Name: Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda microscopia intravital para visualizar monócitos em modelos murinos de doença arterial periférica. Este método permite estudar homing celular e angiogênese em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pela ELSE-Kröner-Stiftung e a DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação de pesquisa alemã) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). Agradecimento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidade Otto-von-Guericke Magdeburg, Alemanha, para suporte técnico.

nosso estudo foi realizado com a permissão do estado de Saxônia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, de acordo com a seção 8 da lei alemã de proteção animal. (§ 8, n. º 1 da lei alemã de proteção animal de 18.05.2016 - BGBI. Eu s. 1206, 1313, § 31 de TierSchVersV de 13.08.2013).
 Nota: para os experimentos aqui, 8 a 12 camundongos BALB/c machos de semana foram utilizados, e monócitos humanos de doadores de sangue foram utilizados para a visualização de monócitos através de microscopia intravital.
 1. preparação da célula Nota: para o isolamento de monócitos, por favor, veja nosso vídeo anterior publicado na JoVE para instruções: &#34; isolamento e endovenosa injeção de murino medula óssea derivada Os monócitos &#34; por Wagner et al. 4 Nota: quando trabalhar com as células de todas as etapas deve ser esterilizado para evitar a contaminação.
<ol><li>Coloracao celular com 3,3 &#39;-perclorato de Dioctadecyloxacarbocyanine <ol><li>Ressuspender as células em meio de cultura livre de soro com uma densidade de 1 x 10 6 células/mL. 
		Nota: Apenas meio livre de soro permite uma coloração eficiente, uma vez que o corante lipofílico já caso contrário iria ser capturado pelos componentes lipofílicos do soro.</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de 1mm 3,3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato em dimetilformamida a 1 mL de suspensão de célula e ressuspender cuidadosamente.</li>
		<li>Incubar a solução de célula a 37 ° C por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar as células a 37 ° C e 500 x g, durante 5 min.</li>
		<li>Desalojar o sobrenadante e ressuspender as células com o meio de soro suplementado quente vitela fetal 37 ° C.</li>
		<li>Repetir as etapas 1.1.4 e 1.1.5 duas vezes.</li>
		<li>Contar as células com a fórmula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>Ressuspender as células com 150 solução de NaCl 0,9% estéril µ l.</li>
		<li>Injetar as células a veia da cauda.</li>
	</ol></li></ol> 2. Anestesia <ol><li>Anestesia por inalação <ol><li>vaporizar isoflurano com a ajuda de um vaporizador usando uma concentração de 5% em um escaninho fechado sob uma capa de segurança química.</li>
		<li>Cuidado com o mouse e colocá-lo para o lixo.</li>
		<li>Lidar com o animal pela pele do pescoço posterior, depois que parou de se mover.</li>
	</ol></li> <li>Anestesia intraperitoneal Nota: anestesia de uso isoflurano, descrita no passo 2.1, para realizar uma injeção intraperitoneal. Com a recuperação rápida e de curta duração efeito narcótico da anestesia isoflurano, é mais fácil lidar com o mouse e injetar a anestesia intraperitoneal.
	<ol><li>Use uma solução de 2,4 mL cetamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL NaCl (0,9%) para a injeção intraperitoneal.</li>
		<li>Pesar o animal antes de aplicar o anestésico. 
		Nota: A fórmula para o anestésico é: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>usar uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G para injectar a solução para o baixo-ventre esquerdo.</li>
		<li>Coloque o mouse em sua gaiola e esperar pelo efeito narcótico. 
		Nota: O efeito narcótico normalmente aparece dentro de 5 min se a injeção foi bem sucedida. A correta profundidade da anestesia pode ser determinada pela ausência de reflexo de tampa ou reação a pitada do dedo do pé, bem como uma taxa de respiração regular, controlada.</li>
	</ol></li></ol> 3. Implantação da membrana basal, como Matrix Nota: Este método é usado pelo nosso grupo para estudar a angiogênese do tumor após a injeção de monócitos. Dependendo das experiências, fatores de crescimento pode ser adicionados à matriz da membrana basal-like. Realizamos a ligadura da artéria femoral antes de injetar o tumor no flanco do mouse. A matriz deve ter uma temperatura de 4 ° C para a injeção. A esta temperatura, a matriz é fluido; o gel endurece em um sólido à temperatura corporal (37 ° C). Para melhor visibilidade da matriz subcutânea plug, raspar a pele do rato no local da injeção.
 Nota: opcional: Adicione 100 ng fator de crescimento fibroblástico básico, 300 ng vascular fator de crescimento endotelial e 26 UI heparina sob condições estéreis para a matriz de membrana basal-like.
<ol><li>Carregar 1 mL de matriz em uma seringa de insulina 30g e loja no gelo até o uso.</li>
	<li>Colocar o animal na mesa e mantenha a pele do rato ao lado do local da injeção, no flanco.</li>
	<li>500 µ l da membrana basal, como matriz de injectar por via subcutânea. 
	Nota: Por razões práticas, é necessário injetar a membrana basal, como matriz compacta em um único local para evitar dispersão subcutâneo. Será mais fácil desalojar o artificial tumor do tecido após sacrificar o mouse no final do experimento.</li>
</ol> 4. Injeção da veia da cauda Nota: praticar a injeção de veia de cauda com solução de NaCl em animais de teste antes de experimentação. Se os monócitos não podem adequadamente ser injetados na veia do rabo, não haverá nenhum efeito sistêmico sobre o collateralization. Neste protocolo, injetamos monócitos 2,5 milhões. Tentar injetar não mais do que 5 µ l/g de peso corporal.
<ol><li>Use a solução de monócitos preparada sob passo 1.1.8 contendo 2,5 milhões monócitos.</li>
	<li>Usar uma agulha de 30g e uma seringa de insulina 1 mL para a injeção.</li>
	<li>Cuidadosamente lidar com o mouse, conter o animal a retenção e verifique se o mouse não é prejudicado e tem espaço adequado para a respiração.</li>
	<li>Fazer a retenção sobre a almofada de aquecimento para que a cauda pode entrar em contato com a placa.</li>
	<li>Identificar as veias de cauda, que estão localizadas no lado lateral da cauda.</li>
	<li>Fugissem a 90 °, então a veia da cauda aparece na parte superior da cauda.</li>
	<li>Desinfectar o lado de injeção antes de injetar os monócitos.</li>
	<li>Tentar injectar a solução de monócitos em um ângulo plana com o bisel da agulha virado para cima 
	Nota: Pare a injeção se aparecer uma bolha, como este é um sinal de uma injeção de falha. Tente o procedimento novamente mais proximalmente.</li>
	<li>Parar o sangramento no local da injeção, aplicando uma pressão suave na cauda para cerca de 60 anos.</li>
	<li>Observar o animal durante 30 min monitorar para efeitos colaterais sistêmicos e posicione o mouse em sua jaula, depois que o animal se recuperou totalmente.</li>
</ol> 5. A microscopia intravital <ol><li>preparação <ol><li>Coloque o mouse anestesiado sobre a almofada de aquecimento (37 ° C) para manter uma temperatura constante e corrigir as patas no lugar com fita adesiva.</li>
		<li>Desinfectar a pele no local da perna ou flanco que é usado para a microscopia.</li>
		<li>Raspar a região de interesse para melhor manuseio e para evitar a interferência com cabelo.</li>
		<li>Excisar a pele com um bisturi estéril e pinça fina em uma área quadrada de 0,5 x 0,5 cm. 
		Nota: É importante manter a região de interesse húmidas; caso contrário, a qualidade das imagens e tecido ficará comprometida. Solução de NaCl pode ser usada para umedecer a área.</li>
		<li>Coloque a perna entre dois selos ajustáveis e coloque um vidro de tampa em cima os selos.</li>
		<li>Garantir que o tecido é molhado e está em contacto com o vidro.</li>
		<li>Inject 50 µ l rodamina dextrano retrobulbar no sistema venoso para melhor visibilidade dos vasos.</li>
		<li>Começar a microscopia e ajuste a posição da perna, se necessário.</li>
	</ol></li> <li>Configurações de microscopia intravital <ol><li>ligar o microscópio, computador, interfaces eletrônicas e lasers.</li>
		<li>Ligar a unidade de aquecimento da câmara de incubação e/ou aquecimento fase (placa/almofada) e definir a temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Iniciar o software de aquisição. Se o microscópio é equipado com um scanner de ressonância, selecione esse modo de digitalização rápido.</li>
		<li>Esperar até que a temperatura atinja um nível constante (35-37 ° C) 
		Nota: Uma temperatura estável é importante para: (a) o mouse, o que sob anestesia não pode controlar sua temperatura corporal e (b) evitar ou pelo menos minimizando deriva focal. Isto pode demorar 1h para várias horas, dependendo das condições do ambiente (por exemplo, sistema de ar condicionado e o número de fontes de calor na sala, incluindo as pessoas). Se os objectivos de imersão são usados, zona de contato entre a lente e tampa de vidro (ou tecido) é uma fonte típica de instabilidade. Aquecimento a lente com um aquecedor objetivo pode ajudar; Alternativamente, um microscópio com um sistema de autofoco é altamente recomendado.</li>
		<li>Selecionar uma lente de ampliação com uma alta abertura numeral que preenche os requisitos da resolução do experimento (ver nota no final desta seção).</li>
		<li>Otimizar as configurações de microscópio em relação ao ganho, ajustes da canaleta, velocidade de digitalização, pixels de resolução, profundidade volume, tamanho de etapa e em média antes de colocar o animal experimental no palco.</li>
		<li>Scan bidirecionalmente para reduzir o tempo de aquisição.</li>
		<li>Coloque o mouse anestesiado no palco escaldadas microscópio após o microscópio atingiu condições estáveis e as configurações foram testadas com a ajuda de um boneco.</li>
		<li>Trazer a região de interesse dentro da matriz da membrana basal, como em foco usando iluminação luz brilhante e inspecionar brevemente os capilares por luz ultravioleta com configurações de filtro adequado para o fluorophores aplicada.</li>
		<li>Alternar para digitalização modo; iniciar a digitalização no modo de baixa resolução de 256 x 256 e aumentar o ganho e poder do laser até um sinal é observado no monitor.</li>
		<li>Foco na estrutura de interesse. Zoom até que todos os detalhes são visíveis.</li>
		<li>Define &#34; começar a &#34; e &#34; final &#34; posições na direção axial.</li>
		<li>Parar a varredura.</li>
		<li>Definir piso tamanho (por exemplo, 0,5 µm) e o número de aviões focais (por exemplo, 10-20).</li>
		<li>Interruptor para a resolução de pixel final (512 x 512 ou 1.024 x 1.024) dependendo da velocidade do movimento estruturas subcelulares ou células e selecione o scan velocidade (frequência de varredura) que se encaixa melhor aos movimentos. Bidirecional de digitalização é recomendada para fixar a aquisição de pilhas. 
		Nota: Selecione a maior taxa de varredura de digitalização que oferece qualidade de imagem suficiente. Verificadores de ponto típico oferecem velocidades entre 400 Hz e 1,4 kHz. Scanners de ressonância fornecem um adicional de 8 kHz ou 12 kHz. Reduzindo o número de linhas na direção y, a taxa de varredura pode ser aumentada (valores típicos são 512 x 512, 512 x 256 ou 512 x 200 pixels de resolução). Dependendo da relação sinal-ruído, um pode tentar melhorar a qualidade de imagem, adicionando a linha média entre 2 e 4. Normalmente, uma configuração de 512 x 200, com uma média de não resulta em um tempo de aquisição/quadro de 18 ms no modo bidirecional com um scanner de ressonância de 8 KHz; com 512 x 200 e 4 x em média, retarda para baixo para 56 ms por quadro.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.</a> (2017).</li>
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<li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar com outras instituiç...

Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente1. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta o desenvolvimento das artérias colaterais. Os monócitos são um tipo de célula importante associado com collateralization. Nosso grupo centrou-se em Pesquisar os efeitos de monócitos em áreas de inflamação4,5, em particular, usando o modelo de isquemia do membro posterior para induzir isquemia e inflamação subsequentes6. Os monócitos lar de áreas de inflamação e causam respostas sistêmicas complexas que levam ao desenvolvimento de collateralization7.
Com o uso da microscopia intravital, podemos estudar o comportamento dessas células na vivo e observar a orientação de monócitos injetados para as áreas de inflamação. A maioria dos estudos anteriores descrevem apenas post-mortem de análises, que possuem desvantagens, incluindo uma introdução de artefatos histológicos e um grande número de animais necessários para preparações. Com nossa abordagem, podemos investigar processos imunológicos e formação colateral através de viver de imagem em múltiplos pontos de tempo.
Além do desenvolvimento das artérias colaterais em áreas isquêmicas, monócitos também influenciam o crescimento do tumor. Para investigar estes processos, injetamos uma matriz de membrana basal, como extraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame, um tumor rico em proteínas de matriz extracelular8e analisar usando microscopia intravital. Esta matriz é usada para teste de tela moléculas para formação de rede de células endoteliais ou terapias contra o cancro através da inibição angiogênico; Neste caso, vamos avaliar o potencial angiogênico de tumor de monócitos para celular terapia9,10,11.
O objectivo do presente protocolo é demonstrar uma maneira fácil e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo . Podemos gerar um ambiente de teste mais realista em relação ao exame histológico do post-mortem o tecido muscular.

<table><tbody><tr><td>10% de soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% de penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina Omnifix -F de 1mL</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 50 ml&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Alemanha</td><td></td><td>Seringa injetora 50 ml com cânula</td></tr><tr><td>6-well-ultra-low-attachement-plates</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 semanas de idade, macho, C57BL/6, camundongos BalbC&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>TESA SE, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquisição de software</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Versão: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Cânulas</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células</td><td>Fabricado pelo nosso grupo com componentes</td><td></td> únicos <td>Medium199, 10% Soro fetal de bezerro, 1% Antibiótico (penicilina/estreptomicina)Centrífuga</td></tr> <tr><td></td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemanha</td><td></td><td>Allegra X-15R centrífuga</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet, Mannheim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de desinfecção</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável nº 10&nbsp;</td><td>Navalha de segurança de penas Co.Ltd, Osaka, Japão&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balão Erlenmeyer</td><td>GVB, Herzogenrath, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal para Bezerros</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Rubis, Stabio, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Placa Quente 062</td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos humanos</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de leucócitos humanos</td><td>Incubadora de preservação</td><td></td><td></td>de sangue</tr><tr><td></td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de separação de leucócitos (tubos com filtro)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemanha</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Meio de separação de linfócitos LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nova Jersey, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Médio M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bancada de trabalho microbiológica</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemanha</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para microscópio com incubadora e unidade de aquecimento</td><td>&nbsp; Leica DMI 6000, Pecon, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de monócitos</td><td>Fabricado pelo nosso grupo com componentes</td><td></td> únicos <td>PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Limitador de mouse</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópios multifótons&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Microscópio confocal Leica SP5, Cameleon, NaCl coerente</td></tr><tr><td>(0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Neubauer&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>ph 7,4</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td> estéril <td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fabricado pelo nosso grupo com componentes</td><td></td> únicos <td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Solução de Percoll</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td>10&micro; L/100&micro; L/200&micro; L/1000&micro; L</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>&nbsp; Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Cabeças de pipetagem</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig; en, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade de sucção</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Alemanha</td><td></td><td>Conforto Vacusafe</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos com tampa</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>xilazina (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml; sseldorf, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de monócitos homing e angiogênese relacionados ao tumor em um modelo murino de doença arterial periférica

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.
Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.
Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.

A microscopia intravital para o exame do tumor e o crescimento de vasos colaterais desencadeada por monócitos pode ajudar a revelar novos aspectos nos mecanismos moleculares de vasculogênese e arteriogenesis. As células devem ser preparadas e injetado cuidadosamente usando as etapas do protocolo. Diferenças podem levar a variações entre experiências simples. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso (Figura 1) para manter efeitos sistêmicos e evitar ...

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Olá, meu nome é Christian Deffge. Sou médico na universidade hospitalar de Magdeburgo e trabalho no grupo de pesquisa cardiovascular da Dra. Herold e do Professor Braun-Dullaeus. Nós investigamos o aumento do crescimento colateral.Portanto, utilizamos imagem. Neste vídeo, queremos explicar nossos métodos. Suspender as células em meio de cultura sem soro com uma densidade de 1 × 10⁶ células por mililitro.Adicione cinco microlitros de DIO um milimolar e dimetilformamida a um mililitro da suspensão celular e ressuspenda cuidadosamente. Incube a solução celular a 37 graus Celsius por 20 minutos. Centrifugue as células a 500 g por cinco minutos.Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em meio suplementado com FCS aquecido a 37 graus Celsius. Repita este passo duas vezes. Conte as células com a ajuda de uma câmara de contagem de Neubauer e microscopia de luz.Resuspenda as células com solução de cloreto de sódio. Injete as células na veia da cauda. A matriz Matrigel é uma preparação de membrana basal reconstruída extraída do sarcoma espindulocelular.Realiza triagem de moléculas-teste quanto à formação de rede em células endoteliais ou terapias anticâncer por meio da inibição angiogênica. Reavalia o potencial angiogênico tumoral de monócitos que buscamos utilizar para terapia celular. Adicione 100 nanogramas de BFGF, 300 nanogramas de VEGFA e 26 unidades internacionais de heparina em condições estéreis ao Matrigel.Após agitar a solução em vórtex, preencha uma seringa de insulina de um mililitro e armazene em gelo até o uso. Para melhor visualização da placa subcutânea de Matrigel, retire os pelos da pele do camundongo no local da injeção. Você pode usar um bisturi afiado ou creme depilatório.Coloque o animal sobre a mesa e segure a pele do camundongo próximo ao local de injeção no flanco. Injete 500 microlitros de Matrigel por via subcutânea. Por razões práticas, é necessário injetar o Matrigel de forma compacta em um único local para evitar a dispersão subcutânea.Será mais fácil remover a matriz de Matrigel do tecido após sacrificar o camundongo no final do experimento. Pratique a injeção de monócitos com solução de cloreto de sódio antes da experimentação. Se os monócitos não puderem ser aplicados sistemicamente, não haverá efeito sistêmico.Dentro deste protocolo, injetamos 2,5 milhões de monócitos. Tente injetar não mais do que cinco microlitros por grama. Certifique-se de que o camundongo esteja aquecido com a ajuda de uma placa aquecedora durante todo o procedimento.Para a aplicação sistêmica das células, você precisará de um dispositivo de contenção, uma seringa de insulina de um mililitro, uma agulha de 30 g e a suspensão de monócitos em solução de cloreto de sódio. Manipule cuidadosamente o camundongo e contenha o animal no dispositivo. Certifique-se de que o camundongo não seja prejudicado e tenha espaço adequado para respirar.Coloque o restritor sobre a placa aquecida de modo que a cauda entre em contato com a placa. Certifique-se de desinfetar o local da injeção para evitar infecção. Identifique as veias da cauda, que estão localizadas no lado lateral da cauda.Gire a cauda em 90 graus para que a veia caudal fique voltada para o lado superior da cauda. Tente injetar a solução de monócitos em um ângulo rasante. Observe o animal por 30 minutos para verificar a ocorrência de efeitos colaterais sistêmicos.Coloque o camundongo na sua gaiola após a recuperação completa do animal. Coloque o camundongo anestesiado sobre a platina do microscópio pré-aquecida após o microscópio atingir condições estáveis e as configurações terem sido testadas por um simulacro. Fixe as patas com fita adesiva.Desinfete a pele na região da perna ou flanco utilizada para microscopia. Apare a área de interesse para melhor manipulação e evitar interferência com os pelos. Mantenha a área de interesse úmida.Caso contrário, a qualidade das imagens e do tecido será comprometida. Coloque a perna entre dois suportes ajustáveis. Posicione um lamínula sobre os suportes.Inicie a microscopia e ajuste a posição da perna, se necessário. As configurações do microscópio dependem do software utilizado. Consulte o protocolo para obter mais informações.Nossos dados demonstram que a microscopia intravital representa uma ferramenta poderosa para a visualização de monócitos transplantados dentro do fluxo sanguíneo em modelos animais pequenos. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso para manter efeitos sistêmicos e evitar embolias que podem ocorrer se a injeção for realizada no sistema arterial. Se Matrigel for usado, injetar lentamente para evitar dispersão ajudará na explantação da placa para exame histológico posterior.Dentro da placa de Matrigel, é possível medir a vascularização contando os capilares em diferentes condições experimentais. Os achados da microscopia intravital podem ser confirmados por exame histológico. É possível identificar monócitos detectados por microscopia intravital em todas as seções teciduais.Se for necessário muito tempo para a aquisição de imagens, a quantidade de dextrana rodamina dentro do vaso diminui. Para melhor visualização dos vasos, a aplicação da dextrana rodamina deve ser repetida. O uso de sondas positivas para células em Matrigel pode ajudar a obter ajustes ideais.O objetivo dos tratamentos para a doença arterial periférica ou para a doença cardíaca isquêmica é aumentar o fluxo sanguíneo para outras áreas perfundidas causado pela estenose hemodinâmica. A terapia celular por meio da perfusão potencializada por monócitos, através da estimulação da formação de colaterais, é uma opção não invasiva para pacientes sem indicação cirúrgica. Além do desenvolvimento de artérias colaterais em áreas isquêmicas, os monócitos também podem influenciar o crescimento de tumores.Para investigar esses processos, utilizamos a injeção de Matrigel em conjunto com microscopia intravitai. Nosso objetivo com este protocolo é demonstrar uma maneira simples e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo. Com este novo método, somos capazes de gerar um ambiente de teste mais realista em comparação com o processamento histológico de tecido muscular post mortem.

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Research

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Medicine

Medicina

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Neste vídeo, demonstramos a visualização em tempo real das interações entre células sanguíneas e endoteliais nas veias mesentéricas de um modelo de camundongo injetado intraperitonealmente com lipopolissacarídeo.

Microscopia intravital para analisar as interações células sanguíneas-endoteliais em um modelo de camundongo com inflamação

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Este manuscrito descreve o uso de camundongos transgênicos repórter e vias de administração diferentes de corantes fluorescentes em angiotensina II induzida por hipertensão usando microscopia intravital de vídeo dos vasos sanguíneos para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e suas capacidade de rolar e aderir ao endotélio.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Aprenda microscopia intravital para visualizar monócitos em modelos murinos de doença arterial periférica. Este método permite estudar homing celular e angiogênese em tempo real.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica (Vídeo) | JoVE Journal

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

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