Name: Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Aprenda hibridização in situ de alta resolução em embriões e tecidos de Drosophila usando amplificação de sinal por tiramida. Este método permite detectar RNA com sensibilidade e baixo custo em placas de 96 poços.

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Apoio para este projeto de financiamento foi fornecido por uma concessão para HMK pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder 133473 MOP).

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<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

O protocolo descrito fornece um método altamente reprodutível, sensível e econômico para a detecção da maioria dos RNAs em embriões da drosófila fixo ou de tecidos. Embora um pouco mais complicado do que o mais tradicionalmente utilizado método de fosfatase alcalina da deteção de sonda, a resolução obtida por peixe é muito maior e a sensibilidade é comparável ou melhor 7,8. Usando placas de microtitulação total ou parcial, os protocolos podem ser usados para análises em larga escala ou limitadas de genes de interesse. Deve-se notar que as sondas geradas podem detectar todos ou tala de transcrição múltiplos formulários a menos que sondas destinam-se mais especificamente (ou seja, único exões). Embora nós testamos sondas tão pequenas quanto 200 nucleotídeos com razoável sucesso, sondas menores tendem a ser menos eficaz e podem ser menos específicas. Claramente, este protocolo não é apropriado para a detecção de pequenas intrões, exões, ou processado microRNAs.
Embora esta abordagem usa um passo enzimático para aumentar a força dos sinais, intensidade de sinal parece ser proporcional à expressão do gene alvo em uma escala relativamente ampla e linear dos níveis de expressão. A maior ampliação, o sinal é visto como partitura ou speckles dentro de células e tecidos. Para transcrições relativamente raras são vistos apenas alguns pequenos partitura. Como aumenta a abundância de transcrição, estes crescem em número e tamanho. Assim como única molécula peixe (smFISH), única pequena partitura também pode corresponder ao único RNAs e deve também ser facilmente quantificada usando software de imagem e informática. Comparações de imagens publicadas obtidas usando smFISH com imagens que nós temos com curadoria para os mesmos objectivos de sugerem que a geral, a sensibilidade e a resolução dos dois métodos são relativamente semelhantes, embora isto deve ser testado pelo comparações mais rigorosas. Tendo em conta a despesa muito maior de smFISH, o método fornecido aqui deve dar resultados semelhantes em uma fração do custo. No entanto, se o objetivo é detectar pequenas transcrições, ou partes distintas de transcrições, smFISH é recomendado.
Devido ao tamanho menor de algumas sondas de peixe, este método também pode ser melhor em tecidos penetrantes que são grandes ou têm barreiras significativas. No entanto, nosso uso de níveis mais elevados de detergente e ajustes de fixação e permeabilização do tecido parecem ter resolvido este problema. Finalmente, embora desenvolvido para tecidos de Drosophila , os buffers de detergente altos descritos aqui para tecidos dissecados devem funcionar também para os tecidos, bem como a maioria dos outros organismos e embriões da drosófila .

Novos métodos de deteção de RNA de todo o genoma como RNA-seq expandiram enormemente nosso conhecimento de quando e onde os genes são expressos, e em que os níveis1. No entanto, estes fornecem relativamente pobre resolução temporal e espacial. RNA hibridação in situ permite a distribuição espacial de transcrições para ser observada visualmente em tecidos fixos, revelando os detalhes da localização celular e subcellular2. Usar hibridização fluorescente in situ (FISH) permite a resolução espacial ainda mais, pois permite o uso de técnicas de microscopia poderoso, como o de microscopia confocal e leve folha3. Marcadores fluorescentes como DAPI também podem ser usados para estabelecer relacionamentos subcellular4. PEIXES também facilita a observação de vários RNAs e proteínas simultaneamente com indicações claras de sobreposição a nível subcelular. Os reagentes originais e etapas necessárias para a dupla-rotulagem podem ser encontradas no seguinte referências3,5.
Os procedimentos descritos aqui utilizam placas de 96 poços da microplaca para todas as etapas, incluindo a produção de modelo de cDNA (PCR de Colônia), produção de sonda RNA (usando a transcrição de escoamento dependente do polymerase T7, T3 ou SP6), hibridização in situ , e desenvolvimento do sinal fluorescente. Um número suficiente de embriões ou tecidos é adicionado a cada bem da placa de 96 poços para permitir a avaliação da consistência e variabilidade. Bem, então, cada um recebe uma sonda diferente. Após o desenvolvimento do sinal, embriões ou tecidos de cada poço são dispostos em corrediças do microscópio individuais para análise microscópica.
O uso de amplificação de sinal tyramide (TSA) para a deteção de sonda produz sinais robustos com excepcional resolução subcellular 5,6,7,8. A Localização subcellular de RNAs é um importante mecanismo regulatório 9 que parece ocorrer com praticamente todos os RNAs 4,10,11. Essas análises também mostraram que muitas transcrições não são detectados pelo RNA-seq são prontamente detectadas pelo peixe 8. A adaptação de hibridação in situ RNA para placas de 96 poços permite a análise de até 96 genes de interesse numa altura (placas mais se adicionais são usadas), possibilitando a análise de grandes conjuntos de dados. Cortando as placas em seções menores, o método é também facilmente adaptado para apenas algumas amostras. O protocolo fornecido é adequado para a análise das distribuições de RNA na maioria dos tipos de tecidos. Embora não mostrado, é adaptável aos não - tecidos deDrosophila também.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno de 15 ml</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certificado DNase e RNase livre</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix com corante(Ambiogene)</td><td>Biomart (Canadá)</td><td>141106-1K</td><td>Certificado DNase e RNase livre 50</td></tr><tr><td>ml Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>Certificado DNase e RNase livre</td></tr><tr><td>Placa de filtração de 96 poços (1,2 um, PVDF hidrofílico membrana</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Usado para remover liguid do fundo da placa com tecidos de flotação</td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 poços (200 &mu; l)</td> Filtro de seringa <td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc (0,2 u)</td> <td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa Acrodisc (0,45 u)</td> <td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN Placas de armazenamento de ensaio de 96 poços</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Para armazenar estoques de glicerol bacteriano</td></tr><tr><td>AXYGEN Alumínio Selos de Placa</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Para selar placas</td></tr><tr><td>AXYGEN Pontas de furo largo (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Para transferir amostras</td></tr><tr><td>Biotina-SP (espaçador longo) Fração IgG Monoclonal de Camundongo Anti-Digoxina</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Anticorpo primário para in situ (estoque conc. 1 mg/ml, conc. de trabalho 2,5 &mu; g/ml ou 1/400 de diluição.</td></tr><tr><td>MARCA Coletor de 8 canais (autoclavável)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Para remover líquidos do topo das placas de PCR de 96 poços</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Concentração de estoque 34 mg/ml dissolvido e 0,2&mu; m filtrado em 100% EtOH (use como 1/1000)</td></tr><tr><td>Cianina 3 Tiramida (Cy3-TSA)</td><td>Feito</td><td></td><td>em casa Pode ser encomendado da Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Reagente antidesbotamento em meio de montagem</td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-uridina-5'-trifosfato</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de coleta de embriões</td><td>Home feito</td><td>N/A</td><td>Tamanho: 75 cm X 75 cm X 75 cm feito com polimetilmetacrilato</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5804</td><td>Centrífuga para placas de 96 poços em rotor A-Z-DWP</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Estoque: 50 mg/ml. Concentração de trabalho 1 mg/ml em solução de hibridização</td></tr><tr><td>Contas de armadura de laboratório</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Unidade de aquecimento de preenchimento</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Mistura de amostras</td></tr><tr><td>Malha - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Para coleta de embriões</td></tr><tr><td>Malha - 800 mícrons</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Para a captura de tecido solto / pode ser usado para tubo especial na figura 4.</td></tr><tr><td>Micro Óculos de Cobertura</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Tamanho: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro corrediças, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Tamanho: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Coletor de Vácuo de Placa Multi-Poços</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Remova o líquido do fundo da placa filtrante de 96 poços</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Máquina de</td></tr><tr><td>PCR</td> de fixação <td>Bio-Rad</td><td>Modelo: Motor de DNA PTC-200</td><td>PCR de placa de 96 poços e desnaturação de sonda</td></tr><tr><td>Solução de ácido pícrico</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Para fixação de tecido I solução</td></tr><tr><td>de cloreto de potássio (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de PP para placas de 96 poços, 100/caixa</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Tampa para armazenamento de placas</td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes descartáveis Progene (50 ml, estéreis)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Manuseio de líquidos</td></tr><tr><td>Progene Folha de alumínio perfurável</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal Placa de 96 poços, DNase e RNase livre</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td> Inibidor de ribonuclease RiboLock <td>de permeabilização de embriões</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>Conjunto de 40 unidades/ul</td></tr><tr><td>de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP)</td><td>Sistétese de sonda de RNA</td> <td>Roche</td><td>11277057001</td></tr> Água <tr><td>livre de RNase</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>Síntese de sonda de</td></tr><tr><td>RNA RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Remover contaminação por RNase</td></tr><tr><td>DNA de fita simples de testículos de salmão</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Para solução de hibridização</td></tr><tr><td>Leite desnatado (poder sem gordura)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>A concentração de trabalho é de 1 % em 1 X PBT ou PBTT como reagente bloqueador</td></tr><tr><td>Acetato de Sódio (NaOAc) 3 M, pH=5,2 (sem RNase)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td> A <td>concentração de trabalho é de 10 % (v/v) para precipitação de ADN ou RNA</td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Granalha de Aço Inoxidável para Banho de Areia</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Para encher a unidade de aquecimento</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio e fonte de luz pescoço de ganso</td><td>Leica</td><td>Modelo: MZ6</td><td>Dissecção e montagem de tecidos</td></tr><tr><td>Conjugado estreptavidina, peroxidase de rábano (HRP)</td><td>Sondas moleculares</td><td>S911</td><td>Estoque de anticorpos secundários: 1 mg/ml, use diluição de 1/1000 (1 &mu; g/ml) para in situ.</td></tr><tr><td>T3 RNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unidade/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unidade/ul</td></tr><tr><td>Estação de ponta (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certified DNase e RNase free</td></tr><tr><td>Tip station (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Tips ( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Certified DNase e RNase livre</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td> A <td>concentração de trabalho é de 0,3% em 1 X PBT para tecido in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td> A <td>concentração de trabalho é de 0,1% em 1 X PBT para embriões in situ</td></tr><tr><td>Papel de filtro qualitativo Whatman, Grau 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glicerol anti-fade mídia</td><td></td><td></td> de montagem <td>DABCO (1,25 g), Glycerol (35 ml ou v/v 70%) e 1 X PBS (15 ml, ou v/v 30%). Mantenha escuro e rocha na câmara fria. armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS com 1 ml Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS com 1 ml Tween 20 (0,1 %) e 3 ml de Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Leite desnatado em 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Leite desnatado em 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

alta resolução hibridação fluorescente in situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal tyramide

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Em nossos esforços para determinar os padrões de expressão e Localização subcellular da drosófila RNAs em uma base de todo o genoma e em uma variedade de tecidos, temos desenvolvido inúmeras modificações e melhorias para nossa original fluorescente in situ protocolo de hibridação (peixe). Para facilitar a taxa de transferência e custo eficácia, todas as etapas, desde a geração da sonda de detecção do sinal, são executadas usando placas de 96 poços da microplaca exon. Digoxygenin (escavação)-rotulados antisentido RNA sondas são produzidas usando clones de cDNA ou DNA genômico como modelos. Após a fixação de tecidos e permeabilização, sondas são hibridizadas para transcrições de interesse e então detectado usar uma sucessão de antianticorpo escavação conjugado com biotina, estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e conjugado fluorescente tyramide, que, na presença de HRP, produz um intermediário altamente reativo que vincula à regiões densa de elétron de proteínas imediatamente adjacentes. Estas etapas de amplificação e localização produzem um sinal robusto e altamente localizado que facilita a localização ambos transcrição celular e subcellular. Os protocolos fornecidos foram otimizados para produzir sinais altamente específicos em uma variedade de tecidos e estádios de desenvolvimento. As referências também são fornecidas para variações adicionais que permitem a detecção simultânea de várias transcrições, ou transcritos e proteínas, ao mesmo tempo.

A Figura 6 mostra exemplos de resultados obtidos usando este procedimento. Os top 3 painéis mostram exemplos dos primeiros embriões da drosófila (Figura 6, painéis A C), a próxima 3 painéis mostram exemplos de tarde embriões da drosófila com sinais em tecidos diferentes (amnioserosa, músculos e sistema nervoso central, respectivamente (Figura 6, painéis D-F). Em seguida são exemplos de 3º ínstar larvas tecidos (Figura 6, painéis G-J). Painéis, K e L mostram imagens representativas de adultas gônadas (ovário e testículo, respectivamente). Centenas de imagens foram carregadas e anotadas no nosso pesquisável 'fluorescente em situ mosca de fruta database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figura 1. Contorno da fluorescente em situ hybridization (FISH) protocolo chave equipamentos e. (A) amplificação por PCR do cDNA. (B) em vitro transcrição para gerar gene-específico antisentido DIG - rotulado de sondas de RNA em uma placa de 96 poços (foto da placa mostrada na b). (C) e (D): adultos (feminino: relação masculino 2:1. 300-400 moscas/bottle) moscas são permitidas para acasalar por 3-4 dias. Embriões de uma coleção durante a noite na comida de fubá padrão a 25 ° C são transferidos para uma caixa de plástico bem ventilada (1L de alimentos farinha de milho em um recipiente de tamanho: 8 "X 8" X 3" LWH) ou a novas garrafas, mantendo uma adequada densidade larval. Para coleta de tecido, o pó de fermento ativo deve ser polvilhado sobre o alimento às 24, 48 h após a postura (AEL) de ovos. (E de H): Fluorescente em situ as experiências de hibridação realizada por 3 dias consecutivos. Para embriões ou tecidos que não flutuam, use um prato PCR de 96 poços, como mostrado na foto b com aspirador de 8 canais (foto c). Para tecidos que flutuam, como a maioria dos tecidos larvais, use um prato com fundo de filtro (fotografia em d) e remover o líquido da parte inferior com um aspirador colector usando a baixa pressão (fotografia em mi). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figura 2. Determinação do rendimento de sonda de RNA. Recém sintetizado sondas antisentido RNA observadas em um gel de agarose 1% (5 µ l/pista). O rendimento pode ser categorizado (com base na intensidade da banda) como 'baixo rendimento nas faixas 3 e 10, «rendimento típico' nas faixas 1, 4, 5, 6 e 8 ou 'high yield' nas pistas, 2, 7, 9, 11 e 12. Para amostras com 'rendimentos típicos', use 10-15 µ l de sonda diluída em 100 µ l de solução de hibridização para cada experimento em situ . Dilua as amostras com 'rendimentos elevados' da sonda com solução de hibridização adicional de acordo com a intensidade da banda em relação a uma intensidade de 'sonda típico'. Objetivo a apresentar uma concentração de sonda final aproximadamente igual em cada poço. A seta aponta para uma das sondas RNA' ', a banda mais elevada em cada lane é o modelo original de DNA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figura 3. Principais etapas para uma colheita de embriões em larga escala e a fixação. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figura 4. Tubo caseiro para a remoção de líquido dos tecidos larvais ou flutuantes. Alguns tecidos adultos e larvas flutuam na solução durante a fixação. Esta ferramenta simples é composto por uma malha de nylon, realizada por um 200 µ l cortar a ponta, seguida por uma ponta de 1 mL, como um adaptador para ligar a um aspirador. Líquido pode ser removido com segurança, sem perder qualquer tecido. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figura 5. Amplificação do sinal de Tyramide. (1) escavar-etiquetadas sonda de RNA antisenso se com sentido endógeno do RNA. (2) ligação imuno-afinidade entre anticorpo primário conjugado biotina e DIG-UTP. (3) HRP conjugado streptavidin vincula biotina. (4) HRP catalisa a reação de cianina 3-tyramide e peróxido de hidrogênio para formar radicais de curta duração cianina 3-tyramide. (5) radicais de 3-tyramide cianina vincular a resíduos de tirosina nas proteínas nas proximidades. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figura 6. Representante em situ imagens de hibridização. Cada painel mostra um exemplo de um RNA diferente (mostrado em ciano) e núcleos corados com DAPI (mostrado em vermelho). (A-C) Exemplos dos primeiros embriões da drosófila . (D, F) Exemplos de tarde embriões da drosófila . (G-J) Exemplos de 3º ínstar larvas tecidos drosófila (túbulos malphigian, intestino, glândulas salivares e músculo respectivamente). (K) ovário adulto. (L) testículo adulto. Cada painel exibe o nome do gene que a sonda é cruzamento de. Barras de escala = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar transcritos de RNA in loco dentro de células e tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia celular e desenvolvimento, como, por exemplo, onde dentro de uma célula, um tecido ou um embrião um RNA está localizado. A principal vantagem desta técnica é que ela detecta distribuições espaciais de RNA com altos níveis de resolução e sensibilidade e a um custo baixo em comparação com outros métodos.Desenvolvemos inicialmente este protocolo para estudar as distribuições subcelulares de tantos RNAs de Drosophila quanto possível. Isso foi feito com o objetivo de determinar a extensão e a diversidade das distribuições subcelulares. Iniciamos o projeto trabalhando com embriões, mas posteriormente adaptamos e otimizamos o protocolo para que pudéssemos trabalhar em alto rendimento com tecidos dissecados de larvas e moscas.O aspecto mais difícil do procedimento é o número de etapas e o potencial consequente de erros, bem como a necessidade de garantir a ausência de RNAs durante a produção da sonda. Para facilitar o rendimento e a eficiência de custos, os procedimentos demonstrados neste vídeo utilizam placas de microtitulação de 96 poços em todas as etapas. Também é fácil adaptar este método a um número menor de amostras, cortando as placas em tiras de oito ou 12 poços.Inicie diluindo 10 microlitros de uma cultura bacteriana de crescimento noturno em 90 microlitros de água destilada e autoclavada em cada poço de uma nova placa de PCR de 96 poços. Desnature o DNA a 95 graus Celsius em um termociclador por cinco minutos. Coloque imediatamente a placa sobre gelo por pelo menos cinco minutos.Monte as reações de PCR em uma nova placa de PCR de 96 poços. Use as respectivas sondas universais e distribua 48 microlitros da mistura mestra de PCR para cada poço. Adicione dois microlitros de cada molde de DNA plasmidial desnaturado por poço.Realize a amplificação em uma máquina de PCR de 96 poços. Quando a amplificação estiver concluída, precipite o produto de PCR com uma mistura de etanol e acetato de sódio. Armazene as amostras por 30 minutos a menos 80 graus Celsius.Centrifugue a placa de 96 poços a 2.250 × g a quatro graus Celsius por 45 a 60 minutos. Utilizando uma pipeta de oito canais com vácuo que possui uma estrutura que impede que as ponteiras alcancem o fundo dos poços ao aspirar os pellets, remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave uma vez com 160 microlitros de etanol a 70% frio.Centrifugar a 2.250 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Inverter suavemente a placa de 96 poços sobre uma toalha de papel para remover as últimas gotas de líquido de cada poço e secar os pellets de DNA ao ar à temperatura ambiente por uma hora. Suspender o DNA precipitado em 25 microlitros de água livre de RNase.Verifique o tamanho e o rendimento dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose. Prepare as reações de transcrição in vitro adicionando os componentes apropriados a cada poço em uma nova placa de PCR de 96 poços. Adicione 7,5 microlitros de molde de DNA a cada poço correspondente.Cubra a placa com fita selante. Incube a placa a 37 graus Celsius por 3½ a quatro horas. Em seguida, adicione em cada poço uma mistura-mestra composta por água destilada tratada com DEPC, etanol a 100% e acetato de sódio três molar.Armazene a -80 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a placa e lave as cavidades conforme demonstrado anteriormente. Re-suspenda a sonda precipitada em 25 microlitros de água destilada tratada com DEPC.As sondas de RNA antissenso recém-sintetizadas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1% para verificar a integridade e o rendimento. Com base na intensidade da banda, o rendimento pode ser classificado como baixo, típico ou alto. Após utilizar cinco microlitros de cada sonda para eletroforese em gel de agarose, misture os 20 microlitros restantes com 100 microlitros de solução de hibridização e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso.Para iniciar este procedimento, coloque 20 a 30 larvas em uma placa de Petri contendo PBS frio na solução de fixação e resfrie no gelo por dois minutos para reduzir a motilidade larval. Disseque as larvas sob o microscópio estereoscópico. Utilize um par de pinças afiadas para abrir cuidadosamente a extremidade anterior e comprima os tecidos da região posterior para a anterior.Após um máximo de 15 minutos, transfira os tecidos dissecados para um tubo de 1,5 mililitro para fixação e coloque no gelo. Remova o PBS e adicione 800 microlitros da solução fixadora. Incube em um agitador de bancada por 30 minutos junto com outros tecidos previamente coletados em fixação.Lave os tecidos uma vez com 800 microlitros de PBTT e mantenha o tubo no gelo enquanto outros tecidos estão sendo coletados e fixados. Reúna todos os tecidos dissecados em um único tubo plástico de 15 mililitros contendo uma malha na tampa do tubo. Aspire o excesso de líquido através da malha na tampa.Lave com 10 mililitros de PBTT e enxágue com 10 mililitros de PBS. Para inibir a atividade da peroxidase endógena de rábano, adicione cinco mililitros de peróxido de hidrogênio 0,3% em PBS e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave duas vezes com 10 mililitros de PBTT.Permeabilize os tecidos adicionando 10 mililitros de acetona a 80% previamente resfriada e incube a menos 20 graus Celsius por 10 minutos. Lave duas vezes com 10 mililitros de PBTT para reidratar os tecidos. Após a lavagem dos tecidos conforme descrito no protocolo, armazene em solução de hibridização a menos 20 graus Celsius.Se não for utilizado no dia seguinte, o conjunto de filtro deve ser substituído por uma tampa comum. Aliquotar cerca de 20 microlitros por poço de tecidos em uma placa de PCR de 96 poços sobre gelo. Utilizando uma pipeta multicanal com manifold de oito canais, remover a solução de hibridização dos tecidos.Adicione 100 microlitros de solução de hibridização recém-desnaturada a cada poço e cubra com fita selante. Pré-hibridize os tecidos a 56 graus Celsius usando uma unidade de aquecimento a seco contendo esferas metálicas por um mínimo de 2½ a três horas. Desnature 100 microlitros da sonda preparada em uma placa PCR de 96 poços a 80 graus Celsius por cinco minutos.Resfrie imediatamente em gelo por cinco minutos. Remova a solução de pré-hibridização dos tecidos e adicione as sondas específicas para o gene, desnaturadas, a cada amostra. Cubra com fita selante de alumínio e hibridize a 56 graus Celsius sob esferas metálicas em uma unidade de aquecimento a seco por 16 a 18 horas durante a noite.Antes de iniciar o procedimento de detecção da sonda, aqueça previamente todas as soluções necessárias na unidade de aquecimento a 56 °C. Transfira cuidadosamente os tecidos hibridizados para uma placa de 96 poços que se encaixe em um manifold de vácuo para placas de múltiplos poços. Os poços dessas placas possuem fundos com membrana, o que permite a remoção do conteúdo sob vácuo.Remova as sondas da placa de 96 poços e lave as amostras com misturas da solução de hibridização e PBTT conforme os passos indicados nesta tabela na unidade de aquecimento a 56 graus Celsius. Após a terceira lavagem com PBTT, remova a placa de 96 poços da unidade de aquecimento, remova a solução de PBTT e bloqueie os tecidos com PBTTB em um agitador de bancada à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione 100 microlitros de solução de anticorpo por poço e incube por duas horas no agitador de amostras de bancada.Após a lavagem com PBTTB conforme descrito no protocolo no texto, adicione 100 microlitros de solução de estreptavidina peroxidase de rábano-picante por poço e incube à temperatura ambiente por 1 hora e meia. Lave duas vezes com PBTTB durante cinco minutos por lavagem. Após isso, incube os tecidos com a solução de DAPI conforme descrito no protocolo no texto.Inicie este procedimento incubando as amostras com a solução de tiramida e incubando-as por duas horas no agitador de bancada no escuro. Remova a solução de tiramida dos tecidos após a incubação. Após a lavagem com PBT e PBS conforme descrito no protocolo textual, adicione 150 microlitros de meio de montagem antifade por poço.Mantenha as amostras a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que os tecidos afundem até o fundo do poço ou tubo. No dia seguinte, monte as amostras em uma lâmina de microscópio e feche com uma lamínula. Por fim, visualize as amostras utilizando um microscópio de fluorescência.Mostram-se exemplos de resultados obtidos utilizando este procedimento em embriões de Drosophila precoces e em embriões de Drosophila tardios, com sinais na amniserosa, músculos e sistema nervoso central. O nome do gene ao qual a sonda hibridizou é indicado em cada painel. A seguir, há exemplos de tecidos de larvas de terceiro estádio, túbulos de Malpighi, intestino médio, glândula salivar e músculo.Por fim, são apresentadas imagens representativas de ovário adulto e testículos adultos. Após dominada e se realizada com eficiência, esta técnica pode ser concluída em apenas dois dias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em uma bancada livre de RNase, com ponteiras, tubos, placas e soluções livres de RNase, utilizando luvas.Se você estiver trabalhando com um grande número de amostras ou sondas, não se apresse durante o procedimento. Também é uma boa ideia criar estratégias para não se esquecer de onde parou. Ao seguir este procedimento, você pode combiná-lo com outros métodos, como a detecção de múltiplas sondas, sondas com proteínas ou marcadores celulares.Com isso, você poderá responder perguntas adicionais, como padrões de expressão relativos, identidades celulares e de compartimentos subcelulares, e efeitos em diferentes contextos genéticos ou doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a maioria dos tipos de hibridização in situ em qualquer tipo de tecido ou embrião. Não se esqueça de que o trabalho com reagentes como formaldeído, peróxido de hidrogênio e formamida pode ser extremamente perigoso, e precauções, como manuseio e descarte adequados, devem sempre ser tomadas durante a realização do procedimento.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Mesoscópica fluorescência tomografia opera além dos limites de penetração de tecido de corte de microscopia de fluorescência. A técnica é baseada na projeção multi-iluminação e uma descrição do transporte de fótons. Demonstramos in-vivo visualização de corpo inteiro em 3D da morfogênese da GFP-expressando asa em discos...

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

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No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar hibridização fluorescente in situ por reação em cadeia (HCR-FISH) nos lobos ópticos larvais de Drosophila melanogaster . Procedimentos para o projeto da sonda, hibridização, amplificação e montagem de tecidos são detalhados para facilitar a visualização do lobo óptico em desenvolvimento.

FISH de reação em cadeia de hibridização no lobo óptico em desenvolvimento de Drosophila

Aprenda hibridização in situ de alta resolução em embriões e tecidos de Drosophila usando amplificação de sinal por tiramida. Este método permite detectar RNA com sensibilidade e baixo custo em placas de 96 poços.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

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