Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

O objetivo geral deste método é construir bibliotecas abrangentes de RNA-guia a partir de DNA purificado de qualquer fonte. As bibliotecas de gRNA são coleções de plasmídeos usadas em telas baseadas em CRISPR. O método CORALINA usa a digestão enzimática do DNA purificado para clonar os fragmentos resultantes em um esqueleto de biblioteca de RNA guia.

A principal vantagem dessa técnica é que ela produz todos os RNAs guia possíveis a partir da sequência de entrada e é muito econômica. Embora este vídeo demonstre a proteção de uma biblioteca CORALINA de um cromossomo artificial bacteriano, este método pode, em princípio, ser aplicado a qualquer tipo de DNA de entrada de qualquer organismo. Uma otimização da digestão da nuclease microcócica deve ser realizada para cada novo lote de nuclease microcócica.

Configure o seguinte para cada reação. Um microlitro de tampão nuclease microcócica 10x, 1x albumina de soro bovino, um micrograma de DNA alvo, um microlitro de nuclease microcócica e água para 10 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Inative imediatamente a enzima adicionando um microlitro de 500 milimolares EGTA. Adicione tampão de amostra com corante de carregamento de gel às amostras de DNA e carregue um micrograma de DNA por poço em um gel de poliacrilamida a 20%. Carregue uma escada de DNA apropriada para dimensionamento.

Execute o gel em 1x TBE executando tampão a 150 volts por cerca de 1,5 horas ou até que a frente inferior do corante atinja a extremidade inferior do gel. Pinte o gel usando uma coloração de ácido nucleico ultrassensível e visualize sob luz ultravioleta. Neste exemplo, a concentração ideal de nuclease microcócica para digerir o DNA até 20 a 30 pares de bases de tamanho era de 10 unidades.

Use esta concentração ideal de nuclease microcócica para digerir 10 a 12 microgramas de DNA alvo da mesma forma demonstrada para as reações de otimização. Depois de separar os fragmentos de DNA por PAGE, use um bisturi estéril para cortar o gel próximo à faixa do marcador e corar apenas a parte do gel que contém a escada com tampão de corrida 1x TBE fresco contendo uma coloração de ácido nucleico ultrassensível. Visualize a escada de DNA e use uma lâmina de barbear para extirpar fragmentos de DNA digeridos por nuclease microcócica na faixa de tamanho entre aproximadamente 18 a 30 pares de bases.

Transfira a fatia de gel para um tubo de microcentrífuga. Manchar o restante do gel com coloração de ácido nucleico, como mostrado anteriormente. Exponha o gel à luz UV e adquira uma imagem como registro da etapa de excisão do gel.

Comece este procedimento usando uma ponta de pipeta estéril para esmagar a fatia de gel excisada contra a parede do tubo da microcentrífuga. Adicione dois volumes de gel de tampão de solubilização PAGE e incube a 37 graus Celsius em uma plataforma rotativa por 16 horas. No dia seguinte, centrifugar a amostra numa microcentrífuga à velocidade máxima durante um minuto.

Transfira os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrífuga, tomando cuidado para não transferir nenhum pedaço de gel triturado. Adicione 0,5 volumes de tampão de solubilização PAGE ao pellet de gel, vórtice e repita a centrifugação. Combinar os sobrenadantes e extrair os fragmentos de ADN utilizando um método padrão de extracção fenol-clorofórmio, tal como descrito no protocolo de texto.

Paralelamente ao isolamento de fragmentos de DNA, amplifica os ligantes do vetor de expressão de RNA guia usando PCR padrão. Para garantir a clonagem direcional, os ligantes são então digeridos com as enzimas de restrição apropriadas, conforme descrito no protocolo de texto. Execute o resumo da enzima de restrição dos ligantes em um gel de agarose a um por cento.

Extirpar as bandas corretas e purificar o DNA dos pedaços de gel excisados usando um kit de extração de gel. Um kit de embotamento de DNA é usado para a reação de reparo final. Adicione o seguinte em um tubo de microcentrífuga.

10 microlitros de DNA purificado, 1,5 microlitros de tampão embotado 10x, 1,5 microlitros de uma mistura dNTP milimolar, 1,4 microlitros de água e 0,6 microlitros de enzima embotada. Incube a 22 graus Celsius por 30 minutos e depois aqueça e ative a enzima por incubação a 70 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 85 microlitros de água e execute uma limpeza de reação conforme descrito no protocolo de texto.

Configure uma reação de ligação de 14 microlitros usando quantidades molares iguais de fragmentos digeridos e reparados por nuclease microcócica e sequências de ligantes, conforme descrito no protocolo de texto. Após a tradução do nick, o produto de ligação é amplificado por PCR. Para separar fragmentos de nuclease microcócica com o ligante de cinco primos e três primos corretamente anexados de fragmentos com dois ligantes de cinco primos ou dois de três primos, combine todas as reações de PCR de 15 ciclos, adicione corante de carregamento de DNA e execute em um gel de agarose a 0,8%.

Extirpar a banda proeminente em 869 pares de bases e purificar o DNA usando um kit de extração de gel. Quantifique a quantidade de DNA usando um espectrofotômetro. Posteriormente, clone os fragmentos amplificados por PCR no vetor de expressão de RNA guia pela montagem de Gibson, conforme detalhado no protocolo de texto.

Para iniciar este procedimento, a alíquota do vetor purificado é inserida em tubos de PCR estéreis e pré-resfriados e mantida no gelo. Refrigere as cubetas de eletroporação com um milímetro de espaço no gelo. Adicione 25 microlitros de células TG1 recém-preparadas diretamente a uma alíquota de DNA e transfira imediatamente a mistura para uma cubeta de eletroporação.

Agite ou toque na cubeta para garantir que as células e a mistura de DNA sejam distribuídas ao longo do comprimento da câmara da cubeta sem ar preso ou bolhas. Coloque a cubeta na câmara deslizante e inicie o programa de eletroporação apropriado. Adicione imediatamente 475 microlitros de temperatura ambiente 2TY à cubeta.

Transfira as bactérias eletroporadas para um tubo de 50 mililitros. Repita as eletroporações individuais, colete todas as células transformadas com uma biblioteca em um tubo de 50 mililitros e documente o volume total. Para estimar o número total de colônias para toda a biblioteca, coloque uma pequena quantidade definida de bactérias transformadas com a biblioteca em uma placa de ágar de 10 centímetros com a seleção apropriada de antibióticos.

Para reduzir o volume do restante das bactérias, centrifugue a cerca de 4 000 g durante 10 minutos ou até se formar uma paleta visível e o sobrenadante parecer límpido. Remova todos, exceto alguns mililitros do sobrenadante e ressuspenda as células. Coloque as bactérias em placas de bioensaio revestidas com ágar 2TY contendo a seleção de antibióticos apropriada.

Espalhe um volume apropriado da reação de eletroporação de controle pUC19 em uma placa de ágar adicional de 10 centímetros com seleção apropriada de antibióticos. Incube as placas de ágar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, conte o número de colônias nas placas controladas para estimar a unidade formadora de colônias por micrograma de DNA para as bactérias, bem como a complexidade da biblioteca.

Por fim, raspe as bactérias da placa para extração de DNA de plasmídeo. Após a purificação do gel, 1/6 dos fragmentos de nuclease microcócica purificada foram carregados em um gel de 20% PAGE para confirmar a seleção e purificação bem-sucedidas do tamanho. Os amplicons ligantes foram digeridos com enzimas de restrição para garantir que os ligantes sejam ligados aos fragmentos digeridos pela nuclease microcócica na orientação correta.

O lado esquerdo desta imagem de gel representativa mostra cinco ligantes primos e três ligantes primos antes e depois da digestão com HindIII e SacII, respectivamente, indicando a digestão completa dos ligantes para os 637 pares de bases preditivos e 295 pares de bases. O lado direito da imagem de gel documenta a excisão dos fragmentos de ligação digeridos. A ligação bem-sucedida de ligantes a fragmentos de DNA foi analisada usando PCR com um número aumentado de ciclos de PCR.

Os controles incluídos foram um controle sem modelo usando o controle sem modelo da etapa anterior de tradução de nick como entrada e um controle de fragmento de nuclease sem microcócica. Apenas amostras nas quais fragmentos de nuclease microcócica foram combinados com DNA ligante produziram o amplicon esperado de 869 pares de bases. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco dias se for feita corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante manter a complexidade da biblioteca e executar outras reações de controle. Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como gerar uma biblioteca de RNA guia para telas baseadas em CRISPR, cortando o DNA em pequenos pedaços e clonando-os no backbone do vetor da biblioteca.