Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

O objetivo geral deste procedimento é detectar transcritos de RNA no local dentro de células e tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia celular e do desenvolvimento, como onde dentro de uma célula, um tecido ou um embrião um RNA está localizado. A principal vantagem dessa técnica é que ela detecta distribuições espaciais de RNA com altos níveis de resolução e sensibilidade e a baixo custo em comparação com outros métodos.

Inicialmente, desenvolvemos este protocolo para estudar as distribuições subcelulares para o maior número possível de RNAs de Drosophila. Isso foi para determinar a extensão e a diversidade das distribuições subcelulares. Começamos o projeto trabalhando com embriões, mas depois adaptamos e otimizamos o protocolo para que pudéssemos trabalhar em alto rendimento com tecidos dissecados de larvas e moscas.

O aspecto mais difícil do procedimento é o número de etapas e o consequente potencial de erro, bem como a necessidade de garantir a ausência de RNAs durante a produção da sonda. Para facilitar o rendimento e a relação custo-benefício, os procedimentos demonstrados neste vídeo utilizam placas de microtitulação de 96 poços para todas as etapas. Também é fácil adaptar esse método a membros de amostra menores, cortando as placas em tiras de oito ou 12 poços.

Comece diluindo 10 microlitros de uma cultura bacteriana durante a noite em 90 microlitros de água bidestilada autoclavada em cada poço de uma nova placa de PCR de 96 poços. Desnature o DNA a 95 graus Celsius em um termociclador por cinco minutos. Coloque imediatamente o prato no gelo por pelo menos cinco minutos.

Configure as reações de PCR em uma nova placa de PCR de 96 poços. Use os primers universais apropriados e alíquota de 48 microlitros da mistura principal de PCR em cada poço. Adicione dois microlitros de cada molde de DNA de plasmídeo desnaturado por poço.

Realize a amplificação em uma máquina de PCR de 96 poços. Quando a amplificação estiver completa, precipite o produto da PCR com uma mistura de etanol e acetato de sódio. Armazene as amostras por 30 minutos a menos 80 graus Celsius.

Centrifugue a placa de 96 poços a 2.250 vezes g a quatro graus Celsius por 45 a 60 minutos. Usando uma pipeta de coletor de vácuo de oito canais, que possui uma estrutura que evita que as pontas cheguem ao fundo dos poços ao sugar os pellets, remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave uma vez com 160 microlitros de etanol frio a 70%.

Centrifugue a 2.250 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Inverta suavemente a placa de 96 poços em uma toalha de papel para remover as últimas gotas de líquido em cada poço e seque ao ar os pellets de DNA em temperatura ambiente por uma hora. Ressuspenda o DNA precipitado em 25 microlitros de água livre de RNase.

Verifique o tamanho e o rendimento dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose. Configure as reações de transcrição in vitro adicionando os componentes apropriados a cada poço em uma nova placa de PCR de 96 poços. Adicione 7,5 microlitros de molde de DNA a cada poço correspondente.

Cubra a placa com fita adesiva. Incube a placa a 37 graus Celsius por 3-1 / 2 a quatro horas. Em seguida, adicione a cada poço uma mistura principal composta de água destilada dupla tratada com DEPC, etanol 100% e acetato de sódio de três molares.

Armazene a 80 graus Celsius negativos por 30 minutos. Centrifugue a placa e lave os poços conforme mostrado anteriormente. Ressuspenda a sonda precipitada em 25 microlitros de água bidestilada tratada com DEPC.

Sondas de RNA antisense recém-sintetizadas foram executadas em um gel de 1% de agarose para verificar a integridade e o rendimento. Com base na intensidade da banda, o rendimento pode ser caracterizado como baixo rendimento, rendimento típico ou alto rendimento. Depois de usar cinco microlitros de cada sonda para eletroforese em gel de agarose, misture os 20 microlitros restantes com 100 microlitros de solução de hibridização e armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário.

Para iniciar este procedimento, coloque 20 a 30 larvas em uma placa de Petri contendo PBS frio em uma solução fixa e leve à geladeira por dois minutos para reduzir a motilidade larval. Dissecar as larvas sob o escopo de dissecação. Use um par de pinças afiadas para abrir cuidadosamente a parte anterior e apertar os tecidos de posterior para anterior.

Após no máximo 15 minutos, transferir os tecidos dissecados para um tubo de 1,5 mililitro para fixação e colocar sobre gelo. Remova o PBS e adicione 800 microlitros de solução fixa. Incube em uma batedeira de bancada por 30 minutos junto com outras previamente coletadas em tecidos de fixação.

Enxágue os tecidos uma vez com 800 microlitros de PBTT e mantenha o tubo no gelo enquanto os tecidos adicionais estão sendo coletados e fixados. Agrupe todos os tecidos dissecados em um único tubo de plástico de 15 mililitros contendo malha na tampa do tubo. Aspire o excesso de líquido através da malha da tampa.

Lave com 10 mililitros de PBTT e enxágue com 10 mililitros de PBS. Para extinguir a atividade endógena da peroxidase de rabanete, adicione cinco mililitros de peróxido de hidrogênio a 0,3% em PBS e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Lave duas vezes com 10 mililitros de PBTT.

Permeabilize os tecidos adicionando 10 mililitros de acetona a 80% pré-resfriada e incubando a menos 20 graus Celsius por 10 minutos. Lave duas vezes com 10 mililitros de PBTT para reidratar os tecidos. Depois de lavar os tecidos conforme descrito no protocolo de texto, armazene em solução de hibridização a menos 20 graus Celsius.

Se não for usado até o dia seguinte, o conjunto do filtro deve ser substituído por uma tampa normal. Alíquota de cerca de 20 microlitros por poço de tecidos em uma placa de PCR de 96 poços no gelo. Usando uma pipeta de oito canais, remova a solução de hibridização dos tecidos.

Adicione 100 microlitros de solução de hibridização recém-desnaturada a cada poço e cubra com fita de vedação. Pré-hibridizar os tecidos a 56 graus Celsius usando uma unidade de aquecimento de banho seco contendo esferas de metal por um período mínimo de 2-1 / 2 a três horas. Desnature 100 microlitros da sonda preparada em uma placa de PCR de 96 poços a 80 graus Celsius por cinco minutos.

Deixe esfriar imediatamente no gelo por cinco minutos. Remova a solução de pré-hibridização dos tecidos e adicione sondas específicas de genes desnaturados a cada amostra. Cubra com fita de vedação de alumínio e hibridize a 56 graus Celsius sob contas de metal em uma unidade de aquecimento de banho seco por 16 a 18 horas durante a noite.

Antes de iniciar o procedimento de detecção da sonda, pré-aqueça todas as soluções necessárias na unidade de aquecimento a 56 graus Celsius. Transfira cuidadosamente os tecidos hibridizados para uma placa de 96 poços que se encaixe em um coletor de vácuo de placa de vários poços. Os poços dessas placas possuem fundos de membrana que permitem a remoção do conteúdo sob vácuo.

Remova as sondas da placa de 96 poços e lave as amostras com misturas de solução de hibridização e PBTT de acordo com as etapas indicadas nesta tabela na unidade de aquecimento de 56 graus Celsius. Após a terceira lavagem com PBTT, remova a placa de 96 poços da unidade de aquecimento, remova a solução de PBTT e bloqueie os tecidos com PBTTB em uma batedeira de bancada em temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione 100 microlitros de solução de anticorpos por poço e incube por duas horas no misturador de amostras de bancada.

Após enxaguar com PBTTB conforme descrito no protocolo de texto, adicione 100 microlitros de solução de peroxidase de rabanete estreptavidina por poço e incube em temperatura ambiente por 1-1 / 2 horas. Lave duas vezes com PBTTB por cinco minutos por lavagem. Depois disso, incubar os tecidos com solução de DAPI conforme descrito no protocolo de texto.

Inicie este procedimento incubando as amostras com solução de tiramida e incube as amostras por duas horas no misturador de bancada no escuro. Remova a solução de tiramida dos tecidos assim que a incubação for concluída. Após a lavagem com PBT e PBS conforme descrito no protocolo de texto, adicione 150 microlitros de mídia de montagem antidesbotamento por poço.

Mantenha as amostras a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que os tecidos afundem no fundo do poço ou tubo. No dia seguinte, monte as amostras em uma lâmina de microscópio e sele com uma lamínula. Por fim, faça a imagem das amostras usando um microscópio de fluorescência.

São mostrados exemplos de resultados obtidos usando este procedimento para embriões de Drosophila precoces e embriões de Drosophila tardia com sinais na amnioserosa, músculos e sistema nervoso central. O nome do gene ao qual a sonda hibridizou é exibido em cada painel. A seguir estão exemplos de tecidos larvais de terceiro ínstar, túbulos de Malpighi, intestino médio, glândula salivar e músculo.

Por fim, são mostradas imagens representativas do ovário adulto e dos testículos adultos. Uma vez dominada e se executada com eficiência, essa técnica pode ser feita em menos de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em uma bancada livre de RNase com pontas, tubos, placas e soluções sem RNase e usar luvas.

Se você estiver trabalhando com um grande número de amostras ou sondas, não apresse o procedimento. E também é uma boa ideia inventar truques para que você não se esqueça de onde está. Ao seguir este procedimento, você também pode combiná-lo com outros métodos, como detectar várias sondas, sondas com proteínas ou marcadores celulares.

Com eles, você pode responder a perguntas adicionais, como padrões de expressão relativa, identidades de compartimentos celulares e subcelulares e efeitos em diferentes origens genéticas ou doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a maioria dos tipos de hibridização in situ em qualquer tipo de tecido ou embrião. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes como formaldeído, peróxido de hidrogênio e formamida pode ser extremamente perigoso e precauções como manuseio e descarte adequados devem sempre ser tomadas durante a execução do procedimento.