Construção e avaliação de um modelo murino de osteólise raspagem pela exposição a partículas de CoCrMo no afrouxamento asséptico
17 de fevereiro de 2018
Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise raspagem por exposição a partículas CoCrMo, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células no afrouxamento asséptico.
O objetivo geral deste procedimento é construir e avaliar o modelo de osteólise calvarial murina mediante exposição a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdênio. A osteólise induzida por partículas de desgaste é uma causa importante do afrouxamento asséptico na falha da artroplastia, mas os mecanismos subjacentes a isso são pouco claros. Devido ao longo tempo de acompanhamento e à ocorrência esporádica, é difícil investigar a patogênese do afrouxamento asséptico em casos clínicos.
Portanto, um modelo animal de desgaste é necessário para estudos adicionais. Em nosso laboratório, um modelo murino de osteólise calvarial induzido por partículas de liga de cobalto é um modelo eficaz para estudar a patogênese do afrouxamento asséptico. Isso é realizado primeiramente gerando partículas nanométricas de cromo-cobalto-molibdênio a partir de próteses de liga de cobalto e re-suspendendo-as em solução salina tamponada com fosfato numa concentração de 15 miligramas por mililitro.
O próximo passo é identificar a posição da incisão em uma linha entre os dois pontos médios entre os olhos e as orelhas, respectivamente. Em seguida, remova o periósteo craniano do crânio por dissecação por choque. A seguir, pegue 50 microlitros de nanopartículas de liga de cobalto em estoque e incorpore-as à sutura mediana do crânio.
Após duas semanas de manutenção, sacrifique alguns camundongos e colete as calvárias para avaliação da osteólise. A osteólise é evidente nos camundongos tratados com nanopartículas de liga de cobalto, tanto nas imagens de micro-TC quanto nas colorações H e E. Obtenha a liga de cromo molibdênio cobalto a partir de prótese de liga de cobalto, obtendo partículas de cromo molibdênio cobalto a partir da liga de cromo molibdênio cobalto por meio de corrente contínua de três eletrodos em alto vácuo.
Para quantificar o diâmetro médio das partículas de cromo cobalto molibdênio, coloque um miligrama de partículas em 1,5 mililitro de etanol anidro e suspenda-as por agitação ultrassônica. Aplique uma gota, cerca de 20 microlitros, da suspensão na platina do microscópio eletrônico de transmissão e obtenha uma série de imagens. Utilize o software fornecido para calcular o diâmetro médio e a distribuição do tamanho das partículas nas imagens de MET.
Aqui estão imagens representativas de MET no painel esquerdo; o painel direito mostra a distribuição do tamanho das nanopartículas da liga de cobalto-cromo-molibdênio calculada por nosso software comercial. O diâmetro médio é de aproximadamente 50 nanômetros. Autoclave as partículas por 15 minutos para remover endotoxinas.
Em seguida, re-suspendê-los em solução salina tamponada com fosfato na concentração de 15 miligramas por mililitro como solução estoque. A seguir, a construção do modelo de osteólise calvarial. Selecione e anestesie camundongos de seis semanas de idade: seis camundongos por grupo.
Posicione os animais na posição ideal. Remova o pelo e desinfete a pele do crânio com etanol a 75 por cento. Para a incisão, identifique os dois pontos médios entre os dois olhos e orelhas, respectivamente, e faça uma incisão na pele ao longo da linha que os une.
Remova cuidadosa e completamente o periósteo craniano da calvária por dissecação por choque. Uma dissecação clara do periósteo intensifica as interações entre as partículas na calvária. A sutura é realizada cuidadosamente em ambas as extremidades da incisão em ponto simples interrompido.
Normalmente, são necessários três pontos para uma sutura completa. Na última etapa, passe a linha de sutura através da incisão sem dar o nó, segurando ambas as extremidades da linha de sutura. Adicione 15 microlitros de solução estoque de nanopartículas de liga de cobalto e incorpore-as ao ponto médio da calvária.
Dar um nó no último ponto da sutura interrompida simples. Manter os camundongos por mais duas semanas. Duas semanas depois, sacrificar o animal e coletar a calvária.
Remova cuidadosamente todos os tecidos moles das amostras de calvária com pinça e fixe o tecido em paraformaldeído a quatro por cento a quatro graus Celsius. Para avaliação da osteólise no modelo induzido por nanopartículas de cromo cobalto molibdênio, realize micro-TC de alta resolução 24 horas antes da aquisição por micro-TC. Transfira as amostras de calvária em solução salina tamponada com fosfato a partir do paraformaldeído.
No dia da tomografia computadorizada micro-CT, colete espécimes de calvária a partir de solução salina tamponada com fosfato e fixe-os em um suporte associado ao instrumento. Realize a varredura da calvária no equipamento micro-CT. Execute a reconstrução tridimensional com softwares variados.
A coloração com hematoxilina e eosina é outra ferramenta para avaliação da osteólise em um modelo induzido por nanopartículas. Descalcifique as amostras de calvária em solução salina tamponada com fosfato, contendo 15 por cento de ácido etilenodiaminotetraacético, durante três semanas a quatro graus Celsius. Incorpore a calvária descalcificada em parafina e corte-a em seções de dois micrômetros na região de deposição das partículas.
Corar os cortes com hematoxilina e eosina. Observar a morfologia geral e por microscopia de luz e adquirir micrografias. Abaixo estão imagens representativas de micro-TC.
Imagens de reconstrução tridimensional de dados de micro-TC são mostradas no painel esquerdo. Imagens de seção transversal de camundongos controle, submetidos a operação simulada e tratados com nanopartículas são mostradas no painel direito. A osteólise é evidente no grupo tratado com nanopartículas.
Aqui está uma análise quantitativa de fotografias de micro-TC realizada pelo software associado ao instrumento. As medições incluem densidade mineral óssea, volume ósseo ou razão de volume total, porcentagem de porosidade total, número trabecular, espessura trabecular e separação ou espaçamento trabecular. Camundongos tratados com nanopartículas de liga de cobalto apresentam densidade mineral óssea e volume ósseo significativamente menores, com maior porcentagem de porosidade total em comparação com os animais controle.
Aqui estão imagens representativas de coloração H e E de amostras de calvárias de camundongos dos grupos controle, operação simulada e tratados com nanopartículas. A osteólise também é evidente no grupo tratado com nanopartículas. O modelo de osteólise calvarial murina construído com nanopartículas de liga de cobalto apresenta alta taxa de sucesso no modelamento da osteólise induzida por partículas de desgaste.
A seguir estão vários fatores-chave. Primeiro, as nanopartículas de liga de cobalto aumentam a interação entre as partículas de desgaste e o crânio. Segundo, a exposição adequada do crânio e a dissecção clara do periósteo tornam a interação entre as partículas e o crânio mais intensa.
Em terceiro lugar, medições quantitativas da perda óssea por micro-TC facilitam o acesso às diferenças na perda óssea entre diversos tratamentos, fornecendo-nos evidências sólidas sobre osteólise em comparação com a histomorfometria óssea tradicional. O modelo de osteólise de calvária induzida por partículas de liga de cobalto é um modelo ideal para investigar a interação entre partículas de desgaste e diferentes tipos celulares no afrouxamento asséptico, como macrófagos, fibroblastos, osteoclastos e osteoblastos.
Esperamos que nosso modelo seja útil para o estudo da soltura asséptica no futuro.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise craniana por exposição a nanopartículas de cobalto-cromo-molibdênio, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre partículas de desgaste e diversas células na soltura asséptica. Este modelo é crucial para compreender a patogênese da osteólise relacionada à falha da artroplastia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Ortopedia
Antecedentes
- O osteólise induzida por partículas é uma causa significativa de soltura asséptica em substituições articulares.
- Os mecanismos subjacentes a esse processo permanecem pouco claros.
- Os estudos clínicos enfrentam desafios devido aos longos períodos de acompanhamento e ocorrências esporádicas.
- Um modelo animal confiável é essencial para investigações adicionais.
Objetivo do Estudo
- Construir e avaliar um modelo de osteólise calvarial murina.
- Estudar as interações entre partículas de cobalto-cromo-molibdênio e diversas células.
- Aprimorar a compreensão da patogênese do afrouxamento asséptico.
Métodos Utilizados
- Geração de partículas nanométricas de cobalto-cromo-molibdênio a partir de prótese de liga de cobalto.
- Ressuspendagem das partículas em solução salina tamponada com fosfato na concentração de 15 mg/mL.
- Exposição do tecido calvarial murino às partículas.
- Avaliação das interações celulares e respostas osteolíticas.
Resultados Principais
- O modelo murino imita efetivamente a osteólise induzida por partículas de desgaste.
- As interações entre partículas e células foram avaliadas com sucesso.
- Os achados contribuem para o entendimento dos mecanismos do afrouxamento asséptico.
- Este modelo pode ser utilizado em estudos futuros sobre falha da artroplastia.
Conclusões
- O modelo de osteólise calvarial murino é uma ferramenta valiosa para a pesquisa.
- Ele fornece informações sobre a patogênese da osteólise.
- Esse modelo pode ajudar no desenvolvimento de estratégias para mitigar o afrouxamento asséptico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A osteólise induzida por partículas permanece uma das principais causas de soltura asséptica no insucesso do implante articular, embora o entendimento mecanicista seja limitado pelas restrições dos estudos clínicos. O modelo de calvária murina fornece um sistema rápido e quantificável para avaliar as interações entre partículas e células, permitindo a redução de riscos pré-clínicos de biomateriais e desenhos de implantes. Isso apoia a validação de alvos e a confiança preditiva nos estágios iniciais dos processos de P&D ortopédica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas relativas às interações de partículas de desgaste com macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos.
- Valor Operacional: Facilita a redução de riscos biológicos por meio da avaliação quantitativa da perda óssea por microtomografia computadorizada e histomorfometria.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao modelar respostas osteolíticas para orientar a seleção de materiais de implante.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas biológicas padronizadas (densidade mineral óssea, parâmetros trabeculares) para avaliação de compostos ou revestimentos.
- Reprodutibilidade: Alta taxa de sucesso e baixa variabilidade permitem triagem escalável de modificações de partículas.
- Utilidade da Plataforma: Compatível com modelos transgênicos/desativados para dissecar vias mecanicistas na osteólise.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a patogênese do afrouxamento asséptico para conectar a descoberta e a validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as vias celulares e moleculares responsáveis pela osteólise, permitindo a priorização de alvos.
- Continuidade Translacional: Fornece desfechos quantitativos (volume ósseo, porosidade) preditivos do desempenho do implante in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo testes de hipóteses na fase inicial de descoberta, desenvolvimento de ensaios para triagem e avaliação mecanicista antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias inflamatórias e osteolíticas induzidas por partículas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e padronizadas (métricas ósseas por micro-TC) para avaliação confiável de compostos ou biomateriais.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (densidade mineral óssea, espessura trabecular, porosidade) para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a exposição a partículas com desfechos osteolíticos, orientando decisões de avanço pré-clínico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar diversas partículas de desgaste e revestimentos de implantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na osteólise induzida por partículas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de exposição a partículas e avaliação quantitativa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer avaliação biológica precoce de riscos associados a materiais de implante.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de biomateriais com base no potencial osteolítico.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia murina, manipulação de partículas e imageamento por micro-TC.
- Depende de instrumentação para geração de partículas (eletrodo DC a alto vácuo), preparação de suspensões e quantificação de osteólise.
- Necessita padronização entre equipes para dosagem de partículas, técnica cirúrgica e fluxos de análise.
- Considerações para adaptação incluem a adequação do modelo para avaliação de cronicidade e estudos de carga mecânica.
- Limitação prática: não é possível avaliar os efeitos da força mecânica ou da exposição crônica prolongada a partículas conforme o material de origem.
