lado, é capaz de gerar todos os gRNAs potenciais para a sequência de origem, mas também incorpora uma fração maior de guias não-funcional. geração de biblioteca gRNA através da actividade nuclease controlada permite a produção de bibliotecas de gRNA abrangente para todas as espécies, qualquer sistema Cas9-proteína ou - effector de forma simples e econômica. Além disso, a CORALINA é adaptável a personalização, como opções apropriadas de entrada e o vetor de definam o tipo de biblioteca, o tamanho e o conteúdo. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado que pode ser usado para a geração de bibliotecas gRNA abrangente de diversas fontes de DNA (Figura 1), incluindo os cromossomos artificiais bacterianos (BACs) ou de DNA genômico9. Os resultados representativos que acompanha este protocolo foram derivados aplicando o protocolo CORALINA ao DNA de BAC.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inativação do buffer de amostra Mnase</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Gels, 20%, 10 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., gel pré-fabricado de 20% PAGE</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Running Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE gel running buffer</td></tr><tr><td>Bisturi descartável, estéril</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., podem ser utilizados outros reagentes equivalentes</td></tr><tr><td>Coloração de ácido nucleico SYBR Green I (concentrado 1000x em DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., também disponível na Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>Fenol UltraPure:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., outros reagentes equivalentes podem ser usados</td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., outros reagentes equivalentes podem ser usados</td></tr><tr><td>Acetato de sódio 3M, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., podem ser utilizados outros reagentes equivalentes</td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Kit de embotamento rápido</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>acetato de amomio</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., podem ser utilizados outros reagentes equivalentes</td></tr><tr><td>acetato de magnésio</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., podem ser utilizados outros reagentes equivalentes</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; MOLEM37465520 (ou Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., podem ser utilizados outros reagentes equivalentes</td></tr><tr><td>Contas Agencourt AMPure XP</td><td>relha Beckman</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., outros reagentes equivalentes podem ser usados</td></tr><tr><td>concentrados T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Amplificador Longo Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., outros reagentes equivalentes podem ser usados</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP, dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Exonuclease T5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>DNA polimerase de fuso&nbsp;</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>Células competentes TG1</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>Cuvetes de eletroporação de 1mm de folga&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.Placa</td></tr> <tr><td>de Bio-Ensaio (Poliestireno, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr>9.3.Bacto-triptona<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Extracto de levedura</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>em todo</td></tr><tr><td>o Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250</td></tr> ml tubos de <tr><td>centrífuga</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

um protocolo universal para grande escala grna biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de dna

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

A popularidade do sistema CRISPR/Cas9 para genoma e engenharia Epigenoma decorre de sua simplicidade e adaptabilidade. Um efetor (a nuclease Cas9 ou uma proteína de fusão de nuclease-mortos dCas9) é direcionado para um site específico no genoma por um pequeno RNA sintético conhecido como o guia do RNA, ou gRNA. A natureza bipartida do sistema CRISPR permite seu uso em triagem abordagens desde bibliotecas do plasmídeo contendo fitas de expressão de milhares de gRNAs individual podem ser usadas para interrogar a muitos locais diferentes em uma única experiência.
Até à data, sequências de gRNA para a construção de bibliotecas foi quase exclusivamente geradas pela síntese do oligonucleotide, que limita a complexidade alcançável de sequências na biblioteca e é relativamente onerosos. Aqui, uma detalhada do protocolo para CORALINA (geração de biblioteca de gRNA abrangente através da actividade nuclease controlada), um simples e método cost-effective para a geração de bibliotecas gRNA altamente complexo baseado na digestão enzimática da entrada do DNA, é descrito. Desde bibliotecas CORALINA podem ser geradas a partir de qualquer fonte de ADN, muitas opções para personalização existem, permitindo uma grande variedade de telas CRISPR-baseado.

Usando o protocolo em mãos, bibliotecas de gRNA CORALINA foram geradas de humanos e de DNA genômico de rato9 e BAC DNA (Figura 1). Para produzir fragmentos de DNA de entrada apropriado para clonagem em vetores de expressão gRNA, condições ideais para a digestão controlada nuclease precisa ser determinado. Um resultado típico para a otimização da digestão micrococcal nuclease é retratado na Figura 2A. Quantidade insuficiente de nuclease (0,1, 2, 3, 4, 4.5 ou 5 unidades) produz sem produtos perceptíveis na faixa de tamanho necessário (10-100 bp) e 5,5-7,5 unidades ainda produziram fragmentos que são em média muito tempo. Maiores quantidades de enzima (50 unidades) levam a degradação excessiva de entrada DNA após 10 min. Consequentemente, uma quantidade intermediária foi escolhida (10 unidades). O resumo foi aumentado produzir suficiente digerido fragmentos para purificação subsequente e clonagem (Figura 2B). Enquanto é recomendável cegamente selecionar fragmentos de DNA por tamanho e só contar com a escada de DNA para orientação minimizar a exposição de fragmentos de DNA à luz UV, géis podem ser manchados depois para controle de qualidade da digestão e do corte. Figura 2B mostra um exemplo representativo de um gel de página da qual DNA fragmentos entre 20 e 30 bp tem sido extirpados. Gel purificada MNase fragmentos foram carregados em um 20% gel de página para verificar a seleção de tamanho sucesso e purificação de fragmentos de MNase-digerido (Figura 2). O protocolo na mão é compatível com o uso de sequências de vinculador personalizado, permitindo a clonar os fragmentos MNase-digerido em vetores de expressão gRNA de escolha. Aqui, gRNA-PLKO9 foi usado como backbone. Os linkers são amplificados do vetor de expressão gRNA usando PCR padrão. Figura 2D retrata um exemplo representativo de sequências de vinculador amplificado desprovida de adicionais, incorreto ou sem amplicons de modelo. Em seguida, vinculador amplicons são digeridas com enzimas de restrição para assegurar linkers são ligados para os fragmentos MNase-digerido na orientação correta. Mostra Figura 2D gel de agarose de linkers 5' e 3' antes e depois da digestão com HindIII e SacII, respectivamente, indicando a digestão completa dos linkers o predito 637 e 295 bp. Porção direita da imagem gel de documentos a excisão dos fragmentos do vinculador digerido. Seguinte gel extração de linkers digeridos, o próximo passo no protocolo é a ligadura dos linkers aos fragmentos MNase-digerido final-reparado. Como sequências de vinculador são geradas por PCR utilizando primers unphosphorylated, Auto ligadura dos linkers não deveria ocorrer. Apenas os fragmentos de DNA digerido MNase reparado a fim fornecem os necessário para ligadura de grupos fosfato. Após tradução de nick, o produto da ligadura é amplificado por PCR. Para evitar excessivo viés de amplificação da PCR que podem distorcer a representação das sequências de gRNA na biblioteca, amplificação é limitada a menos de 20 ciclos no total. Após a PCR, os produtos de amplificação são difíceis de Visualizar em gel de agarose. PCRs controle separado com 32 ciclos, portanto, são realizados para detectar os produtos (mas não são usados para a preparação de biblioteca). Os resultados deste controle PCR são mostrados na Figura 2E. Isto permite otimizar as reações da ligadura e certifique-se de reações são desprovidas de artefactos PCR, que às vezes ocorrem em "controles sem fragmentos" (NFC). Figura 2E mostra o amplicon desejado (5' vinculador, fragmento de DNA + 3' vinculador, comprimento: 869 bp) seguindo a amplificação das reações de ligadura usando relações equimolar de (1:1) entre fragmentos e sequências de vinculador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figura 1 : Sugeriu o cronograma para a preparação de uma biblioteca de gRNA. CORALINA oferece uma estratégia simples e eficiente para a geração de bibliotecas gRNA abrangente de uma infinidade de diferentes fontes de DNA de qualquer organismo. O protocolo na mão pode ser levado à conclusão durante uma semana. Geração de vinculador pode ser realizada em paralelo com final-reparação do DNA. Preparação de bactérias electrocompetent leva dois dias e inclui uma etapa de crescimento durante a noite e, portanto, deve ser iniciada antes da montagem, as reações são criadas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figura 2 : Passos críticos durante o protocolo de. (A) controladas digestão do DNA de BAC permite geração de fragmentos de diferentes tamanhos. Mostrado aqui é a otimização da digestão MNase. DNA purificado de BAC foi tratada com diferentes quantidades de MNase por 10 min. 10 U de MNase gerar fragmentos do ADN do comprimento desejado (bp 20-30). (B) seleção de fragmentos entre 20 e 30 bp usando excisão do gel de polyacrylamide do tamanho. DNA purificado de BAC foi tratado com 10 U de MNase por 10 min. A imagem foi gravada após excisão. (C) controle de qualidade de fragmentos de gel-purificado. Após a purificação de gel, 1/6 de MNase o purificado fragmentos foi carregado em um 20% gel de página para verificar a seleção de tamanho sucesso e purificação. (D) amplificação de sequências de vinculador para digestão de montagem e enzima de restrição de linkers para garantir a clonagem direcional. linkers 5' e 3' foram amplificados e corte com HindIII e SacII, respectivamente. Controles não-modelo (NTC) foram incluídos para controle de contaminação de DNA e PCR artefactos. Esquerda: aplicativo de amostra para análise; Certo: aplicativo de exemplo preparativa. Imagem foi gravada após a excisão de gel. (E) bem sucedida ligadura dos linkers de fragmentos de DNA pode ser analisada usando PCR com um aumento do número de ciclos PCR (32) e controlada por executar sem controles de modelo com H2O (NTC) ou usando o NTC da etapa anterior para a tradução de nick como entrada (NTC NT)). É importante não incluir um nenhum fragmento controle (NFC), que é uma ampliação de uma ligadura e a reação de nick tradução do qual foram omitidos os fragmentos de MNase. Apenas amostras no qual MNase fragmentos foram combinados com DNA de vinculador produzem o amplicon esperado (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Métodos para a geração de bibliotecas gRNA em larga escala devem ser simples, eficiente e econômica. Descreveremos um protocolo para a produção de bibliotecas de gRNA baseado na digestão enzimática de ADN alvo. Este método, CORALINA (geração de biblioteca gRNA abrangente através da actividade nuclease controlada) apresenta uma alternativa para síntese do oligonucleotide personalizado dispendiosos.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

O objetivo geral deste método é construir bibliotecas abrangentes de RNA orientador a partir de DNA purificado de qualquer origem. As bibliotecas de RNA orientador são coleções de plasmídeos utilizadas em ensaios baseados em CRISPR. O método CORALINA utiliza a digestão enzimática de DNA purificado para clonar os fragmentos resultantes em um vetor de biblioteca de RNA orientador.A principal vantagem desta técnica é que ela produz todos os RNAs guia possíveis a partir da sequência de entrada e é muito econômica. Embora este vídeo demonstre a proteção de uma biblioteca CORALINA a partir de um cromossomo bacteriano artificial, este método pode, em princípio, ser aplicado a qualquer tipo de DNA de entrada de qualquer organismo. Uma otimização da digestão com nuclease microcócica deve ser realizada para cada novo lote de nuclease microcócica.Prepare o seguinte para cada reação: um microlitro de tampão 10x de nucleases microcócica, albúmina sérica bovina 1x, um micrograma de DNA alvo, um microlitro de nucleases microcócica e água para completar 10 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.Inative imediatamente a enzima adicionando um microlitro de EGTA 500 milimolar. Adicione tampão amostral com corante de carga para gel às amostras de DNA e carregue um micrograma de DNA por poço em um gel de poliacrilamida 20%. Carregue uma escada de DNA apropriada para determinação de tamanho.Execute o gel em tamp&atilde;o de eletroforese 1x TBE a 150 volts por cerca de 1,5 hora ou at&eacute; que a frente inferior do corante alcance a extremidade inferior do gel. Cora o gel utilizando um corante ultrassens&iacute;vel para &aacute;cidos nucleicos e visualize sob luz UV. Neste exemplo, a concentra&ccedil;&atilde;o &oacute;tima de nucleases microc&oacute;cicas para digerir o DNA at&eacute; fragmentos de 20 a 30 pares de bases foi de 10 unidades.Use esta concentração ótima de nucleases microcócicas para digerir de 10 a 12 microgramas de DNA alvo da mesma maneira demonstrada para as reações de otimização. Após separar os fragmentos de DNA por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), use um escalpe estéril para cortar o gel ao lado da faixa do marcador e corar apenas a parte do gel contendo a escada com tampão de eletroforese TBE 1x fresco contendo um corante ultrasensível para ácidos nucleicos. Visualize a escada de DNA e use uma lâmina de barbear para excisar os fragmentos de DNA digeridos pela nuclease microcócica na faixa de tamanho entre aproximadamente 18 e 30 pares de bases.Transfira o fragmento do gel para um tubo de microcentrifugação. Preencha o restante do gel com corante para ácidos nucleicos conforme mostrado anteriormente. Exponha o gel à luz UV e adquira uma imagem como registro da etapa de excisão do gel.Inicie este procedimento utilizando uma ponteira estéril para esmagar o fragmento de gel recortado contra a parede do tubo de microcentrífuga. Adicione dois volumes de gel do tampão de solubilização PAGE e incube a 37 graus Celsius em plataforma rotativa por 16 horas. No dia seguinte, centrifugue a amostra em uma microcentrífuga em velocidade máxima por um minuto.Transfira os sobrenatantes para um novo tubo de microcentrífuga, tomando cuidado para não transferir pedaços triturados do gel. Adicione 0,5 volumes de tampão de solubilização PAGE ao pellet do gel, vortexie e repita a centrifugação. Combine os sobrenatantes e extraia os fragmentos de DNA utilizando um método padrão de extração com fenol-clorofórmio, conforme descrito no protocolo textual.Paralelamente ao isolamento de fragmentos de DNA, amplifique os conectores a partir do vetor de expressão de RNA guia usando PCR padrão. Para garantir a clonagem direcional, os conectores são então digeridos com as enzimas de restrição apropriadas, conforme descrito no protocolo textual. Execute a digestão com enzima de restrição dos conectores em um gel de agarose a um por cento.Recorte as faixas corretas e purifique o DNA dos fragmentos de gel retirados utilizando um kit de extração de gel. Um kit de nivelamento de DNA é usado para a reação de reparo de extremidades. Adicione o seguinte a um tubo microcenrífugo.10 microlitros de DNA purificado, 1,5 microlitro de tampão blunt (10x), 1,5 microlitro de mistura de dNTPs de um milimolar, 1,4 microlitro de água e 0,6 microlitro de enzima blunt. Incubar a 22 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, aquecer e ativar a enzima por meio de incubação a 70 graus Celsius por 10 minutos. Adicionar 85 microlitros de água e realizar uma limpeza da reação conforme descrito no protocolo do texto.Monte uma reação de ligação de 14 microlitros utilizando quantidades molares iguais de fragmentos digeridos e reparados pela nucleases microcócica e sequências de ligador conforme descrito no protocolo textual. Após a tradução do entalhe, o produto da ligação é amplificado por PCR. Para separar os fragmentos de nucleases microcócica com ligadores cinco primas e três primas corretamente ligados daqueles com dois ligadores cinco primas ou dois ligadores três primas, combine todas as reações de PCR de 15 ciclos, adicione corante de carregamento de DNA e eletroforese em gel de agarose 0,8%.Recorte a faixa proeminente de 869 pares de bases e purifique o DNA utilizando um kit de extração de gel. Quantifique a quantidade de DNA utilizando um espectrofotômetro. Posteriormente, clone os fragmentos amplificados por PCR no vetor de expressão de RNA guia por montagem Gibson conforme detalhado no protocolo textual.Para iniciar este procedimento, distribua o construto do vetor com inserto purificado em tubos PCR estéreis e previamente resfriados e mantenha-os no gelo. Resfrie cubetas de eletroporação com entreferro de um milímetro no gelo. Adicione 25 microlitros de células TG1 recém-preparadas diretamente a uma alíquota de DNA e transfira imediatamente a mistura para uma cubeta de eletroporação.Agite levemente ou toque no cubeta para garantir que a mistura de células e DNA esteja distribuída ao longo do comprimento da câmara do cubeta, sem bolhas ou ar aprisionado. Coloque o cubeta na câmara do equipamento e inicie o programa de eletroporação apropriado. Adicione imediatamente 475 microlitros de 2TY em temperatura ambiente ao cubeta.Transfira as bactérias eletroporadas para um tubo de 50 mililitros. Repita as eletroporações individuais, colete todas as células transformadas com uma biblioteca em um único tubo de 50 mililitros e documente o volume total. Para estimar o número total de colônias para toda a biblioteca, plaque uma quantidade pequena e definida de bactérias transformadas com a biblioteca em uma placa de ágar de 10 centímetros com a seleção apropriada de antibiótico.Para reduzir o volume do restante das bactérias, centrifugue a aproximadamente 4.000 g durante 10 minutos ou até a formação de uma pelota visível e o sobrenadante ficar claro. Remova todo o sobrenadante, exceto alguns mililitros, e ressuspenda as células. Plaque as bactérias em placas de bioensaio recobertas com ágar 2TY contendo a seleção com antibiótico apropriado.Espalhe um volume apropriado da reação de eletroporação controle pUC19 em uma placa adicional de ágar de 10 centímetros com seleção pelo antibiótico apropriado. Incube as placas de ágar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, conte o número de colônias nas placas controle para estimar a unidade formadora de colônia por micrograma de DNA para as bactérias, bem como a complexidade da biblioteca.Por fim, retire as bactérias do meio sólido para extração de DNA plasmidial. Após a purificação em gel, 1/6 dos fragmentos de nucleases micrococicas purificados foram carregados em um gel de PAGE 20% para confirmar a seleção de tamanho e purificação bem-sucedidas. Os amplicons de ligante foram digeridos com enzimas de restrição para assegurar que os ligantes foram ligados aos fragmentos digeridos pela nuclease micrococica na orientação correta.O lado esquerdo desta imagem representativa de gel mostra os ligantes 5' e 3' antes e após a digestão com HindIII e SacII, respectivamente, indicando digestão completa dos ligantes nos fragmentos preditos de 637 pares de bases e 295 pares de bases. O lado direito da imagem do gel documenta a excisão dos fragmentos de ligantes digeridos. A ligação bem-sucedida dos ligantes aos fragmentos de DNA foi analisada por meio de PCR com um número aumentado de ciclos de PCR.Os controles incluídos foram um controle sem molde, utilizando o controle sem molde da etapa anterior de tradução de cortes como entrada, e um controle sem fragmento de nucleases microcócicas. Apenas as amostras nas quais os fragmentos de nucleases microcócicas foram combinados com o DNA conector produziram o amplicon esperado de 869 pares de bases. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco dias, se for feita corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante manter a complexidade da biblioteca e realizar outras reações de controle. Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma biblioteca de RNA guia para telas baseadas em CRISPR, fragmentando o DNA em pequenos pedaços e clonando-os no vetor principal da biblioteca.

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