Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

O objetivo geral deste método é orientar efetivamente a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células epiteliais pigmentares da retina, formando uma camada homogênea. Este método auxilia em questões da área de pesquisa da retina e dos olhos, como o desenvolvimento da retina e como estabelecer um modelo de doença com células-tronco. A principal vantagem desta técnica é que ela é mais rápida e eficiente do que os métodos espontâneos.

Este método utiliza uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em 14 dias e em RPE funcional maduro após três meses. A demonstração de partes do procedimento será feita por Cassidy Arnold, diretora associada do laboratório de biologia e engenharia de células-tronco da UC Santa Barbara. Para iniciar este procedimento, cultive colônias de células-tronco em condições livres de camada de alimentação e livres de soro até atingirem aproximadamente 80% de confluência antes da passagem.

Em seguida, recubra uma placa de 12 poços com um hidrogel à base de matriz extracelular conforme as recomendações do fabricante e deixe solidificar por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Depois disso, alíquotas do volume de meio de diferenciação retiniana e PBS sem cálcio ou magnésio necessários para o dia zero e aqueça-os em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione os fatores de crescimento ao RDM aquecido e leve o EDTA à temperatura ambiente.

Se necessário, remova todas as colônias diferenciadas usando uma ponteira de pipeta P10 com base na morfologia das células-tronco que serão subcultivadas para diferenciação. Células fibroblásticas entre as colônias, bem como as células opacas dentro das colônias, indicam as células diferenciadas que devem ser removidas. A remoção manual das células é uma das etapas mais críticas do protocolo, pois iniciar com uma população completamente indiferenciada de células-tronco permitirá um enriquecimento mais eficiente.

Passe as células de um único poço de uma placa de seis poços para quatro poços de uma placa de 12 poços, aspirando o meio das células-tronco e lavando os poços uma vez com dois mililitros de PBS pré-aquecido. Em seguida, aspire o PBS e enxágue cada poço três vezes com um mililitro de EDTA por poço. Depois, incline suavemente a placa e aspire o EDTA.

Não agite a placa de maneira alguma para evitar a remoção prematura das células. Após a terceira lavagem, adicione um mililitro de EDTA novamente e incube a placa em temperatura ambiente na câmara de fluxo laminar por três a cinco minutos. Não perturbe a placa durante esta incubação.

Em seguida, aspire o EDTA e adicione um mililitro de RDM por poço que será semeado, mais 0,5 mililitro de meio extra. Por exemplo, lave um poço de uma placa de seis poços com 4,5 mililitros de RDM para semear em quatro poços de uma placa de 12 poços. Depois, use um espátula celular para destacar suavemente as células.

Pipete as células para cima e para baixo cinco vezes no poço contendo RDM, promovendo a trituração das células, e realize este passo rapidamente para evitar a readesão à placa. Transfira para um tubo cônico. Dissocie aglomerados grandes de células, mas não triture até obter uma suspensão de células isoladas.

Distribua as células uniformemente na pipeta e conclua este passo rapidamente para evitar a readesão à placa. Se desejado, utilize um microscópio óptico para observar o tamanho dos agregados celulares. Posteriormente, semeie as células em placas de 12 poços revestidas com matriz extracelular (ECM).

Incline a placa para frente e para trás para distribuir as células uniformemente pelos poços e coloque-a em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ até a próxima troca de meio. Neste procedimento, revista uma placa de seis poços com matriz extracelular com fatores de crescimento reduzidos conforme recomendações do fabricante. Deixe solidificar por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, alíquotar a quantidade necessária de DPBS e um mililitro de RDM por poço de enriquecimento e aquecê-los a 37 graus Celsius em banho-maria. Levar a enzima semelhante à tripsina à temperatura ambiente e aquecer a quantidade necessária de meio de suporte RPE a 37 graus Celsius. Depois disso, adicionar um reagente antimicrobiano e inibidor de ROCK ao RSM para atingir uma concentração final de antimicrobiano 0,5x e inibidor de ROCK a 10 micromolar.

Utilize este meio pelos primeiros quatro a sete dias para melhorar a adesão. Em seguida, aspire o meio usado de todas as placas e adicione um mililitro por poço de RDM pré-aquecido sem fatores de crescimento. Se necessário, dissecione e remova todas as células não-RPE usando uma ponteira P10 sob um microscópio estereoscópico.

Após a dissecção, aspire o meio de cultura RDM e todos os detritos celulares e lave duas vezes com um mililitro de DPBS pré-aquecido por poço. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de TDE por poço de uma placa de 12 poços e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Posteriormente, use um espátula celular para remover suavemente as células da placa.

Pipete suavemente a suspensão de células com enzima para cima e para baixo três a quatro vezes para criar uma suspensão uniforme. Em seguida, dilua a suspensão de células com enzima na proporção de um para 10 no RSM pré-aquecido sem inibidor de ROCK. Centrifugue a suspensão celular a 173g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Após cinco minutos, aspire o meio do pellet celular e re-suspenda as células em RSM com inibidor de ROCK a 10 micromolar. Em seguida, filtre as células utilizando um filtro celular de malha de náilon com poros de 40 micrômetros. Conte o número de células utilizando um hemocitômetro e calcule a concentração de células na solução filtrada.

Posteriormente, semeie as células em placas revestidas com matriz extracelular e com fatores de crescimento reduzidos, na densidade de um vezes 10 elevado a cinco células por centímetro quadrado, em quatro mililitros de RSM contendo inibidor de ROCK a 10 micromolar. Substitua o RSM com inibidor de ROCK a 10 micromolar 48 horas após a semeadura das células e continue substituindo o meio a cada três a quatro dias. Interrompa a adição de inibidor de ROCK ao RSM após quatro a sete dias.

Deixe as células amadurecerem por 28 a 35 dias a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ e continue substituindo o RSM a cada três ou quatro dias. Aqui são mostradas as células-tronco pluripotentes induzidas imediatamente antes da passagem para diferenciação. As células-tronco são pequenas e densamente empacotadas dentro das colônias, que aparentemente não contêm células diferenciadas, como fibroblastos entre elas ou áreas opacas no interior das colônias.

Aqui estão as células de EPR imaturas no dia dois. As células nesta fase ainda devem estar subconfluentes e estendendo projeções para os espaços vazios entre as células. Essas células são anteriores à seleção para remoção do enriquecimento no dia 14.

Células não-RPE aparecem como manchas ou fitas opacas. A mancha arredondada contém células com morfologia fibroblástica, enquanto as manchas opacas são consideradas retina neural. Essas imagens mostram RPE no passagem zero, um e três no dia 30.

Em cada passagem, as células devem estar confluentes e apresentar as características morfológicas típicas do epitélio pigmentado da retina, incluindo bordas fases-brilhantes e formato poligonal. Uma vez dominadas, as técnicas de repicagem e enriquecimento podem ser concluídas em uma a duas horas, dependendo da escala do cultivo celular. Após este procedimento, técnicas como quantificação de genes ou proteínas e ensaios funcionais podem ser utilizadas para responder perguntas sobre a capacidade do EPR de secretar fatores de crescimento ou fagocitar segmentos externos.

Artigos publicados por Dave Buchholz em 2013 e por Lindsay Leach em 2015 detalham o desenvolvimento e a otimização deste método. Fornecemos uma demonstração detalhada e completa de cada etapa do procedimento para torná-lo facilmente acessível aos pesquisadores da área. Boas experimentações.