Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

O objetivo geral deste método de matriz personalizada para detecção de aloanticorpos é delinear o antígeno leucocitário humano ou epítopos HLA no transplante de órgãos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do transplante de órgãos sobre os epítopos imunológicos específicos envolvidos na rejeição do transplante. A principal vantagem dessa técnica é que ela é totalmente personalizável, permitindo a incorporação de conjuntos de antígenos personalizados que podem refletir as sequências HLA de doadores de órgãos individuais.

A técnica tem o potencial de detectar epítopos HLA específicos para aloanticorpos. Para recuperar sequências do banco de dados do projeto de antígeno leucocitário humano do International Immunogenetics Project, na página de combinações de alelos ambíguos, abra o formulário de consulta de alelos do banco de dados e insira o primeiro nome do alelo do sujeito na caixa de pesquisa. Clique em Pesquisar alelos agora e localize o nome do alelo correspondente exibido na tela.

Clique em Alelo e copie e cole a sequência de proteínas em um documento de texto sob uma linha de cabeçalho do nome do alelo para organizar o nome do alelo em sequência em um formato FASTA. Quando todas as sequências tiverem sido identificadas, copie e cole as sequências do formato FASTA na caixa insira suas sequências de entrada no site do Cluster Omega e clique em enviar seu trabalho usando as configurações de parâmetro padrão. Em seguida, clique em enviar.

Um alinhamento das sequências será exibido. Para marcar as incompatibilidades específicas do doador, copie e cole o texto de alinhamento em um novo documento de texto e use uma cor de fonte distinta para marcar cada resíduo específico do doador incompatível dentro das sequências alinhadas que pertencem exclusivamente ao doador. Sublinhe todas as letras nas sequências do doador que estendem 14 resíduos para cima e a jusante das incompatibilidades específicas do doador marcadas e use as sequências sublinhadas como modelos para derivar sequencialmente sequências curtas de 15 aminoácidos em uma série que se sobrepõem por quatro resíduos entre quaisquer duas sequências imediatamente adjacentes na série.

Copie e cole essas 15 sequências de aminoácidos em uma planilha em formato de coluna acompanhada de colunas de notação que incluem os nomes correspondentes dos alelos do doador. Para projetar um layout de matriz personalizado, gere uma planilha de sequências de peptídeos com chamadas de alelo correspondentes com 20 linhas e 30 colunas. Em seguida, insira as sequências em cada uma das células da matriz e use o sintetizador de pontos para executar uma síntese automatizada de matriz de peptídeos.

Ao projetar uma matriz, é fundamental usar sequências HLA de doadores individuais como modelo para derivar o conjunto de antígenos. Quando as matrizes tiverem sido sintetizadas, bloqueie as membranas com 20 mililitros de leite desnatado a 5% dissolvido em solução salina tamponada com Tris com 0,1% entre 20 ou TBST pelo período de incubação apropriado com balanço. Em seguida, lave a membrana três vezes com 20 mililitros de TBST fresco por cinco minutos por lavagem, seguido de incubação com 20 microlitros de soro receptor bruto em 2,5% de leite em TBST por duas a três horas em temperatura ambiente.

No final da incubação, lave a membrana três vezes por 10 minutos por lavagem e incube as membranas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete humano de cabra por duas horas. Remova o anticorpo secundário não ligado com três lavagens de 10 minutos em TBST e desenvolva as membranas em cinco mililitros de solução de luminol recém-preparada mais cinco mililitros de solução de peróxido. Após um minuto, visualize os sinais de quimioluminescência aprimorados em um gerador de imagens adequado.

Depois de salvar as imagens reveladas, incubar as membranas com 20 mililitros de tampão de decapagem comercial a 37 graus Celsius por 20 minutos, seguido de três lavagens de 10 minutos em TBST. Em seguida, bloqueie, refaça a sonda e visualize as membranas como acabamos de demonstrar com uma amostra de soro do mesmo paciente obtida em um ponto de tempo diferente. Para anotar manualmente os peptídeos de antígeno positivos, localize os pontos com sinais positivos de anticorpos nos arquivos de imagem desenvolvidos salvos e determine cada uma de suas posições de grade.

Em seguida, recupere as sequências de peptídeos da planilha mestre para identificar quaisquer sequências de epítopos potencialmente compartilhadas com base em seus segmentos sobrepostos de peptídeos reativos. Para modelar estruturalmente epítopos de antígenos, obtenha protótipos de estruturas cristalinas de HLA do banco de dados de proteínas e exiba o protótipo de estrutura HLA em Pymol. Destaque as sequências de peptídeos reativos para mapear os epítopos antidoadores descobertos para as estruturas 3D do protótipo HLA.

Em seguida, clique em Exibir e plano de fundo e selecione Branco, salvando os dados como um arquivo PNG. Depois de sequenciar vários alinhamentos dos alelos desse paciente doador representativo, conforme demonstrado, um arquivo de alinhamento foi obtido para cada um dos alelos. As sequências modelo do doador que eram suficientemente longas para cobrir todos os resíduos incompatíveis foram então identificadas e sublinhadas e três séries de peptídeos de 15 mer foram derivadas para o primeiro alelo.

Depois que todos os alelos do doador foram analisados, um total de 202 peptídeos foram carregados em uma matriz para a sondagem específica do soro pós-transplante do doador. A comparação dos resultados com os obtidos de uma resondagem subsequente do soro pré-transplante do doador revelou os sinais de anticorpos associados à amostra pós-transplante, dos quais vários resíduos específicos do doador incompatíveis com o receptor pareciam estar envolvidos em incitar a reatividade de anticorpos. Quando os epítopos reativos de anticorpos em HLA-DQA1 e DQB1 foram modelados para uma estrutura heterodímera de co-cristal, um segmento proeminente da estrutura conhecida como fita beta um foi identificado como um hotspot que tinha uma chance muito maior de ser alvo de aloanticorpos entre os indivíduos transplantados em uma coorte representativa de cinco casos.

Uma vez dominada, a técnica pode ser concluída em sete a oito horas se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, a técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da rejeição de transplantes explorarem a detecção personalizada de aloanticorpos específicos do doador.