Name: Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a detectar aloanticorpos HLA em transplante de órgãos usando matrizes de antígenos personalizadas baseadas em sequências individuais de doadores. Este método melhora a compreensão das respostas imunes e mecanismos de rejeição.

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Agradecemos os Drs Shawn Li e Li Xing de Western University, no Canadá por sua gentil assistência com mancha matriz de produção. Somos gratos aos membros do pessoal no núcleo histocompatibilidade e abrangente de transplante centro do noroeste da Universidade para a prestação de serviços de exemplo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo auxiliar placa de Northwestern Memorial Hospital e por um fundo de inicialização faculdade fornecido pela Northwestern University a JJ.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo noroeste da Universidade institucional Review Board (IRB protocolo #: STU00104680). Um fluxo de trabalho geral do protocolo é ilustrado na Figura 1.
 1. a análise de Bioinformatic do doador e receptor HLA sequências <ol><li>recuperar sequências de banco de dados IMGT/HLA 15.
	<ol><li>Relatórios de digitação obter HLA do doador de órgãos e do seu receptor. 
		Nota: Certifique-se de procedimentos adequados para proteger os registos médicos confidenciais são utilizados. Normalmente, uma aprovação institucional Review Board (IRB), o protocolo de estudo ou o teste experimental é necessária as orientações institucionais do IRB. Se relatórios HLA foram baseados em PCR digitação (de alta ou baixa resolução) ou baseada no sequenciamento digitação (SBT), vá diretamente para a etapa 1.1.3. Se sequências foram obtidas de sequenciamento genômico/HLA, e se eles são completos, use essas sequências diretamente. Ocasionalmente, quando digitando apenas incompleta ou sequenciamento resultados estiverem disponíveis, siga o passo adicional 1.1.2. para atribuir o &#34; faltando &#34; alelos através da ferramenta web descrito na etapa 1.1.2.</li>
		<li>Abrir as combinações de alelos ambíguo seguindo web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html e Pesquisar usando o &#8220; ferramenta de busca de combinações alélicas ambígua &#8221; função para recuperar os alelos hipotéticos. Então, prosseguir para a etapa 1.1.3. Digite o nome do alelo.</li>
		<li>Abrir o formulário de consulta de alelo IMGT/HLA no seguinte o link de web - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html e assunto de entrada &#8217; nomes de alelo s (cada qual individualmente, conforme mostrado na Figura 2) no &#8220; pesquisa para &#8221; caixa. Clique sobre o &#8220; busca de alelos agora &#8221; botão. Os nomes de alelo HLA devem usar sistemas de nomenclatura padrão (ou seja, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 e quaisquer denominações anteriores como A * 01010101).</li>
		<li>Encontrar o nome de alelo correspondente exibido na tela. Clique no botão alelo.</li>
		<li>Cópia da &#34; sequência da proteína &#34; e colá-lo em um documento de texto por baixo de uma linha de cabeçalho de &#34; &#62; nome do alelo &#34;. Efetivamente, o documento de texto é em um formato FASTA (FAST-All) do nome do alelo e sequência.</li>
	</ol></li> <li>Executar baseados em genes múltiplos alinhamentos de doador e receptor/paciente alelos.
	<ol><li>Um gene (ou seja, DQB1 * 03:01:01:01) ao mesmo tempo, copie e cole todos os quatro alelos de doador e paciente FASTA sequências (dois do doador) e dois do paciente em um documento de texto combinado. Neste ponto, é importante denotar diferencialmente nomes de alelo doador de nomes do alelo doente (as opções incluem o uso diferencial de alta vs baixa casos; ou criar uma extensão de prefixo ou sufixo distintiva para cada nome de alelo para marcar separadamente doador vs. pacientes alelos). A ordem de entrada das sequências não é importante, porque, seguindo a ordem depois misturada de acordo com os níveis de similaridade entre qualquer par de sequências de alinhamento.</li>
		<li>Copiar e colar as sequências em FASTA formato (como visto na Figura 3) de cima para o &#8220; digite seus sequências de entrada &#8221; caixa no site da Omega Cluster: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.</li>
		<li>Clique no &#34; enviar seu trabalho &#34; usando as configurações padrão dos parâmetros: tais como &#34; PROTEINŔ e &#34; Clustal w / números &#34;. Executar alinhamento clicando no &#34; enviar &#34;. Um alinhamento de sequências de quatro é exibido na tela ( Figura 4).</li>
	</ol></li> <li>Mark doador específico incompatibilidades. 
	Nota: Especialmente Note-se que as sequências alélicas dadas aqui foram baseadas nos resultados da tipagem HLA, não sequenciamento. Portanto, há um risco de que a variação da sequência relevante do par doador-receptor específico pode ser perdida. Este potencial problema vai ser atenuado como mais e mais centros de transplante adotam precisa digitar de alta resolução e direto de sequenciamento de DNA.
	<ol><li>Copiar e colar o texto de alinhamento em um documento de texto e criar um novo documento. Se o formato do arquivo alinhado é perturbado, corrigir o formato, alterando o estilo de fonte e tamanho: sempre use &#34; Courier New &#34; fonte no tipo de pequeno tamanho para caber as linhas. Salvar o documento após os formatação problemas estão resolvidos.</li>
		<li>Inspecionar manualmente as sequências alinhadas para identificar todos os resíduos incompatíveis que pertencem exclusivamente ao doador. Marcar cada um desses resíduos de doador específico usando uma cor de fonte distintiva.</li>
		<li>Sublinhar todas as letras do dador &#39; s sequências que estender 14 resíduos dois - up e a jusante das marcado incompatibilidades específicas do doador (calculado como 15 aminoácido peptídeo menos 1 resíduo de incompatibilidade).</li>
	</ol></li> <li>Derivam sequências de peptídeo 15-mer em uma série de sobreposição. 
	Nota: O motivo para a escolha de peptídeos mer-15 foi baseado no conhecimento geral de epítopos típicos, sendo 4-9 aminoácidos de comprimento. Portanto, quando aplicamos um &#34; janela em movimento &#34; procedimento com um tamanho de passo de 4 ácidos aminados ( Figura 1), nossa seleção de um comprimento de 15 aminoácidos deixou um 15-4 = 11 aminoácidos sobreposição entre qualquer peptídeos vizinhas em uma série. Em teoria, essa sobreposição de 11 aminoácidos é suficiente para cobrir todos os epitopos imunes de até 9 aminoácidos de comprimento, para que não epítopo será inadvertidamente &#34; dividir &#34; ao meio com apenas sequências parciais na matriz.
	<ol><li>Use as sublinhado sequências mais modelos para derivar sequencialmente curto 15 sequências de aminoácidos em uma série que se sobrepõem por 4 resíduos entre quaisquer duas sequências imediatamente adjacentes na série.</li>
		<li>Copiar e colar esses 15 sequências de aminoácidos em uma planilha ( Figura 5), em um formato de coluna acompanhado por colunas de notação que incluem os nomes correspondentes dos alelos doador. Uma coluna adicional para incluir posições aa resíduo pode ser útil.</li>
	</ol></li> <li>Repita os passos de 1.1.3. a 1.3. para cada alelo HLA (i.e., A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 e DP) do dador e o par de destinatário para derivar as 15 aa sequências curtas do dador.</li>
	<li>Copiar e colar todas as colunas em uma planilha mestra para criar uma coluna contínua longa de todas as 15 aa sequências de todos os alelos do doador. Anote o número total de linhas (para as sequências peptídicas) no documento.</li>
</ol> 2. Projeto de Layout de matriz personalizado e produção chamados <ol><li>gerar uma planilha de sequências peptídicas com alelo correspondente. A matriz tem 30 colunas e 20 linhas e pode conter até 20 x 30 = 600 pontos por peptídeos. Dependendo do número total de peptídeos gravado no passo 1.5 de um doador particular e com base em nossa experiência do passado com dois exemplos que tentamos em Liu et al. 17, a matriz de ponto 600 pode segurar todas as sequências geradas a partir de ~ 2 casos de transplante separado.
	<ol><li>Plano racionalmente e maismostrou de forma para caber os conjuntos de péptidos dentro o formato 600-ponto da matriz.</li>
		<li>Se mais de um assunto pode caber em uma matriz inteira, inserir linhas vazias após o primeiro doador &#39; sequências de s para coincidir com o número total de linhas que pode ser dividido por 30 (o número de pontos em uma linha na matriz).</li>
		<li>Imediatamente após a última linha vazia para o primeiro conjunto de sequências, colar em toda a coluna de conteúdo de sequência do segundo transplante caso.</li>
		<li>Repita essas etapas até que a matriz é preenchida e não há mais casos podem ser adicionados sem exceder os 600 pontos. Se toda linhas vazias são deixadas para preencher na parte inferior, &#34; mover &#34; na linha em branco deve ser posicionado entre os conjuntos de dois doadores. Este amplo espaço deixado entre casos faz o corte da membrana após a conclusão da síntese mais fácil - seguindo passo 3.2. abaixo.</li>
	</ol></li> <li>Programa as sequências peptídicas no contexto do layout de matriz. O programa do sintetizador SPOT tem um formato de texto das sequências (sequência de um peptídeo de uma linha), que pode ser obtido diretamente, salvando a planilha resultante da etapa 2.1.4 como um documento de texto simples (sem as colunas extras para nomes de alelo, aa posições, etc.).</li>
	<li>Gerência automatizada do peptide matriz síntese através do sintetizador SPOT. Toda a operação da síntese é detalhada em Kudithipudi et al. 21. Observar que o Fmoc síntese de duas matrizes ~ 4-5 dias.</li>
</ol> 3. Receptor de transplante de sonda e anti-soros Reprobe de uma série temporal de um indivíduo.
 Nota: A matriz de membrana 600 loco tem o dimensões ~ 7 x 13 cm. Após a síntese, as matrizes podem ser armazenadas à temperatura ambiente como membranas secas pelo menos dois anos quando protegido da luz direta. Evitar excesso de dobramento da membrana para preservar sua longevidade para uso repetido.
<ol><li>Re-hidratar a matriz de membrana com etanol e visualizar pontos de peptídeo manchados com Ponceau S.
	Matriz de <ol><li>Rehidratar a membrana carregando os peptídeos seguindo um procedimento gradual otimizado em Li et al. 24. <ol><li>mergulhe a membrana de matriz em 20 mL de etanol a 100%.</li>
			<li>Adicionar 20 mL água destilada para diluir a solução de etanol a 50% e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
			<li>Trocar a solução de imersão para 40 mL de água 100% três vezes e incubar 15 min a cada hora.</li>
			<li>Lavagem em um buffer de trabalho adequada, por exemplo, 20 mL de TBST (Tris salino com 0,1%), três vezes por 5 min cada.</li>
		</ol></li> <li>Ponceau S coloração da matriz para visualizar peptídeos sintéticos <ol><li>Adicionar 20 mL de solução de Ponceau S previamente formulada diretamente para a matriz hidratada e incube por 30 ~ s com tremendo.</li>
			<li>Run destilada água continuamente ao longo da membrana de manchar o fundo cor de Ponceau S. Durante o processo, manchas de peptídeo de cor vermelha podem tornar-se visível.</li>
			<li>Separar as partes da matriz para cada doador cortando cuidadosamente entre as seções da matriz para casos individuais. Marcar a orientação de cada matriz.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Matriz pre-bloco.
	Leite desnatado de <ol><li>bloco a membrana em 20 mL de 5% dissolvido em tampão TBST. Esta solução à base de leite mais de mancha cor de Ponceau S. Substitua o tampão de leite várias vezes para alcançar as imagens mais claras do peptídeo.</li>
		<li>Para fins de registo, tirar uma foto da imagem da matriz usando uma câmera de mão (exemplo na Figura 6) Ponceau S.</li>
		<li>Continuar bloqueando da membrana em leite desnatado de 5% a 4 ° C durante a noite ou em temperatura ambiente por 2 h com balanço.</li>
	</ol></li> <li>Matriz de incubar com transplante de anti-soro. 
	Nota: Deve ser observado que um fenômeno conhecido como prozona ou o efeito de gancho pode resultar de complemento-dependente interferência na análise de anticorpos do soro. Para contornar este problema, uma etapa de pré-tratamento de soro opcional pode ser considerada com EDTA ou calor inactivação de amostras de soro.
	<ol><li>Remover o tampão de bloqueio e lave a membrana com 20 mL de TBST três vezes no dia seguinte por 5 min cada vez.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l do soro bruto do destinatário a 20 mL de 2,5% leite em buffer TBST e incuba com a membrana para 2-3 h à temperatura ambiente. Note que nesta rodada inicial de sondagem, é recomendado que a último pós-transplante soro (ou provavelmente mais sensibilizado soro) da série de tempo é usado em primeiro lugar. Isto é baseado no pressuposto de que os espécimes anteriores da série, particularmente a partir de pontos de tempo pré-transplante, tem menos variedade de aloanticorpos que tendem a desenvolver ao longo do tempo. Desta forma, qualquer possibilidade de interferência do sinal de &#34; reporte &#34; entre rodadas de sondagem podem ser claramente distinguidos de reatividade verdadeiramente desenvolvidos Alo-anticorpo devido a respostas imunes contra o enxerto.</li>
	</ol></li> <li>Lavar a matriz com 20 mL de TBST e incubar com anticorpo secundário.
	<ol><li>Lavar a membrana três vezes durante 10 minutos cada vez.</li>
		<li>Incubar com anticorpo secundário cabra anti-humano IgG-HRP (peroxidase de rábano silvestre) a diluição de 1:10,000 no buffer TBST suplementado com 1% de leite para outro h. 2</li>
	</ol></li> <li>Lavagem e desenvolver o blot.
	<ol><li>Lavar a membrana três vezes com TBST durante 10 minutos cada vez.</li>
		<li>Executar reforçada quimioluminescência (ECL) usando 5 mL de solução de luminol recém misturado com 5 mL de solução de peróxido para desenvolver a membrana (por 1 min).</li>
		<li>ECL Visualizar sinais usando um sistema de imagem apropriado (ou seja, sistemas de imagem de ChemiDoc ou Azure C600).</li>
	</ol></li> <li>Scan e quantificar o blot.
	<ol><li>Salvar as imagens desenvolvidas ( Figura 7, imagem inferior) e realizar a quantificação da intensidade local.</li>
	</ol></li></ol> 4. Comparar a reatividade do soro através de uma série de tempo clínico.
<ol><li>Tira matriz.
	<ol><li>, Neste ponto, mantenha a membrana molhado em todos os momentos.</li>
		<li>Tira a membrana incubando com 20 mL de tampão de extracção comercial a 37 ° C por 20 min e em seguida, lave a membrana com TBST três vezes durante 10 minutos cada. Em seguida, repita o bloqueio (etapa 4.2) e sondagem (passo 4.3) etapas usando um diferente soro do paciente tomada em um ponto diferente tempo.</li>
	</ol></li> <li>Bloco despojado membrana. 
	Nota: Após o descascamento, a membrana pode ser reutilizada para outra rodada de sondagem de um soro diferente do mesmo paciente em uma série de tempo.
	<ol><li>Bloquear a membrana usando o buffer de leite 5% como antes (consulte a etapa 3.2).</li>
	</ol></li> <li>Reprobe um anti-soro diferente da mesma série tempo (repita os passos de 3.3-3,6; exemplo na Figura 7, imagem superior). 
	Nota: A matriz despojada então pode ser usada para reprobe outra amostra de soro. Desde que os peptídeos são conjugados covalentemente a matriz de suporte da membrana, mostramos que a matriz pode ser reutilizada por até 20 rodadas de descascamento e reprobing ciclos sem perder sua perfobrilho.</li>
	<li>Armazenamento de longo prazo de matrizes.
	<ol><li>Loja da membrana no buffer TBS suplementado com 0,02% w/w de azida sódica como conservante. Use um saco plástico selado para armazenamento a longo prazo. A 4 ° C, sob a proteção da luz direta, a membrana molhada pode ser armazenada pelo menos 2 anos.</li>
	</ol></li></ol> 5. Aquisição de dados e análise <ol><li>anotar manualmente peptídeos do antígeno positivo.
	<ol><li>Localizar pontos mostrando sinais de anticorpo positivo e determinar cada uma das suas posições de grade.</li>
		<li>Destacar as linhas correspondentes na planilha mestre para os peptídeos positivos.</li>
	</ol></li> <li>Recuperar sequências peptídicas listadas na planilha mestre ( Figura 7, lista de fundo). De acordo com o princípio de projeto descrito no passo 1.4.1., manchas seriais vizinhas compartilham sequências significativamente sobrepostas (15-4 = 11), portanto epitopos reativos podem ser compartilhados por peptídeos numa série consecutiva.
	<ol><li>Destacar todos os pontos positivos ocorrem em sucessão.</li>
	</ol></li> <li>Determinar o comprimento mínimo do epítopo para cada peptídeo em uma série.
	<ol><li>Destaque qualquer sequências potencialmente compartilhada epítopo com base na sobreposição de segmentos de peptídeos reativos.</li>
	</ol></li> <li>Modelo estruturalmente epítopos do antígeno.
	<ol><li>Obter estruturas de cristal HLA de protótipo de banco de dados da proteína encontrada no seguinte link da web: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.</li>
		<li>Exibir o protótipo estrutura HLA em Pymol (download a partir www.pymol.org).</li>
		<li>Mapa &#34; ou modelo descoberto antiresumos doadores para as estruturas 3D das moléculas HLA do protótipo, realçando as sequências peptídicas reativa ( Figura 8). Clique em &#34; Display &#34;, então &#34; fundo &#34; e selecione &#34; branco &#34;. Para salvar a imagem, vá para &#34; arquivo &#34; e &#34; salvar imagem como &#34; e selecionar o formato de arquivo &#34; png &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Relatar resultados e atribuir epitopos reativos para os alelos correspondentes.</li>
	<li>Comparar resultados para os resultados de grânulos single-antigénio (SAB), de matriz, se disponível. 
	Nota: O teste SAB usando antígenos alélicas único mede de reatividade de anticorpos para um painel fixo de proteínas HLA. Peptídeos individuais que mostram reatividade de anticorpos pertencem a certos alelos HLA que, se também incluído no painel SAB, permitem a comparação direta entre a matriz e os resultados SAB. Nosso anterior estudo 17 mostrou um alto nível de correlação entre os resultados, sugerindo que os epítopos de peptídeo contribuam significativamente para a reatividade global de sab. Além disso, os resultados da matriz também revelam aminoácido-níveis de especificidade.
	<ol><li>Obter SAB resulta de um laboratório HLA que fornece informações sobre se e quais alelos doador são reativos para pós-transplante de soro do paciente. Resultados da etapa 5.5. com base na matriz de análise também fornecem informações sobre alelos correspondentes do doador positivos para reatividade Alo-anticorpo.</li>
		<li>Resultados comparar SAB e matriz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesses declararam.

O desenho da matriz de ponto descrito aqui é para o estudo experimental de especificidade de Alo-anticorpo em transplante contra antígenos HLA do doador de órgãos. Em contraste com o ensaio SAB existente, amplamente utilizado na clínica, o método de matriz de antígeno tem uma grande vantagem em seu design flexível que pode acomodar as verdadeiras sequências HLA do doador individual. A nova plataforma explora os potenciais da tecnologia de sequenciamento de DNA rapidamente avançando que em breve será capaz de produzir lei...

Terapia de substituição de órgão que é rotineiramente realizada em todo o mundo já salvou milhões de vidas. Transplantação de órgãos sólidos ocorre em cerca de 100 pacientes por milhão de pessoas nos Estados Unidos anualmente, ao passo que um número maior ainda colocorá receber órgãos de doadores devido a uma grave escassez de abastecimento (de acordo com informações fornecidas pelo órgão Colheita e transplante de rede - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplante de órgãos é altamente regulada a fim de reduzir o desperdício de órgãos e salvar vidas, mas as ferramentas científicas usadas para informar a estes regulamentos são limitadas na eficácia. Por exemplo, a comunidade científica reconhece plenamente os Estados altamente polimórficos de moléculas HLA e precisos testes genéticos de DNA usando digitação de alta resolução e baseados em sequência de digitação (SBT) foram desenvolvidos nos últimos anos1, 2. no entanto, os métodos de ensaio Alo-anticorpo ainda não foram capazes de produzir a grande variedade de sequências individuais de HLA como sondas de antígeno. O teste padrão hoje em dia usa um painel invariável de ~ 100 antígenos alélicas que são compreendidos de variantes comuns de HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequências em populações humanas3,4,5,6. Frequentemente, sequências HLA do doador real não estão incluídas no painel de teste, forçando o transplante de médicos e cirurgiões para inferir a reatividade de doadores específicos com base em semelhanças compartilhadas entre sequências reais do doador e padrões"correspondentes" na teste conjunto7,8. Consequentemente, às vezes é difícil fazer uma estimativa confiável do risco de rejeição baseada em anticorpos teste resultados9,10,11,12. Portanto, Nova pessoalmente testes personalizáveis para aloanticorpos são urgentemente necessários13,14.
Os genes HLA codificam os receptores de (MHC) complexos principal de histocompatibilidade que têm uma função fundamental em respostas imunes6. Os genes HLA são conhecidos por serem os mais polimórficos genes do genoma humano6. Devido aos avanços rápidos no DNA sequenciamento estratégias para os genes HLA, novas variantes alélicas (ou simplesmente referido como alelos) estão sendo descobertas a uma taxa explosiva15,16. Em março de 2017, 16.755 alelos validados tiveram sido depositados no banco de dados IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), dos quais 12.351 de classe se eu fosse e 4.404 eram de grupos de classe II. Em contraste, apenas um pouco mais de 100 diferentes alelos são representados no ensaio padrão único-antígeno grânulos (SAB), que é usado rotineiramente para detectar aloanticorpos em transplante de órgãos. O método SAB é construído sobre uma plataforma de Luminex usando citometria de fluxo. Desde que o ensaio utiliza um conjunto invariável de antígenos, além de menores variabilidades de lote para lote em produção, o teste de soro pode ser robustamente padronizado entre indivíduos e entre laboratórios5. Entretanto, este teste é capaz de capturar todos os aloanticorpos desenvolvidos especificamente contra os alelos do doador, particularmente quando as sequências de doadores estão ausentes do SAB definido. Embora a produção personalizada de antígenos dos doadores, com base em sequências de verdadeiras são desejáveis, persistem os desafios técnicos em racionalizar a produção necessária e procedimentos de teste.
Recentemente descrevemos uma metodologia alternativa em um estudo de viabilidade do transplante renal assuntos17. O método usado antígenos de peptídeo em um formato de matriz pela investigação pré- e pós-transplante de soros de sujeitos individuais. Cada matriz personalizado foi construído usando o lugar síntese método18,19,20,21,22,23 que produz antígenos peptídeos, cada 15 aminoácidos de comprimento, inteiramente baseada em alelos HLA do doador do respectivo órgão de A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Síntese SPOT é operado em uma membrana de celulose usando padrão Fmoc-química22 e pode produzir centenas de peptídeos personalizados em paralelo com um sistema totalmente automatizado de robótica19,21. A matriz de membrana pode suportar várias rodadas de descascamento e ciclos de reprobing. Em nosso estudo retrospectivo17, detectamos mudanças nos padrões do antígeno com anti-soros transplante armazenados, coletados em uma série de tempo (ou seja, antes e após o transplante). Neste documento descrevemos o protocolo técnico para o fluxo de trabalho, incluindo o projeto da matriz, fabricação, análise de sondagem e resultado de anti-soro. O método destina-se para a detecção de aloanticorpos contra epítopos lineares específicos em moléculas HLA dos doadores de transplante.

<table><tbody><tr><td>Matriz de peptídeos</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Solução Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humano de cabra&ndash; HRP&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A18811</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td> Sistema de imagem em gel <td>Thermo Scientifics</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Bio</td><td>Rad Laboratories</td><td>1708265&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

personalizado do peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos hla no transplante de órgãos

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

No transplante de órgãos, a função e a longevidade da prótese criticamente dependem do sucesso de controlar a reatividade de rejeição imunológica contra antígenos de leucócitos humanos (HLA). Diretrizes de histocompatibilidade são baseadas em testes laboratoriais de imunidade anti-HLA, que apresenta como pré-existentes ou de novo gerados anticorpos HLA que constituem uma barreira grande transplante. Testes atuais estão construídos sobre uma plataforma de grânulos single-antigénio (SAB) usando um conjunto fixo de ~ 100 pré-selecionados antígenos HLA para transplante soros de sonda. No entanto, em humanos, existem uma variedade muito maior de tipos HLA, com nenhum dois indivíduos que não sejam gêmeos idênticos que podem compartilhar a mesma combinação de sequências HLA. Enquanto tecnologias avançadas para a tipagem de HLA e sequenciamento direto precisamente podem capturar qualquer inadequações na sequência de DNA entre um doador e HLA do receptor, o ensaio de ORS, devido à sua variedade limitada em representação de sequência, é incapaz de detectar precisamente aloanticorpos especificamente contra o doador HLA mismatches. Procuramos desenvolver um método complementar, usando uma tecnologia diferente para detectar e caracterizar os anticorpos HLA de antiem doadores uma base personalizada. A ferramenta de seleção é uma matriz de peptídeo personalizado doador HLA-derivado de sequências de para sondar pós-transplante soros do destinatário órgão para avaliar o risco de rejeição mediada por anticorpo. Em um único array para um par de doador-beneficiário, até 600 exclusivos peptídeos são feitas com base em sequências de proteínas HLA do doador, cada peptídeo carregando pelo menos um resíduo incompatível em uma sequência de ácido amino-15. Em nossos experimentos piloto para comparar padrões de antígeno do pré e pós transplante sera nesses conjuntos, fomos capazes de detectar sinais de anti-HLA com a resolução que também nos permitiu identificar os epítopos imunes envolvidos. Estas personalizado matrizes de antígeno permitam a detecção de alta resolução de epitopos HLA do doador específico em transplante de órgãos.

No estudo original usando a matriz de seleção método17, estamos inscritos um total de 5 indivíduos de transplante de rim. Obtivemos o HLA digitando resultados de nossa coorte e de seus respectivos doadores. Sua história médica e anticorpos alélica de SAB testes também estavam disponíveis para nós. Em nosso estudo piloto desses 5 pacientes, criámos duas metodologias diferentes: um matriz padrão, composto por um painel fixo de peptídeos e matrizes personalizados que ...

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

O objetivo geral deste método personalizado de matriz para detecção de aloanticorpos é delinear epítopos de antígeno leucocitário humano ou HLA no transplante de órgãos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transplante de órgãos sobre os epítopos imunes específicos envolvidos na rejeição do transplante. A principal vantagem desta técnica é que ela é totalmente personalizável, permitindo a incorporação de conjuntos personalizados de antígenos que podem refletir as sequências HLA de doadores de órgãos individuais.A técnica tem o potencial de detectar epítopos HLA específicos para aloanticorpos. Para recuperar sequências do banco de dados do Projeto Internacional de Imunogenética do antígeno leucocitário humano, na página de combinações ambíguas de alelos, abra o formulário de consulta de alelos do banco de dados e insira o nome do primeiro alelo do indivíduo no campo de pesquisa. Clique em Buscar Alelos Agora e localize o nome do alelo correspondente exibido na tela.Clique em Alelo e copie e cole a sequência proteica em um documento de texto sob uma linha de cabeçalho com o nome do alelo para organizar o nome do alelo junto à sequência em formato FAST

personalized-peptide-arrays-for-detection-hla-alloantibodies-organ

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Este vídeo demonstra um ensaio para detectar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos. Uma matriz de peptídeos é sintetizada para representar epítopos potenciais para rejeição de órgãos mediada por anticorpos. A matriz é incubada com o soro do receptor, contendo aloanticorpos que se ligam aos epítopos alvo. A ligação de anticorpos é detectada usando quimioluminescência para identificar epítopos HLA específicos do doador que incitam a reatividade de aloanticorpos.

Uma detecção baseada em matriz de peptídeos de aloanticorpos HLA anti-doadores em receptores de órgãos

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma de diagnóstico.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Aqui, apresentamos um protocolo para a purificação dos complexos de peptídeos classe I e CLASSE II da classe I, fornecendo dados de imunopeptidomias de alta qualidade. O protocolo se concentra na preparação da amostra usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Imunopeptidomics: Isolamento de Peptídeos MHS de classe I e II associados para análise de espectrometria de massa

Aprenda a detectar aloanticorpos HLA em transplante de órgãos usando matrizes de antígenos personalizadas baseadas em sequências individuais de doadores. Este método melhora a compreensão das respostas imunes e mecanismos de rejeição.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

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