Name: Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção de CRISPR/Cas9 em embriões de bagre do canal Ictalurus punctatus para edição gênica. Este protocolo validado permite estudar genômica funcional e funções de genes imunes.

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Esta pesquisa foi financiada pelo prêmio do USDA-NIFA 2015-67015-23488 para Roger Cone. Os autores agradecer Dr. Ronald Phelps para a descrição dos critérios de seleção de ações ninhada no vídeo. Ahmed Elaswad e Karim Khalil gostaria de agradecer para os egípcios Cultural e educacional em Washington DC para financiar a sua investigação de doutoramento.

Este experimento foi conduzido na unidade de pesquisa genética de peixes, E. W. Shell Fisheries Research Center, Universidade de Auburn, AL. Todos os protocolos experimentais utilizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de uso (AU-IACUC) e Auburn University institucional Cuidado Animal antes que o experimento foi iniciado. Uma lista de equipamentos e suprimentos usados neste experimento pode ser encontrada na tabela de materiais. A seguir estão as etapas e procedimentos para a preparação e microinjeção de embriões de uma célula de bagre do canal conforme ilustrado na Figura 1.
1. ninhada de desova e seleção das ações
<ol><li>Escolha saudável channel catfish estoque ninhada do estirpe ou linha genética de interesse. Fêmeas e machos de bagre do canal devem apresentar boas características de sexuais secundárias.</li>
	<li>Selecione os machos que têm uma ampla cabeça muscular que é maior do que o resto de seus corpos com papila genital bem desenvolvida. Cor escura, cicatrizes e feridas de combate territorial também são sinais de prontidão sexual. Selecionar as fêmeas que têm cabeças que são mais estreitas do que o resto de seus corpos e tem o abdômen macio, palpável, bem-arredondado. Para precisão e evitar salientando os peixes durante o tratamento inicial, pare de alimentar as fêmeas 2-3 dias antes de examinar a sua prontidão para a desova.</li>
	<li>Execute o peixe manipulação rapidamente, mas cuidadosamente. Para reduzir o estresse da manipulação, execute todos os procedimentos que exigem manipulação fêmeas enquanto segura o peixe desova sacos (malha de tamanho de 32 mm).</li>
	<li>Pouco antes da injeção de hormônio para induzir a ovulação, medir o peso do corpo das fêmeas.</li>
	<li>Pendure os desova sacos com fêmeas dentro de um fluxo através de tanque com fluxo contínuo de água e aeração adequada.</li>
	<li>Assepticamente, carrega a implantar que tem uma agulha de 14g com 85 µ g/kg de implante (LHRHa) analógico de hormônio de liberação de hormônio luteinizante. Lave o local da injeção (musculatura dorsal) com solução salina estéril 0,9%, antes da injeção. Inserir a implantar em um ângulo de 45° e liberar o implante. Retire a agulha e o local da injeção de furto com uma bola de algodão previamente embebida em etanol 70%.</li>
	<li>Lugar o saco de desova no tanque de exploração para que o peixe está completamente submersa em água 15-20 cm abaixo da superfície da água. Aeração adequada (acima de oxigênio dissolvido a 5 ppm) e a boa qualidade da água são importantes para a ovulação de ovos de alta qualidade.</li>
	<li>Prever o tempo de ovulação baseado na temperatura da água, usando a relação de graus-hora (h)35. Tempo de resposta de grau-h = tempo entre a injeção de hormônio e ovulação (h) * temperatura (° C) de água. Por exemplo, para um tempo de resposta de grau-h de 900-1000, uma fêmea é esperada para desovar em 36-40 h de tempo de injeção de hormônio a 25 ° C. Geralmente, o primeiro cheque para ovos é feito em cerca de 36 h após a injeção de hormônio e, depois, no intervalo de 4h.</li>
	<li>Para verificar se há ovulação, retire o saco de desova acima da superfície da água enquanto você está procurando os ovos que estão conectados dentro do saco de desova. Vendo pelo menos 10 ovos indica esta fêmea ovulating e pronto para descascar da mão.</li>
</ol>2. preparação de esperma
Nota: Esperma pode ser preparada alguns h antes do tempo esperado da ovulação.
<ol><li>Eutanásia em machos por uma percussão pancada na cabeça sem anestesia, desde que a anestesia pode ter um efeito negativo na mobilidade do esperma.</li>
	<li>Recolher os testículos em uma panela pequena de pesagem, remover todo o tecido e lave-os com 50 mL de solução salina 0,9% para remover o sangue, se necessário. Testículos bem desenvolvidos são brancos com muitas projeções villiform ( Figura 2).</li>
	<li>Determine o peso dos testículos.</li>
	<li>Para preparar a solução de esperma para fertilização do ovo, transferi os testículos para o centro de um 100 cm2 100 µm de malha usando fórceps. Dobre a malha com os testículos dentro, esmagar os testículos e o esperma do filtro em um tubo de coleta de 50 mL. Isso pode ser feito através da aplicação de pressão para testículos dentro da malha contra a borda do tubo da coleção através do polegar. Use solução salina 0,9% para lavar o esperma da malha no tubo de coleta. Solução salina pode ser adicionada até 10 mL/g de testículos.</li>
	<li>Determinar a concentração do esperma, verificar a motilidade e viabilidade. Nota: A concentração pode ser determinada através da contagem de espermatozoides num volume conhecido diluídos de milt usando um hemocytometer. Alternativamente, a densidade do esperma pode ser estimada através da avaliação da densidade óptica de milt usando um espectrofotômetro. Neste método, a absorção, o comprimento de onda 505 nm é comparada a um gráfico de controle que foi previamente preparado para a absorção de diferentes concentrações de esperma36. Mobilidade do esperma pode ser verificada sob o microscópio, como o tempo de ativação do esperma até cessação do esperma movimento (chamado a duração da motilidade)37. A viabilidade do esperma pode ser determinada pela coloração do esperma com corantes seletivos como trypan azul, que manchará espermatozoides só não viáveis, enquanto esperma viável permanecerá imaculada. No entanto, para esses procedimentos de microinjeção, isso não é necessário se os testículos são bem desenvolvidos.</li>
	<li>Armazenar esperma em soro fisiológico a 0,9% da etapa 2.5 a 4 ° C e usar dentro de 24 horas após o preparo.</li>
</ol>3. recolha e fertilização do ovo
<ol><li>Aplique uma camada muito fina de gordura para um diâmetro de 20 cm limpo e seco desova pan vegetal.</li>
	<li>Coloque a fêmea na solução anestésica contendo 100 ppm de sulfonato de metano tricaina tamponada com bicarbonato de sódio (pH da solução final deve ser 7.0) até que o peixe é completamente anestesiados38. Cuidado: Tricaina sulfonato de metano pode ser irritante se inalado, ingerido ou absorvido pela pele.</li>
	<li>Com cuidado, retire o peixe do saco desova e mergulhá-lo em soro fisiológico a 0,9% para lavar a solução anestésica. Seca o peixe completamente usando uma toalha limpa, evitando a remoção da camada de muco na superfície do corpo de peixe.</li>
	<li>Aplica gordura vegetal na área em torno do respiradouro, incluindo as nadadeiras pélvicas, para evitar a penhora dos ovos durante o descascamento de mão.</li>
	<li>Mão tira os ovos na panela untada desova, aplicando uma pressão suave para os ovários. Ovos bons devem fluir livremente, ser amarelo dourado na cor e têm mínimos ou sem grumos ou coágulos de sangue (Figura 2). Evite o contacto entre ovos e água antes de fertilização, como a água pode estimular fechamento micrópila.</li>
	<li>Para fertilizar os ovos para microinjeção, transferi 200 – 300 ovos para uma desova untada. Planta de plástico untado rótulos pode ser usadas como uma colher para transferir os ovos para a desova untada. Adicionar 1-2 mL da solução de esperma (da etapa 2.5) com os ovos e misture delicadamente. O rácio de esperma para ovo deve ser aproximadamente 11.000 esperma e do ovo.</li>
	<li>Adicione água doce para os ovos para ativar os espermatozoides e óvulos. Adicione água suficiente para cobrir um pouco os ovos. Agite suavemente os ovos por 30 s. fertilização deve ocorrer em 1 a 2 min. É importante fertilizar os ovos que estão dispostos em uma única camada. Ovos de peixe-gato aderirem ao outro dificultando a microinjeção de múltiplas camadas de embriões.</li>
	<li>Adicionar mais água doce para os ovos fertilizados e permitir que os ovos endurecer por 10 a 15 min.</li>
	<li>Tampe a panela desova contendo o restante dos ovos não fertilizados em uma toalha molhada para evitar a secagem e fertilizar durante algumas horas. Fertilização pode ser feita de forma escalonada, por exemplo,, um lote de 200 – 300 ovos podem ser fertilizado cada 30-60 min para garantir um fornecimento contínuo de embriões na fase de uma célula para microinjeção e controle não injectada embriões. Evite o contacto entre a toalha molhada e os ovos como os ovos podem aderir a toalha molhada, tornando difícil para removê-los. Neste protocolo, ovos fertilizados dentro de 2-3 h após o descascamento foram injetados com eficiência e teve sucesso similar como ovos fertilizados imediatamente após o descascamento.</li>
</ol>4. agulha puxando e carregamento
<ol><li>Colocar um vidro de borosilicato de OD 1,0 mm capilar 2 agulhas (Figura 3). Armazene as agulhas em uma caixa de papel com um pedaço de esponja em que foram feitas várias incisões. Para evitar quebrar a agulha, o diâmetro da esponja deve ser menor que o comprimento da haste da agulha.</li>
	<li>Abra a ponta da agulha, quebrando um pedaço pequeno de região mais fina da agulha, usando um objeto pontiagudo. Como alternativa, abra a agulha por beliscar fora da região mais fina da ponta com pinça sob o microscópio.</li>
	<li>Prepare a solução de injeção através da mistura de gRNA(s) com Cas9 proteína. Outros tipos de RNA ou proteína também podem ser injetados com o mesmo procedimento. Neste protocolo, gRNAs foram projetados para alvo dois dos bagres do canal imune relacionados genes, pedágio/interleucina 1 receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM1) gene e gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose e preparados de acordo com Soares et al. com o uso de uma alta fidelidade Taq polimerase32,39. As metas de genômicas para gRNAs eram 5' GGA GGT GAA GCA CGT GGA de CGA 3' do gene TICAM 1 (Figura 4) e 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' exon 1 do gene RBL com motivo de protospacer adjacentes (PAM) sequência sublinhada (Figura 6).<ol>
<li>Alvos de guia RNA explosão contra o genoma channel catfish sequenciar e selecionar aqueles com nenhum potenciais sites fora do alvo.</li>
		<li>Vermelho de fenol Adicione cor a proteína gRNA/Cas9 misturar-se a um terço do volume total.</li>
		<li>Ajustar a concentração final da mistura de proteína de gRNA/Cas9 com água livre de nuclease, para que cada embrião é injetado com 50 nL contendo aproximadamente 2,5 ng gRNA e 7,5 ng Cas9 de proteína. Incube a mistura durante 10 minutos no gelo antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com um microloader, carrega 5 – 10 µ l da mistura de gRNA/Cas9 para a agulha de injeção introduzindo o microloader na haste da agulha e expulsando a mistura lentamente enquanto retrai a ponta de microloader (Figura 3). Evite aprisionando bolhas de ar dentro.</li>
	<li>Anexar a agulha para o titular micropipeta e garantir uma conexão apertada e em seguida, anexar o titular para o micromanipulador. Garantir a livre circulação estável. Aplique pressão para microinjection abrindo o cilindro de nitrogênio e ajustar o regulador de pressão. Nota: O volume de injeção pode ser afetado pela pressão, diâmetro da abertura da agulha e a duração da injeção. Para determinar o volume a injectar, injete uma gota de óleo mineral, colocado em um hemocytometer. Se necessário, a pressão, a duração da injeção e o diâmetro da agulha pode ser ajustada para aumentar ou diminuir o volume da injeção. Injecte várias vezes o óleo mineral para garantir volume consistente.</li>
</ol>5. microinjeção de embriões de peixe-gato
<ol><li>Aplica uma camada muito fina de gordura para um prato de Petri limpo 100mm vegetal.</li>
	<li>Usando um rótulo de planta de plástico untado, transferir 50 – 100 ovos da fertilização panela para o prato de Petri e cubra-os com solução de Holtfreter (tabela de materiais). Alinhe os ovos uns contra os outros em uma única camada. Este alinhamento deve manter os ovos no lugar durante o processo de microinjeção.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri com os ovos no palco do microscópio e segure-o com uma mão. Abaixe a agulha com a outra mão (Figura 3) até que perfure o córion e a gema em um único movimento suave. A ponta da agulha deve ser tão próxima quanto possível para o discoidal antes de entregar o material de injeção.<ol>
<li>Pressione o pedal para entregar o material de injeção para a gema. Se o discoidal não é claramente visível, o material de injeção pode ser espalhado em diferentes locais a gema. Para isso, a agulha é inserida até o final da gema e, em seguida, pressionando o pedal e retirar a agulha são feitas simultaneamente para espalhar o material de injeção através de diferentes áreas da gema. Até 50 nanoliters pode ser injetado a gema do bagre do canal embriões, no entanto, a quantidade de proteína de gRNA/Cas9 precisa ser otimizado para cada gene alcançar os melhores resultados para a mutação taxa e embrião sobrevivência32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a agulha suavemente para não danificar o ovo. Mova a placa de Petri para injetar outro ovo com o mesmo procedimento. Evite movimento da caixa de Petri durante o processo de injeção, pois isso pode danificar o ovo ou quebrar a agulha. Remova os ovos que se rompeu ou danificados devido a microinjeção. A injeção pode ser iniciado em 15 – 20 min após a fertilização e continuar enquanto os embriões estão ainda em fase de uma célula (até cerca de 60-90 min após a fertilização).</li>
	<li>Coloque embriões injetados em solução do Holtfreter com 10 ppm de doxiciclina e aeração suave contínua por 6-7 dias até40de incubação. Alterar a solução diariamente e remover os embriões mortos.</li>
</ol>6. mutação deteção
<ol><li>Aleatoriamente, coletar vários embriões injetados na fertilização post de 72 h, retire a gema e extrair DNA genômico. Incluem os embriões não injectada de 3 – 5 como um controle. Nota: DNA genômico pode ser extraído de embriões após a remoção das cascas de ovos e material de gema usando digestão proteinase K e precipitação de etanol32.</li>
	<li>Amplifica um segmento de ADN flanqueando os alvos genômicos para gRNA de cada gene, onde as mutações são esperadas para ocorrer, usando uma alta fidelidade Taq polimerase32. Para TICAM 1, as primeiras demão 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (em frente) e 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (reverso) foram utilizados para amplificar um 750 bp enquanto para RBL, as primeiras demão 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (em frente) e 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (reverso) foram usados para amplifica um segmento bp 375 do gene de RBL.<ol>
<li>Use a seguinte reação de PCR: até 20 água de µ l do PCR da classe; 1 x alta fidelidade amortecedor da reação da enzima Taq com MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 µM para cada um da cartilha frente e verso do mesmo conjunto, 100-300 ng DNA genômico e 1,25 unidades de mistura de enzima Taq alta fidelidade. Executar o ciclismo condições do PCR: desnaturação inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 30 s, recozendo a 60 ° C para 55 s para TICAM e 40 s para RBL, extensão a 72 ° C, durante 1 min/kb; e uma extensão final a 72 ° C por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectar os embriões mutantes usando um método de deteção de mutação como sequenciamento de purificado produtos PCR, ensaios de deteção de mutação de agrimensor, ensaio de mobilidade doheteroduplex, perda do sítio de reconhecimento de enzima de restrição, ou qualquer outro método de deteção mutação que é apropriado para o alvo. Neste protocolo, detecta embriões mutantes usando o ensaio de deteção de mutação surveyor para TICAM 1 e perda da enzima de restrição que SAPI corte local, bem como a sequenciação de purificado produtos PCR para o gene RBL.</li>
	<li>Para identificar os alelos mutantes, clone produtos do PCR e vetores da sequência das colônias individuais. Os alelos mutantes, apresentados na Figura 4 e Figura 6 veio de embriões injetados. Produtos PCR de seis injetadas e embriões de controle 3 para cada gene foram agrupados em dois tubos separados, um para embriões microinjected e o outro para embriões de controle, rapidamente clonados e 86 vetores para TICAM 1 e 48 vetores para gene RBL sequenciado, incluindo 8 reações de 3 embriões não injectada de controle para cada gene de sequenciamento.</li>
	<li>Para identificar diferentes alelos mutantes, compare as sequências de embriões mutantes para a sequência de tipo selvagem usando qualquer ferramenta de alinhamento de sequência de DNA como explosão ou T-café.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

Foi apresentado um protocolo detalhado para microinjeção de embriões de bagre do canal para conseguir o nocaute do gene. Injeção de proteína CRISPR/Cas9 a gema é muito mais simples, economiza tempo e não requer treinamento extensivo em relação ao microinjecting o discoidal do embrião de uma célula, que é a técnica comum para a maioria das transferência do gene e gene edição com peixe 30 , 42. o protocolo atual provou para ser bem sucedido na indução puntuais em c...

Microinjeção é uma técnica comum de laboratório usada para entregar uma pequena quantidade de uma substância como DNA, RNA, proteínas e outras macromoléculas em células ou de embriões através de um capilar de vidro1. Microinjeção é executada usando a instalação de equipamentos especiais, incluindo um microinjector e um microscópio2micromanipulador. A técnica tem sido usada por pesquisadores para modificar geneticamente muitos organismos através da geração de transgênicos, gene nocautes e terapia genética, com o objectivo de compreensão da dinâmica dos componentes intracelulares3,4 , 5.
O bagre do canal (Ictalurus punctatus) é as mais populares espécies de bagres na aquicultura e actividades de pesca recreativa nos Estados Unidos. Há uma crescente necessidade de estudar a genómica funcional em bagre do canal, e o sequenciamento do genoma completo de bagre do canal aumenta a utilidade dos avanços recentes em6,de ferramentas de edição do genoma7. Compreender a função do gene teria não só enriquecer a pesquisa que está sendo realizada no peixe-gato, mas também pode levar à programas de melhoramento genético mais eficazes para melhorar a indústria de peixe-gato. Uma vez identificados os genes críticos para uma determinada característica de interesse, eles podem ser usados para melhorar geneticamente produção de bagre através do genoma de edição para gerar alelos benéficos, seleção para estes alelos, suprimindo os alelos prejudiciais, transferência os alelos benéficos através de transgênese, ou uma combinação destas opções. Combinar os melhores genes para diferentes características comercialmente vantajoso de espécies diferentes em um peixe extremamente iria melhorar a produtividade e rentabilidade da produção de peixe operações8.
Nocaute do gene é um método direto para o estudo de funções do gene em vivo. Mutações no nível do DNA serão herdadas pelas gerações futuras, que facilitarão o estudo de seus efeitos em diferentes gerações. Ferramentas de edição de genoma diferentes foram desenvolvidos incluindo zinco dedo as nucleases (ZFNs), transcrição nucleases activator como efetoras (TALENs) e agrupado regularmente intercalada curta palíndromo repetições/CRISPR-proteína associada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
O sistema CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficiente que tem sido usada para editar sequências genomic DNA, incluindo o nocaute do gene em peixes através de RNA guiadas site-specific DNA clivagem5,13. O sistema consiste de um RNA guia (gRNA), que determina a sequência alvo do genoma e uma enzima endonuclease de DNA, Cas9. O sistema CRISPR/Cas9 pode ser projetado para qualquer sequência no genoma com várias vantagens sobre ZFNs e TALENs-alvo: (1) baixo custo de engenharia (2) mais fácil ligação (3) mais específica do guia do RNA para a sequência do alvo e reduzida mutações fora do alvo (4) várias sequências podem ser direcionadas com gRNA diferente com a mesma taxa de mutagénese alta de tempo (5) nos genes que poderia não ser mutado por TALENs e (6) taxa de transmissão do germline melhorada de mutações para cima para 6-fold quando comparado com ZFNs e TALENs14, 15,16,17,18.
O principal método alternativo para o microinjection é electroporation, no qual os impulsos elétricos são aplicados a embriões ou células para aumentar a permeabilidade da membrana e a absorção de moléculas biológicas19,20. Vários peixes transgênicos foram gerados usando electroporation como medaka (Oryzias latipes), peixe-zebra (Danio rerio), salmão chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre de canal, goraz (amiláceos sarba), e comum carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Electroporation serviu para fornecer proteína de DNA, RNA e Cas9 plasmídeo nocaute do gene. Em células de mamíferos, Cas9/gRNA plasmídeo, Cas9 mRNA/gRNA e complexos de proteína/gRNA Cas9 foram entregues usando electroporation e as taxas de mutagênese foram mais altos usando Cas9 proteína/gRNA complexos para a maioria de condições testadas electroporation27. Os Cordados urocordado (Ciona intestinalis), TALENs expressando construções foram electroporated em ovos fertilizados para induzir o nocaute de múltiplos genes28. ZFNs expressando de shRNA construções foram electroporated para nocautear o hormônio luteinizante em bagre do canal29. No entanto, uma vez introduzido na célula, construções de plasmídeo precisará ser transcrito para o RNA e traduzido para proteínas funcionais antes que eles podem direcionar a sequência de DNA desejada, que provavelmente iria atrasar a hora de mutagénese comparado a microinjeção de RNA / proteína. Como um embrião está se desenvolvendo, mutagênese retardada aumenta o mosaicismo dos fundadores injetados. Além disso, expressão transgênica é improvável alcançar o nível de expressão possível com microinjeção, reduzindo a eficiência de mutagénese.
Como um meio para a introdução de ferramentas de edição do genoma em células, microinjeção tem várias vantagens sobre eletroporação. Edição de moléculas de genoma pode ser confiantemente introduzida em células ou de embriões através de microinjeção de30. Menos material de injeção é necessária. É fácil determinar as quantidades de material injetado. Maior mutação taxas com mosaicismo baixa no peixe fundador podem ser alcançado que melhorariam germline transmissão de mutações de F-1. Menos peixes fundador precisam ser analisado para produzir a primeira geração, devido à maior taxa de mutação. Na eletroporação, mais peixes fundador precisam ser analisado que aumentará os custos. No entanto, a sobrevivência de embriões channel catfish injetadas é inferior a electroporated os, embora isto pode ser superado pela injeção de mais embriões31,32. Em bagre do canal, sobrevivência de embriões de gema-injetadas variou entre 16 e 55%, dependendo dos genes alvo e a dosagem de proteína gRNA/Cas932.
Microinjection regular de embriões de peixe-gato é tecnicamente exigente e demorado, no entanto, um protocolo de microinjeção rápido e eficiente CRISPR/Cas9 proteína é apresentado para embriões de bagre do canal. Este protocolo requer menos tempo e experiência desde a solução de proteína CRISPR/Cas9 é injectada a gema de um embriões de célula. Centenas de ovos fertilizados podem ser injetadas em 1h (aproximadamente o tempo necessário para a primeira divisão celular ocorra). Para validar o protocolo, dois genes de suscetibilidade-relacionados de doença foram eliminados em bagre do canal, o gene molécula (TICAM1) do adaptador de domínio-contendo do pedágio/interleucina 1 receptor e o gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose. TICAM 1 está envolvido na via de sinalização iniciada por receptores do tipo toll (TLR) 3. Em bagre do canal, 1 TICAM foi dramaticamente upregulated seguindo o desafio bacteriano com Edwardsiella ictaluri, enquanto era ativador em bagre azul, uma espécie resistente à ictaluri E.33. RBL desempenha um papel importante na infecção precoce com Flavobacterium columnare, o agente causador da doença de columnaris, onde aguda e upregulation robusto foi gravado em uma cepa de bagre de canal columnaris-sensíveis em comparação com um estirpe resistente columnaris34.

<table><tbody><tr><td>Implante Reproboost</td><td>Centro de Biotecnologia Marinha</td><td></td><td>Análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRHa) para indução da ovulação em fêmeas de bagre de canal</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>Para sedação de peixes reprodutores durante a injeção de hormônio e remoção de ovos.</td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0,5%, filtrado estéril</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Olympus</td><td>213709</td><td>Para visualizar os ovos durante a microinjeção</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>Modelo MPPI-3</td><td>Para a entrega do material de injeção nos embriões</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>Modelo MM33&nbsp;</td><td>Para segurar e controlar o movimento da agulha de injeção.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcarregador Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>5242956.003</td><td>Para carregar solução de injeção em agulhas de microinjeção.</td></tr><tr><td>Extrator de agulhas vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 720</td><td>Para puxar agulhas de microinjeção</td></tr><tr><td>Proteína Cas9</td><td>PNA Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>Proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyrogenes.</td></tr><tr><td>Expanda o sistema de PCR High FidelityPLUS</td><td>&nbsp; Roche Diagnostics, EUA</td><td></td><td>Para PCR e amplificação de modelos de DNA a serem usados na preparação de gRNA</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1 mm de diâmetro externo (OD), para fazer agulhas de microinjeção.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Para segurar os embriões durante a microinjeção.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>Gordura vegetal para revestimento de panelas de desova e placas de Petri.&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução da Holtfreter</td><td>Home Made</td><td></td><td>59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 para incubar os embriões microinjetados até a eclosão.&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidrato de doxiciclina USP (monohidratado)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Antibiótico adicionado à solução da Holtfreter a 10 ppm para prevenir infecções bacterianas.</td></tr></tbody></table>

microinjeção de proteína crispr/cas9 em bagre do canal, ictalurus punctatus, embriões para gene editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

O genoma completo do bagre do canal, Ictalurus punctatus, foi sequenciado, levando a maiores oportunidades para estudar a função do gene de bagre do canal. Nocaute de gene tem sido usada para estudar estas funções de gene em vivo. O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema é uma poderosa ferramenta usada para editar sequências genomic do DNA para alterar a função do gene. Embora a abordagem tradicional tem sido introduzir os embriões de célula única através de microinjeção CRISPR/Cas9 mRNA, esse pode ser um processo lento e ineficiente em bagre. Aqui, um protocolo detalhado para microinjeção de embriões channel catfish com proteína CRISPR/Cas9 é descrito. Brevemente, óvulos e espermatozoides foram coletada e então artificial fertilização realizada. Ovos fertilizados foram transferidos para uma placa de Petri contendo solução do Holtfreter. Volume de injeção foi calibrada e então guia RNAs/Cas9 alvejando o pedágio/interleucina 1 receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM 1) gene e gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose foram injetadas na gema de uma célula de embriões. O nocaute do gene foi bem-sucedido como puntuais foram confirmados por sequenciamento de DNA. As alterações de sequência da proteína predita devido a estas mutações incluíam frameshift e truncado proteína devido códons de parada prematura.

Para demonstrar a eficiência do protocolo microinjeção, foram injetadas gRNAs projetados para atingir o channel catfish pedágio/interleucina 1 gene do receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM1) e ramnose gene de lectina (RBL) de vinculação.
TICAM 1 Sequenciamento de DNA de vetores de colónias individuais de produtos PCR em pool, clonados revelou as mutações indel induzidas em TICAM 1 gene. A taxa d...

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em embriões de bagre de canal, Ictalurus punctatus para edição de genes. O desenvolvimento de um protocolo confiável e eficiente para edição de genes direcionados em bagres de canal é crucial para o estudo da genômica funcional. Especialmente depois que os recursos genômicos foram enriquecidos pelo sequenciamento do genoma do bagre do canal.Aqui apresentamos um protocolo detalhado para edição do genoma CRISPR/Cas9 em bagres de canal. Este protocolo foi desenvolvido e validado visando dois genes relacionados ao sistema imunológico do bagre de canal. O domínio do receptor Toll/interleucina-1 contendo molécula adaptadora, ou gene TICAM1, e a lectina de ligação à ramnose ou gene RBL.Todos os procedimentos foram realizados na unidade de pesquisa em genética de peixes do Centro de Pesquisa de Pesca de Conchas EW da Universidade de Auburn, no Alabama. Seleção e desova de estoque de ninhada. Escolha um estoque de ninhada de bagre de canal saudável de uma cepa ou linha genética que você gostaria de editar.Machos e fêmeas de bagres de canal devem exibir boas características sexuais secundárias. Selecione machos que tenham uma cabeça larga e musculosa que seja mais larga do que o resto do corpo com uma papila genital bem desenvolvida. A cor escura e as feridas cicatrizantes dos combates territoriais também são sinais de prontidão sexual.Selecione fêmeas que tenham cabeças mais estreitas do que o resto do corpo e tenham um abdômen macio, palpável e bem arredondado. Para maior precisão e para evitar estressar os peixes durante o manuseio inicial, pare de alimentar as fêmeas dois a três dias antes de examinar sua prontidão para a desova. O manuseio de peixes deve ser feito rapidamente, mas com cuidado, para reduzir o estresse de manuseio.Todos os procedimentos que requerem o manuseio das fêmeas devem ser feitos enquanto os peixes são mantidos em sacos de desova. Pouco antes da injeção de hormônio, obtenha o peso corporal das fêmeas. Os sacos de desova com fêmeas dentro podem ser pendurados em um tanque de fluxo contínuo com fluxo contínuo de água e aeração adequada.Carregue assepticamente o implantador que possui uma agulha de calibre 14 com 85 microgramas por quilograma de análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante. LHRHA. Enxágue o local da injeção e a musculatura dorsal com solução salina estéril a 0,9% antes da injeção. Insira o implantador em um ângulo de 45 graus e solte o implante.Retire a agulha e limpe o local da injeção com um algodão previamente embebido em etanol 70%. Coloque o saco de desova no tanque de retenção para que o peixe fique completamente submerso na água 15 a 20 centímetros abaixo da superfície da água. A aeração adequada, incluindo cinco ou mais partes por milhão de oxigênio dissolvido, a boa qualidade da água são importantes para a ovulação de óvulos de alta qualidade.Preveja o tempo de ovulação com base na temperatura da água usando a relação graus-hora. Normalmente, a primeira verificação de óvulos é feita cerca de 36 horas após a injeção do hormônio e, em seguida, em intervalos de quatro horas. Para verificar a ovulação, levante suavemente o saco de desova acima da superfície da água enquanto procura os óvulos que estão presos ao interior do saco.Quando você vê ovos de pelo menos 10 ou mais, esta fêmea está ovulando e pronta para a remoção manual. Preparação de espermatozoides. O esperma pode ser preparado algumas horas antes do tempo esperado de ovulação.Os peixes machos são sacrificados e os testículos são coletados em uma pequena bandeja de pesagem. Determine o peso dos testículos. Remova qualquer tecido e lave os testículos com soro fisiológico a 0,9% para remover o sangue, se necessário.Os testículos bem desenvolvidos são brancos com muitas projeções viliformes. Esmague os testículos e filtre o esperma usando uma malha de 100 mícrons. Use solução salina a 0,9% para lavar o esperma da malha em um tubo de 50 mililitros.A solução salina pode ser adicionada até 10 mililitros por grama de testículos. Determine a concentração do esperma. Verifique a motilidade e a viabilidade.No entanto, para esses procedimentos, isso não é necessário se os testículos estiverem bem desenvolvidos. O esperma pode então ser armazenado a quatro graus C e deve ser usado dentro de 24 horas após a preparação. Coleta de óvulos e fertilização.Aplique uma camada muito fina de gordura vegetal em uma bandeja de desova limpa e seca de 20 centímetros de diâmetro. Coloque a fêmea em uma solução anestésica contendo 100 partes por milhão de metanossulfonato de tricaína tamponado com bicarbonato de sódio até que o peixe esteja completamente anestesiado. Remova cuidadosamente o peixe do saco de desova e mergulhe-o em solução salina a 0,9% para lavar o anestésico.Seque o peixe completamente com uma toalha limpa, evitando a remoção da camada de muco na superfície do corpo do peixe. Aplique gordura vegetal na área ao redor da abertura, incluindo as barbatanas pélvicas, para apresentar a fixação dos ovos durante a remoção manual. Retire os ovos manualmente na bandeja de desova untada aplicando uma leve pressão nos ovários.Bons ovos devem fluir livremente, ser de cor amarelo dourado e ter pouco ou nenhum aglomerado ou coágulo sanguíneo. Evite o contato entre os ovos e a água antes da fertilização, pois a água pode estimular o fechamento da micrópila. Para fertilizar os ovos para microinjeção, transfira para 200-300 ovos para a bandeja de desova untada.Adicione um a dois mililitros da solução de esperma aos óvulos e misture delicadamente. Adicione água fresca aos óvulos para ativar o esperma e os óvulos. Água suficiente deve ser adicionada para cobrir ligeiramente os ovos.Agite suavemente os ovos por 30 segundos. A fertilização deve ocorrer em um a dois minutos. É importante fertilizar os ovos em uma única camada.Os ovos de peixe-gato aderem uns aos outros, dificultando a microinjeção de várias camadas de embriões. Adicione mais água fresca aos ovos fertilizados e deixe os ovos endurecerem por 10 a 15 minutos. Os ovos não fertilizados restantes podem ser cobertos por uma toalha molhada para evitar o ressecamento e podem ser fertilizados em algumas horas.A fertilização pode ser feita de forma escalonada. Um lote de dois a 300 óvulos pode ser fertilizado a cada 30 a 60 minutos para garantir o fornecimento contínuo de embriões no estágio de uma célula para a microinjeção e controlar embriões não injetados. Agulha puxando e carregando.Puxe um capilar de vidro de borossilicato de um milímetro OD em duas agulhas. Guarde as agulhas em uma caixa de papel com um pedaço de esponja na qual foram feitas várias incisões. Para evitar quebrar a agulha, o diâmetro da esponja deve ser menor que o comprimento da haste da agulha.A ponta da agulha pode então ser aberta quebrando um pequeno pedaço da agulha na região mais fina usando um objeto pontiagudo. Alternativamente, a agulha pode ser aberta beliscando a região mais fina da ponta com um par de pinças ao microscópio. Prepare a solução injetável misturando RNAs guia com a proteína Cas9.O vermelho de fenol pode ser adicionado para colorir a mistura de proteínas Cas9 do RNA guia, com o vermelho de fenol constituindo até um terço do volume total. A mistura é então incubada por 10 minutos no gelo antes do uso. Com um microcarregador, carregue 5-10 microlitros da mistura de RNA guia Cas9 na agulha de injeção.Inserindo o micro carregador na haste da agulha e expelindo a mistura lentamente enquanto retrai a ponta do micro carregador. Evite prender bolhas de ar no interior. Conecte a agulha ao porta-micropipeta e certifique-se de uma conexão firme.Em seguida, conecte o suporte ao micro manipulador. Garanta um movimento livre e estável. Aplique pressão para microinjeção abrindo o cilindro de nitrogênio e ajustando o regulador de pressão.O volume da injeção pode ser afetado pela pressão, pelo diâmetro da abertura da agulha e pela duração da injeção. Para determinar o volume que deseja injetar, injete em uma gota de óleo mineral colocada em um hemocitômetro. Se necessário, a pressão e o diâmetro da agulha podem ser ajustados para aumentar ou diminuir o volume da injeção.Injete várias vezes no óleo mineral para garantir um volume consistente. Micro injeção de embriões de bagre. Aplique uma camada muito fina de gordura vegetal em uma placa de Petri limpa de 100 milímetros.Transfira 50 a 100 ovos da bandeja de fertilização para a placa de Petri e cubra-os com a solução de Holtfreter. Os ovos devem ser alinhados uns contra os outros em uma única camada. Esse alinhamento deve manter os ovos no lugar durante o processo de microinjeção.Coloque a placa de Petri com os ovos no palco do microscópio e segure-a com uma mão. Abaixe a agulha com a outra mão até perfurar o córion e a gema em um único movimento suave. A ponta da agulha deve estar o mais próximo possível do blastodisco antes de administrar o material de injeção.Pressione o pedal e entregue o material de injeção na gema. Se o blastodisco não estiver claramente visível, o material de injeção pode ser espalhado em diferentes locais ao longo da gema. Para fazer isso, a agulha é inserida na extremidade da gema.Em seguida, pressione o pedal e retire a agulha simultaneamente. Isso espalha o material de injeção em diferentes locais ao longo da gema. 50 nanolitros contendo 2,5 nanogramas de RNA guia e 7,5 nanogramas de proteína Cas9 podem ser injetados na gema sem problemas.Retraia a agulha suavemente para não danificar o ovo. Em seguida, mova a placa de Petri para injetar outro óvulo com o mesmo procedimento. Evite o movimento da placa de Petri durante o processo de injeção, pois isso pode danificar o ovo ou quebrar a agulha.Remova os ovos que estão rompidos ou danificados devido à microinjeção. A injeção pode ser iniciada 15 a 20 minutos após a fertilização e continuar enquanto os embriões ainda estiverem no estágio de uma célula. Os embriões injetados são colocados de volta na solução de Holtfreter com 10 PPM de doxiciclina e aeração contínua por seis a sete dias até a eclosão.A solução é trocada diariamente e os embriões mortos são removidos. Resultados. Esta figura mostra as mutações induzidas por CRISPR/Cas9 no gene TICAM1 do bagre do canal. A sequência azul representa o motivo adjacente ao protoespaçador ou PAM, enquanto a sequência verde representa o alvo para o RNA guiado.Esperava-se que uma quebra de fita dupla induzida pela proteína Cas9 ocorresse no local dos dois triângulos vermelhos. As mutações de deleção são representadas por uma linha tracejada, na qual cada traço corresponde a um nucleotídeo que foi excluído. As sequências vermelhas são inserções, enquanto as roxas representam a mutação de substituição.Frações de 78 representam o número de alelos mutados em 78 reações de sequenciamento. Por exemplo, 3/78 significa que um alelo foi detectado em três reações de sequenciamento de um total de 78 reações. A taxa de mutação foi de 79,2% em 24 indivíduos analisados.As mutações resultaram na remoção de muitos aminoácidos da proteína, alterando o quadro de leitura a jusante e o término prematuro da tradução. Na maioria das mutações, mais de 80% da sequência de proteína prevista para TICAM1 foi truncada devido ao códon de parada prematura. Esta figura mostra mutações induzidas por CRISPR / Cas9 no gene RBL do bagre do canal.As sequências exônicas são maiúsculas, enquanto as sequências intrônicas são letras minúsculas. As sequências azuis representam o motivo adjacente ao protoespaçador, enquanto a sequência verde representa o alvo do RNA guiado. Esperava-se que uma quebra de fita dupla induzida pela proteína Cas9 ocorresse no local dos dois triângulos vermelhos.As mutações de deleção são representadas por uma linha tracejada na qual cada traço corresponde a um nucleotídeo que foi excluído. Sequências vermelhas são inserções. Frações de 40 representam o número de alelos mutados em 40 reações de sequenciamento.Por exemplo, 2/40 significa que um alelo foi detectado em duas reações de sequenciamento de um total de 40 reações. A taxa de mutação foi de 87,5% em 40 indivíduos analisados. As deleções variam de cinco pares de bases a 183 pares de bases, enquanto até 20 pares de bases foram inseridos.Mais de 70% dos indels resultaram em proteína truncada que era 10% ou menos do que o comprimento da proteína do tipo selvagem. Neste vídeo, demonstramos como microinjetar a proteína CRISPR/Cas9 em embriões de bagre de canal celular. Os procedimentos descritos são simples, rápidos e eficientes.E alcançou com sucesso o nocaute genético em dois genes de bagre de canal. TICAM1 e RBL. Dependendo do que está sendo injetado, o protocolo pode ser modificado para incluir outras substâncias biologicamente ativas.Também pode ser modificado para micro injetar outras espécies de bagres ou outras espécies de peixes que tenham estrutura e composição de ovos semelhantes.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Aprenda a técnica de microinjeção de CRISPR/Cas9 em embriões de bagre do canal Ictalurus punctatus para edição gênica. Este protocolo validado permite estudar genômica funcional e funções de genes imunes.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

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