Construção e avaliação de um modelo murino de osteólise raspagem pela exposição a partículas de CoCrMo no afrouxamento asséptico
17 de fevereiro de 2018
Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise raspagem por exposição a partículas CoCrMo, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células no afrouxamento asséptico.
O objetivo geral deste procedimento é construir e avaliar o Modelo de Osteólise Calvarial Murina por exposição a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdênio. A osteólise induzida por partículas de desgaste é uma das principais causas de afrouxamento asséptico na falha da artroplastia, mas a mecânica subjacente a isso não é clara. Devido ao longo tempo de seguimento e à ocorrência esporádica, é difícil explorar a parthogênese da soltura asséptica em casos clínicos.
Portanto, um modelo animal de desgaste é necessário para um estudo mais aprofundado. Em nosso laboratório, um modelo de osteólise calvarial murial construído por partícula de liga de cobalto é um modelo eficaz para estudar a partogênese da soltura asséptica. Isso é feito primeiro gerando partículas de cobalto-cromo-molibdênio em nanoescala a partir de próteses de liga de cobalto e ressuspendendo-as em solução salina tampão fosfato a uma concentração de 15 miligramas por mililitro.
O próximo passo é identificar a posição da incisão em uma linha entre os dois pontos médios entre dois olhos e orelhas, respectivamente. Em seguida, remova o periósteo craniano da calvária por dissecção de choque. Em seguida, pegue 50 microlitros de estoque de nanopartículas de liga de cobalto e incorpore-os na sutura do meio da calvária.
Após duas semanas de manutenção, sacrifique alguns camundongos e colete a calvária para avaliação da osteólise. A osteólise é óbvia em camundongos tratados com nanopartículas de liga de cobalto, tanto em imagens de micro-CT quanto de coloração H e E. Obtenha liga de cobalto-cromo-molibdênio a partir de próteses de liga de cobalto, obtendo partículas de cobalto-cromo-molibdênio a partir de liga de cobalto-cromo-molibdênio por corrente contínua de três eletrodos de alto vácuo fabricada.
Para quantificar o diâmetro médio das partículas de cobalto-cromo-molibdênio, pegue um miligrama de partículas em 1,5 mililitro de etanol anidro e suspenda-as por agitação ultrassônica. Aplicar uma gota, cerca de 20 microlitros, da suspensão na mesa objectiva da microscopia electrónica de transmissão e adquirir uma série de imagens. Use o software fornecido para calcular o diâmetro médio e a distribuição do tamanho das partículas em imagens MET.
Aqui estão as imagens TEM representativas no painel esquerdo, a direita mostra a distribuição do tamanho das nanopartículas da liga de cobalto-cromo-molibdênio calculada pelo nosso software comercial. O diâmetro médio é de cerca de 50 nanômetros. Autoclave as partículas por 15 minutos para remover as endotoxinas.
Em seguida, suspenda-os novamente em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de 15 miligramas por mililitro como solução estoque. Em seguida, vem a construção do modelo de osteólise da calvária. Selecione e anestesie camundongos de seis semanas de idade: seis camundongos por grupo.
Coloque os animais na posição privilegiada. Remova o pelo e desinfete a pele do crânio com 75% de etanol. Para incisar, identifique os dois pontos médios entre os dois olhos e orelhas, respectivamente, e faça uma incisão na pele ao longo da linha que os une.
Remova cuidadosa e completamente o periósteo craniano da calvária por dissecção de choque. Uma dissecção clara do periósteo intensifica as interações entre as partículas na calvária. A sutura é realizada cuidadosamente em ambas as extremidades da incisão em sutura simples interrompida.
Normalmente, são necessários três pontos para uma sutura completa. Para o último estágio, passe a linha de sutura pela incisão sem dar nós, segurando as duas extremidades da linha de sutura. Pegue 15 microlitros de nanopartículas de solução de estoque de liga de cobalto e incorpore-as na sutura do meio da calvária.
Dê um nó no último ponto em sutura simples interrompida. Mantenha os ratos por mais duas semanas. Duas semanas depois, sacrifique o animal e colha a calvária.
Limpe suavemente todo o tecido mole nas amostras de calvária com uma pinça e fixe o tecido em quatro por cento de paraformaldeído a quatro graus Celsius. Para avaliação da osteólise no modelo induzido por nanopartículas de cobalto-cromo-molibdênio, realize micro-CT de alta resolução 24 horas antes da micro-CT. Transfira amostras de calvária em solução salina tamponada com fosfato do paraformaldeído.
No dia da microtomografia computadorizada, colete amostras de calvária de solução salina tamponada com fosfato e fixe-as em um suporte associado a um instrumento. Escaneie a calvária em instrumento de micro-CT. Realize a reconstrução tridimensional com softwares variados.
A coloração H e E é outra ferramenta para avaliação da osteólise em um modelo induzido por nanopartículas. Descalcifique as amostras de calvária na solução salina tamponada com fosfato, contendo 15% de etilenodiaminotetracético por três semanas a quatro graus Celsius. Incorpore a calvária descalcificada em parafina e corte-a em duas seções micrométricas na área de deposição de partículas.
Manchar as secções com hematoxilina e eosina. Observe o morfismo de passagem geral e por microscopia de luz e adquira micrografias. Aqui estão imagens representativas de micro-CT.
Imagens de reconstrução tridimensional de dados de micro-CT são mostradas no painel esquerdo. Imagens de seção transversal de camundongos tratados com controle, operação simulada e nanopartículas são mostradas no painel direito. A osteólise é óbvia no grupo de tratamento com nanopartículas.
Aqui está uma análise quantitativa de fotografias de micro-CT pelo software associado aos instrumentos. As medições incluem densidade mineral óssea, volume ósseo ou razão de volume total, porcentagem de porosidade total, número trabecular, espessura trabecular e separação ou espaçamento trabecular. Camundongos tratados com nanopartículas de liga de cobalto apresentam densidade mineral óssea e volume ósseo significativamente menores, com maior porcentagem de porosidade total em comparação com animais controle.
Aqui estão imagens representativas de coloração H e E para amostras de calvária de camundongos tratados com controle, operação simulada e nanopartículas. A osteólise também é óbvia no grupo de tratamento com nanopartículas. O modelo de osteólise calvarial murina construído por nanopartículas de liga de cobalto tem alta taxa de sucesso na modelagem de osteólise induzida por partículas de desgaste.
A seguir estão vários fatores-chave. Primeiro, as nanopartículas de liga de cobalto aumentam a interação entre as partículas de desgaste e a calvária. Em segundo lugar, a exposição adequada da calvária e a dissecção clara do periósteo tornam a interação entre as partículas e a calvária mais intensa.
Em terceiro lugar, as medições quantitativas da perda óssea por micro-CT facilitam o acesso às diferenças na perda óssea entre os vários tratamentos, fornecendo-nos evidências sólidas de osteólise em comparação com a histomorfometria óssea tradicional. O modelo de osteólise da calvária de desgaste construído por partícula de liga de cobalto é um modelo ideal para investigar a interação entre partículas de desgaste e diferentes células no afrouxamento asséptico. Como micrófagos, fibroblastos, osteoclastos e osteoblastos.
Esperamos que nosso modelo seja útil para o estudo sobre afrouxamento asséptico no futuro.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise craniana por exposição a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdênio, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre partículas de desgaste e diversas células na soltura asséptica. Este modelo é crucial para compreender a patogênese da osteólise relacionada à falha da artroplastia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Ortopedia
Antecedentes
- O osteólise induzida por partículas é uma causa significativa de soltura asséptica em substituições articulares.
- Os mecanismos subjacentes a esse processo permanecem pouco claros.
- Os estudos clínicos enfrentam desafios devido aos longos períodos de acompanhamento e ocorrências esporádicas.
- Um modelo animal confiável é essencial para investigações adicionais.
Objetivo do Estudo
- Construir e avaliar um modelo de osteólise calvarial murina.
- Estudar as interações entre partículas de cobalto-cromo-molibdênio e diversas células.
- Aprimorar a compreensão da patogênese do afrouxamento asséptico.
Métodos Utilizados
- Geração de partículas nanométricas de cobalto-cromo-molibdênio a partir de prótese de liga de cobalto.
- Ressuspendagem das partículas em solução salina tamponada com fosfato na concentração de 15 mg/mL.
- Exposição do tecido calvarial murino às partículas.
- Avaliação das interações celulares e respostas osteolíticas.
Resultados Principais
- O modelo murino imita efetivamente a osteólise induzida por partículas de desgaste.
- As interações entre partículas e células foram avaliadas com sucesso.
- Os achados contribuem para o entendimento dos mecanismos do afrouxamento asséptico.
- Este modelo pode ser utilizado em estudos futuros sobre falha da artroplastia.
Conclusões
- O modelo de osteólise calvarial murino é uma ferramenta valiosa para a pesquisa.
- Ele fornece informações sobre a patogênese da osteólise.
- Esse modelo pode ajudar no desenvolvimento de estratégias para mitigar o afrouxamento asséptico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A osteólise induzida por partículas permanece uma das principais causas de soltura asséptica no insucesso do implante articular, embora o entendimento mecanicista seja limitado pelas restrições dos estudos clínicos. O modelo de calvária murina fornece um sistema rápido e quantificável para avaliar as interações entre partículas e células, permitindo a redução de riscos pré-clínicos de biomateriais e desenhos de implantes. Isso apoia a validação de alvos e a confiança preditiva nos estágios iniciais dos processos de P&D ortopédica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas relativas às interações de partículas de desgaste com macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos.
- Valor Operacional: Facilita a redução de riscos biológicos por meio da avaliação quantitativa da perda óssea por microtomografia computadorizada e histomorfometria.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao modelar respostas osteolíticas para orientar a seleção de materiais de implante.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas biológicas padronizadas (densidade mineral óssea, parâmetros trabeculares) para avaliação de compostos ou revestimentos.
- Reprodutibilidade: Alta taxa de sucesso e baixa variabilidade permitem triagem escalável de modificações de partículas.
- Utilidade da Plataforma: Compatível com modelos transgênicos/desativados para dissecar vias mecanicistas na osteólise.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a patogênese do afrouxamento asséptico para conectar a descoberta e a validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as vias celulares e moleculares responsáveis pela osteólise, permitindo a priorização de alvos.
- Continuidade Translacional: Fornece desfechos quantitativos (volume ósseo, porosidade) preditivos do desempenho do implante in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo testes de hipóteses na fase inicial de descoberta, desenvolvimento de ensaios para triagem e avaliação mecanicista antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias inflamatórias e osteolíticas induzidas por partículas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e padronizadas (métricas ósseas por micro-TC) para avaliação confiável de compostos ou biomateriais.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (densidade mineral óssea, espessura trabecular, porosidade) para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a exposição a partículas com desfechos osteolíticos, orientando decisões de avanço pré-clínico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar diversas partículas de desgaste e revestimentos de implantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na osteólise induzida por partículas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de exposição a partículas e avaliação quantitativa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer avaliação biológica precoce de riscos associados a materiais de implante.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de biomateriais com base no potencial osteolítico.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia murina, manipulação de partículas e imageamento por micro-TC.
- Depende de instrumentação para geração de partículas (eletrodo DC a alto vácuo), preparação de suspensões e quantificação de osteólise.
- Necessita padronização entre equipes para dosagem de partículas, técnica cirúrgica e fluxos de análise.
- Considerações para adaptação incluem a adequação do modelo para avaliação de cronicidade e estudos de carga mecânica.
- Limitação prática: não é possível avaliar os efeitos da força mecânica ou da exposição crônica prolongada a partículas conforme o material de origem.
