Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent
30 de outubro de 2017
Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.
O objetivo geral deste método é direcionar efetivamente a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células epiteliais pigmentares da retina em uma camada homogênea. Este método ajuda a responder a perguntas no campo da pesquisa da retina e dos olhos, como como a retina se desenvolve e como estabelecer um modelo de doença com células-tronco. A principal vantagem dessa técnica é que ela é mais rápida e eficiente do que os métodos espontâneos.
Este método usa uma combinação de fatores de crescimento e pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco para se tornarem RPE imaturo em 14 dias e RPE funcional maduro após três meses. Demonstrando partes do procedimento estará Cassidy Arnold, diretora associada do laboratório de biologia e engenharia de células-tronco da UC Santa Barbara. Para iniciar este procedimento, cultive colônias de células-tronco em condições livres de alimentador e sem soro até aproximadamente 80% de confluência antes de passar.
Em seguida, cubra uma placa de 12 poços com hidrogel à base de matriz extracelular de acordo com as recomendações do fabricante e deixe-a endurecer por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Depois disso, alíquota do meio de diferenciação da retina e PBS sem cálcio ou magnésio necessário para o dia zero e aquecê-los em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione os fatores de crescimento ao RDM aquecido e leve o EDTA à temperatura ambiente.
Se necessário, remova todas as colônias diferenciadas usando uma ponta de pipeta P10 com base na morfologia das células-tronco que serão passadas para diferenciação. As células fibroblásticas entre as colônias, bem como as células opacas dentro das colônias, indicam as células diferenciadas a serem removidas. A remoção manual de células é uma das etapas mais críticas do protocolo, pois começar com uma população de células-tronco completamente indiferenciadas permitirá um enriquecimento mais eficiente.
Em seguida, passe um único poço de uma placa de seis poços em quatro poços de uma placa de 12 poços, aspirando o meio das células-tronco e lavando os poços uma vez com dois mililitros de PBS pré-aquecido. Em seguida, aspire o PBS e enxágue cada poço três vezes com um mililitro de EDTA por poço. Em seguida, incline suavemente a placa e aspire o EDTA.
Não agite a placa de forma alguma para evitar levantar prematuramente as células. Após a terceira lavagem, adicione novamente um mililitro de EDTA e incube a placa em temperatura ambiente no exaustor por três a cinco minutos. Não mexa na placa durante esta incubação.
Em seguida, aspire o EDTA e adicione um mililitro de RDM por poço que será assentado mais 0,5 mililitros de meio extra. Por exemplo, lave um poço de uma placa de seis poços com 4,5 mililitros de RDM para colocar em quatro poços de uma placa de 12 poços. Em seguida, use um raspador de células para separar suavemente as células.
Triture as células em RDM pipetando para cima e para baixo cinco vezes no poço e conclua esta etapa rapidamente para evitar a recolocação na placa. Coloque em um tubo cônico. Dissocie grandes aglomerados de células, mas não triture em suspensão unicelular.
Distribua as células uniformemente na pipeta e conclua esta etapa rapidamente para evitar a recolocação na placa. Se desejar, use um microscópio óptico para observar o tamanho dos aglomerados de células. Posteriormente, semeie as células em placas de 12 poços revestidas com ECM.
Incline a placa para frente e para trás para distribuir as células uniformemente pelos poços e coloque-a em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 até a próxima troca de meio. Neste procedimento, revestir uma placa de seis poços com ECM reduzido pelo fator de crescimento de acordo com as recomendações do fabricante. Deixe agir por uma hora em temperatura ambiente durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, alicote a quantidade de DPBS necessária e um mililitro de RDM por poço de enriquecimento e aqueça-os a 37 graus Celsius em banho-maria. Leve a enzima semelhante à tripsina à temperatura ambiente e aqueça a quantidade necessária de meio de suporte de EPR a 37 graus Celsius. Depois disso, adicione um reagente antimicrobiano e um inibidor de ROCK ao RSM para atingir uma concentração final de 0,5x antimicrobiano e 10 micromolar inibidor de ROCK.
Use este meio nos primeiros quatro a sete dias para melhorar a fixação. Em seguida, aspire o meio gasto de todos os poços e adicione um mililitro por poço de RDM pré-aquecido sem fatores de crescimento. Se necessário, dissecar e raspar todas as células não EPR utilizando uma ponta de pipeta P10 ao microscópio de dissecação.
Após a dissecção, aspire o RDM e todos os detritos celulares e lave-os duas vezes com um mililitro de DPBS pré-aquecido por poço. Posteriormente, adicione 0,5 mililitros de TDE por poço de uma placa de 12 poços e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois, use um raspador de células para remover suavemente as células da placa.
Triture suavemente a suspensão enzimática celular pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes para criar uma suspensão uniforme. Em seguida, diluir a suspensão enzimática celular na proporção de um para 10 no RSM pré-aquecido sem inibidor de ROCK. Centrifugue a suspensão da célula a 173g por cinco minutos à temperatura ambiente.
Após cinco minutos, aspirar o meio do sedimento celular e ressuspender as células em RSM com inibidor de ROCK 10 micromolar. Em seguida, coe as células usando um filtro de células de malha de náilon com poros de 40 micrômetros. Conte o número de células usando um hemocitômetro e calcule a concentração de células na solução coada.
Posteriormente, semeie as células no fator de crescimento reduzido, placas revestidas com ECM de uma vez 10 a cinco células por centímetro quadrado em quatro mililitros de RSM com inibidor de ROCK 10 micromolar. Substitua o RSM por um inibidor de ROCK 10 micromolar 48 horas após a semeadura celular e continue a substituir o meio a cada três a quatro dias. Pare de adicionar o inibidor de ROCK ao RSM após quatro a sete dias.
Permita que as células amadureçam por 28 a 35 dias a 37 graus Celsius e 5% de CO2 e continue a substituir o RSM a cada três a quatro dias. Aqui são mostradas as células-tronco pluripotentes induzidas imediatamente antes de passar para diferenciação. As células-tronco são pequenas e densamente compactadas dentro das colônias que não parecem conter células diferenciadas, como fibroblastos ou passagens opacas dentro das colônias.
Aqui estão as células imaturas do EPR no segundo dia. As células neste estágio ainda devem ser subconfluentes e estender as projeções para os espaços vazios entre as células. Essas células são antes da coleta para remover o enriquecimento no dia 14.
As células não RPE aparecem como manchas ou fitas opacas. A mancha redonda contém células com morfologia fibroblástica, enquanto as manchas opacas são consideradas retina neural. Essas imagens mostram RPE na passagem zero, um e três no dia 30.
Em cada passagem, as células devem ser confluentes e parecer ter as características da morfologia epitelial pigmentada da retina, incluindo bordas de brilho de fase e uma forma poligonal. Uma vez dominadas, as técnicas de passagem e enriquecimento podem ser concluídas em uma a duas horas, dependendo da escala da cultura de células. Após esse procedimento, técnicas como quantificação de genes ou proteínas e ensaios funcionais podem ser usadas para responder a perguntas sobre a capacidade do EPR de secretar fatores de crescimento ou fagocitar segmentos externos.
Artigos publicados por Dave Buchholz em 2013 e Lindsay Leach em 2015 detalham o desenvolvimento e a otimização desse método. Fornecemos uma demonstração detalhada e completa de cada etapa do procedimento para torná-lo prontamente disponível para pesquisadores da área. Boa experiência.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para produzir células epiteliais pigmentares da retina (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes utilizando fatores de crescimento e moléculas pequenas. O processo de diferenciação gera RPE imaturo em 14 dias e RPE maduro e funcional após três meses.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Pesquisa da Retina
- Diferenciação Celular
Antecedentes
- Compreender o desenvolvimento da retina é essencial para a pesquisa ocular.
- O estabelecimento de modelos de doenças com células-tronco pode auxiliar no estudo de doenças retinianas.
- Este método é mais rápido e eficiente do que os métodos de diferenciação espontânea.
- As células epiteliais do pigmento retiniano desempenham um papel vital na saúde da retina.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para gerar RPE a partir de células-tronco pluripotentes.
- Aumentar a eficiência dos processos de diferenciação celular.
- Fornecer uma base para modelagem futura de doenças retinianas.
Métodos Utilizados
- Fatores de crescimento e moléculas pequenas são utilizados para orientar a diferenciação.
- As células-tronco são cultivadas em condições livres de camada de alimentação e livres de soro.
- Hidrogéis baseados na matriz extracelular são usados para adesão celular.
- As células são subcultivadas e tratadas com meios específicos para crescimento ideal.
Resultados Principais
- Células de EPR imaturas são obtidas em até 14 dias.
- Células de EPR maduras e funcionais são alcançadas após três meses.
- O protocolo demonstra eficiência aprimorada em comparação com os métodos tradicionais.
- A morfologia celular e a adesão são fundamentais para uma diferenciação bem-sucedida.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem simplificada para a geração de células de EPR.
- Ele possui potencial para avançar a pesquisa em doenças retinianas.
- O protocolo pode ser adaptado para diversas necessidades experimentais em biologia de células-tronco.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a diferenciação rápida e direcionada de células-tronco pluripotentes em camadas homogêneas de epitélio pigmentar da retina (EPR), abordando um gargalo fundamental na modelagem de doenças retinianas e no desenvolvimento terapêutico. Ao reduzir a dependência da diferenciação espontânea e da dissecação manual, melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade para aplicações pré-clínicas. O método suporta fontes tanto de iPSCs quanto de hESCs, facilitando modelos de doenças em laboratório e permitindo a redução de riscos mecanicistas em estágios iniciais de pipelines oftalmológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de desenvolvimento retiniano e a realização de testes de hipóteses terapêuticas em um sistema definido e relevante para humanos.
- Valor Operacional: Fornece uma monocamada homogênea e consistente de EPR que reduz a variabilidade em ensaios de engajamento de alvo e triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Permite a avaliação precoce dos efeitos de compostos sobre a função do EPR, como fagocitose e secreção de fatores de crescimento, aumentando a confiança na identificação de compostos promissores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera uma fonte escalonável e reprodutível de células de EPR funcionais adequadas para imageamento de alto conteúdo e ensaios baseados em biomarcadores.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de etapas manuais de dissecação e enriquecimento, simplificando a preparação para ensaios e reduzindo o tempo de manipulação.
- Valor Traducional: A criopreservação de bancos intermediários de células permite armazenamento de longo prazo e uso sob demanda, apoiando campanhas de triagem em múltiplos locais e transferência de tecnologia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Produz RPE maduro e polarizado com características funcionais (bordas brilhantes em contraste de fase, morfologia poligonal) após três meses, permitindo análise fenotípica relevante para doenças.
- Valor Operacional: Condições definidas de meio e protocolo de passagem permitem produção adaptável às Boas Práticas de Fabricação para aplicações em terapia celular.
- Valor Preditivo: Facilita a avaliação pré-clínica de desfechos específicos do RPE, como fagocitose de segmentos externos e secreção de VEGF, essenciais para avaliar a segurança e eficácia terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo a produção de RPE derivado de células-tronco para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e redução de riscos mecanicistas antes da otimização do composto líder.
- Biologia do Descobrimento: Apoia estudos baseados em hipóteses sobre a função do epitélio pigmentado da retina e mecanismos de doenças, utilizando linhagens de iPSCs geneticamente definidas.
- Triagem: Fornece leituras celulares padronizadas e quantitativas (por exemplo, densidade celular, morfologia, ensaios funcionais) para triagem de compostos e validação de alvos.
- Análises: Permite a quantificação de proteínas e genes, ensaios de fagocitose e perfis de secreção para comparar condições experimentais e avaliar o mecanismo de ação.
- Pesquisa Translacional: Oferece um fornecimento contínuo de células de RPE para estudos pré-clínicos longitudinais, conectando achados in vitro a modelos de doenças in vivo.
- Reutilização Empresarial: A criopreservação de bancos intermediários permite reutilização em diferentes projetos, reduzindo esforços redundantes de diferenciação e melhorando a eficiência de recursos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer um modelo definido de EPR derivado de humanos que recapitula funções epiteliais retinianas essenciais.
- Valor Operacional: O protocolo padronizado melhora a reprodutibilidade entre diferentes locais e usuários, minimizando a variabilidade entre lotes na eficiência da diferenciação.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de avanço ou interrupção ao permitir avaliação funcional precoce de compostos direcionados à EPR, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas em oftalmologia por meio de dados pré-clínicos preditivos e relevantes para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, técnicas de repicagem e práticas estéreis de cultura de tecidos.
- Depende de hidrogéis de matriz extracelular, formulações definidas de meio e suplementação com inibidor de ROCK para fixação e sobrevivência ideais.
- Necessita treinamento padronizado para etapas manuais de dissecação e enriquecimento, a fim de garantir a remoção consistente de populações não-RPE.
- A adaptação a linhagens alternativas de células-tronco pode exigir otimização da densidade de semeadura e da frequência de repicagem.
- O longo período de maturação (até três meses) exige trocas sustentadas de meio e acesso ao incubador, impactando o planejamento de produtividade.
