Name: Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a caracterização bioquímica e estrutural da proteína de ligação a substrato SP0092 de Streptococcus pneumoniae. Este método utiliza ensaios de fluorescência, SEC-MALS e cristalografia de raios X para otimizar condições de cristalização e determinar estruturas atômicas.

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Reconhecemos a OPPF-UK para assistência em clonagem, Gemma Harris para SEC-shoppings e os cientistas de luz síncroton I03 e I04 na fonte de luz de diamante.

Nota: A sequência de código para o qual é eliminado e o peptídeo sinal é clonada no vetor pOPINF seguindo um protocolo padrão de na fusão; a proteína nativa é expresso como uma fusão de sua marca em células de Escherichia coli BL21 Rosetta 28 , 29. a selenometionina rotulada variante é expresso seguindo métodos padrão de acordo com o fabricante de 30. A recombinação SBP é purificado como anteriormente descrito 31 , 32.
 1. Caracterização bioquímica <ol><li>térmica deslocar ensaio <ol><li>48 preparar soluções tampão com pH variando de 4.0 para 9,5 e concentração de NaCl de 0 a 0,5 M e dispense 40 µ l em uma placa de 96 poços, conforme descrito no Tabela 1 33.</li> <li>Adicionar para cada bem 5 µ l da solução de SBP na concentração de 1-2 mg/mL.</li>
		<li>Adicionar para cada bem 5 µ l de 20 x mancha fluorescente para proteínas (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Misturar as soluções pipetando, selar a placa usando uma película adesiva transparente e girar por 2 min a 112 x g, à temperatura ambiente.</li>
		<li>Executar o experimento em uma máquina em tempo real: definir uma rampa de temperatura de 3 ° C/min de 4 a 99 ° C com um tempo de espera 10 s e ler a fluorescência cada 0,5 ° C com excitação em 483 nm e emissão em 568 nm.</li>
		<li>Analisar as curvas de emissão de fluorescência para cada condição de buffer, identificando a temperatura de fusão (T m) como o mínimo da derivada. 
		Nota: Este procedimento dá uma boa indicação da melhor solução-tampão para ajudar na melhoria da estabilidade da proteína. Escolha a faixa de pH e concentração de sal com base na condição de reserva com a mais alta T m e adicionar 2,5% (v/v) de glicerol e 0,5 mM de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) para definir a solução-tampão para as próximas etapas (SEC-tampão).</li>
	</ol></li> <li>MALS e analítico SEC <ol><li>realizar uma lavagem de duas colunas volume da coluna de filtração de gel pré embalados com água filtrada libertos (usar uma coluna de 24 mL de peso molecular de vasta gama).</li>
		<li>Conectar-se a coluna para o detector de espalhamento de luz e equilibrar a coluna com o determinado SEC-buffer de ensaio térmico turno.</li>
		<li>Injetar 100 µ l de SBP purificada em 5 mg/mL para o equilibrado SEC coluna e fluxo uma coluna volume do SEC-buffer.</li>
		<li>Verificar o cromatograma de eluição para único ou vários picos e examinar os dados de espalhamento usando o software de análise, obtendo a massa molar e o índice de polidispersividade para todas as espécies. 
		Nota: Para cada pico correspondendo a uma espécie oligoméricas, é benéfico verificar a polidispersividade índice calculado como massa molar ponderada na massa molar/massa ponderada em número de moléculas (Mw/Mn). Um valor de polidispersividade próximo de 1 indica um pico monodispersas. 
		Nota: Uma vez que todas as espécies de oligomerização são definidas, é útil estudar a sua dependência da concentração de proteína, como umas concentrações mais elevadas podem favorecer a maior formação oligómero.</li>
		<li>Executar várias execuções de SEC analíticas; injetar 100 µ l de SBP purificado a aumentar as concentrações (0,1 - 10 mg/mL) na coluna de filtração de gel equilibrado (usar uma coluna de 5 mL de peso molecular de vasta gama) e um volume de coluna do SEC-buffer de fluxo de cada vez.</li>
		<li>Verificar o cromatograma de eluição para único ou vários picos e analisar as intensidades de absorbância em 280 nm das curvas correspondentes a diferentes concentrações de proteína de partida. Se as intensidades relativas dos picos diferentes permanecem constantes, nenhuma conversão inter entre as espécies oligoméricas está presente. Variação nas intensidades relativas às diferentes concentrações é uma indicação da interconversão entre diferentes espécies oligoméricas que é dependentes da concentração de proteína. 
		Nota: Esta etapa de caracterização é fundamental para definir quais espécies são mais adequadas para a cristalização. Com efeito, monodispersas distintas espécies são mais propensas a cristalizar-se eles estão em um estado constante oligoméricos numa concentração definidas.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação de proteína e cristalização <ol><li>SEC Preparative <ol><li>após um volume de uma coluna de lavagem com água filtrada desgaseificada, equilibrar com SEC-buffer a coluna de filtração de gel de pré-embalados preparativa (120 mL de peso molecular uma variedade coluna).</li>
		<li>Injetar 15 mL de SBP purificado no 5-50 mg/mL para o volume de uma coluna coluna e fluxo da filtração do gel de equilibrada do SEC-buffer.</li>
		<li>Recolher a coluna de passagem em frações de 1 mL.</li>
		<li>Piscina as frações correspondentes a um pico único monodisperso; girar a amostra em filtros de centrifugação 15ml a 1.500 g e quantificar a concentração até se atingir a concentração desejada (normalmente de 50-100 mg/mL para SP0092).</li>
	</ol></li> <li>Cristalização <ol><li>determinar o intervalo de concentração ideal para o experimento de cristalização usando o teste de pré-cristalização conforme descrito pelo fabricante: <ol><li>Dispense 0,5 - 1,0 mL de cada um do teste da cristalização de quatro soluções em um reservatório diferente de uma sessão de 24-bem larga placa cristalização.</li>
			<li>Prepara as gotas de cristalização misturando 1 µ l de solução de proteína com 1 µ l de solução de reservatório, selar a placa e incubar à temperatura ambiente para não menos de 1 h (resultados mais confiáveis são obtidos após incubação durante a noite).</li>
			<li>Verificar a qualidade da gota para cada concentração, usando um microscópio de ampliação de 10x. 
			Nota: Testar a concentração da proteína diferente pelo menos três: (I) a maioria das gotas restantes clara indica que a proteína é demasiado diluída para cristalização; (II) a presença de precipitado pesado na maioria das gotas implica uma concentração demasiado elevada; e (III) uma equilibrada ocorrência de gotas claras e precipitado (melhor se luz) é uma boa indicação de que a concentração testada é favorável para cristalização.</li>
		</ol></li> <li>Preparar a queda de 96 poços sessão placas de cristalização; dispensar 100 µ l de solução de cristalização comerciais diferentes em cada reservatório bem 34 , 35 , 36 , 37.</li> <li>nL 100 dispensar da amostra de proteína na concentração definida anteriormente (etapa 1.1.6) em todos os poços de queda de cristalização usando um sistema robótico de cristalização.</li>
		<li>NL 100 dispensar do reservatório de diferentes soluções para a cristalização correspondente gota poços para misturar com proteína dispensada em passo 2.2.3. A placa de cristalização para evitar a evaporação e habilitar o equilibrio da gota cristalização com o reservatório do selo.</li>
		<li>Verificar as gotas periodicamente (inicialmente cada 1-2 dias, depois todas as semanas) usando um x 10 (pelo menos) microscópio de ampliação para avaliar o crescimento e a formação de cristais. 
		Nota: Um sistema automatizado de imagens para cristalização de proteínas pode ser usada para as gotas visualização e captura.</li>
	</ol></li></ol> < classe p = "jove_title "&gt; 3. Caracterização de cristal e coleta de dados de raio-x <ol><li>cristal montagem <ol><li>Prepare a solução crioprotetoras adicionando 25% (v/v) de glicerol (concentração final) à condição de cristalização (substituindo assim os 25% de água na inicial mistura) 38.</li>
		<li>Preencher uma espuma dewar com nitrogênio líquido e coloque a parte de compartimento de amostra de uma uni-puck no dewar. Deixe-a esfriar a temperatura do nitrogênio líquido.</li>
		<li>Corte e remover a vedação a fita da placa de cristalização durante a queda, onde os cristais são formados.</li>
		<li>Colocar uma gota de 1 µ l de solução crioprotetoras sobre um coverslide posicionado nas proximidades da gota alvo.</li>
		<li>Transferir o cristal selecionado da lista suspensa original para a gota de solução crioprotetoras usando um nylon cryo-loop sobre uma base de coluna padrão montada em uma varinha magnética 39 , 40.</li>
		<li>Rapidamente transferir o cristal da lista suspensa crioprotetoras para nitrogênio líquido, colocando o loop para a primeira posição vazia do porta-amostras uni-disco.</li>
		<li>Repita (desde o passo corte de fita da selagem) até que todos os cristais desejados são colhidos e armazenados no porta-amostras uni-disco.</li>
		<li>Lugar o uni-disco de base sobre o uni-disco usando a varinha de disco e leve o disco para a trajetória (sob condições de nitrogênio líquido). 
		Atenção: A temperatura extremamente baixa!</li>
		<li>Usar o cryo-pinça e o disco ferramenta de carregamento de dewar para carregar a uni-puck(s) para o robô de trocador de amostra beamline dewar. Porta-amostras uni-disco irá desanexar da base tampa deixando os titulares de laço de amostra na posição vertical no robô amostra dewar e assim exposto para o nitrogênio líquido e acessível para o robô de trocador de amostra.</li>
	</ol></li> <li>Caracterização de cristal Nota: os cristais colhidos em seguida podem ser rastreados para qualidade de difração usando ou uma fonte de raio-x do laboratório ou em uma fonte de raio x radiação síncrotron (SR). Beamlines macromolecular cristalografia (MX) fornecem uma fonte de energia ajustáveis para explorar difração anômala para solução de estrutura. Na seção a seguir, propõe-se uma série de instruções de trabalho, em consonância com os recursos experimentais de MX de fonte de luz de diamante de Luz Síncroton, mas estas orientações também podem ser adaptadas para MX de luz síncroton em outros os síncrotrons em todo o mundo.
	<ol><li>Como primeiro passo, é útil confirmar ou identificar anômala para disseminar no cristal. Isto pode ser conseguido convenientemente medindo um espectro de fluorescência de raio-x de cristal. Primeiro verifique se a energia do raio-x da trajetória está definida alta o suficiente para excitar todos os elementos que normalmente esperados para cristais macromoleculares (14 keV ou superior).</li>
		<li>Usar o software de controle de trajetória para selecionar a amostra a ser montado pelo robô trocador amostra; o loop será automaticamente centralizado no feixe de raios-x e a centralização de cristal pode ser confirmado usando manualmente o software de controle de trajetória.</li>
		<li>Gravar um espectro de fluorescência de raios-x usando o software de controle de trajetória: o usuário seleciona um tempo de exposição e inicia a medição (configuração do espectro de fluorescência/fluorescência, &#8594; executar, Figura 2A). O software de controle de trajetória automaticamente posiciona o raio-x, detector de fluorescência no lugar e determina o incidente mínimo fluxo de raio-x para obter um sinal legível sobre o detector de fluorescência. O espectro adquirido é então analisado em uma forma automatizada, com picos de emissão equipados de ocorrência natural elementos biológicos. Essas rotinas estão disponíveis em uma trajetória controle software interface gráfica do usuário (GUI) - GDA (www.opengda.org) em nossa empresa e os síncrotrons durante todo Europa 41 , 42.</li>
		<li>Se elementos adequados são identificados que podem ser exploradas por um experimento de difração anômala, executar uma verificação de energia de borda de absorção raio-x para determinar o comprimento de onda ideal para coleta de dados de difração anômala de cristal: sobre a trajetória software de controle, selecione o elemento e iniciar a digitalização (configuração de varredura de fluorescência/fluorescência, &#8594; nome de átomo, &#8594; executar, Figura 2B). 
		Nota: Para uma experiência única de difração anômala, o pico da borda de absorção é usado para maximizar a dispersão anômala. Considerações experimentais para a realização de um experimento de difração anômala de onda multi tem sido anteriormente detalhada 43.</li>
		<li>Para determinar os parâmetros de célula unidade cristal, simetria e limite de difração, mede três padrões de difração de raios x em intervalos de 45°, utilizando o método de oscilação (coleta de dados/triagem &#8594; executar atual, Figura 2). O software de controle de trajetória fornece o usuário com uma escolha de ângulo de oscilação e tempo de exposição e a capacidade de definir a porcentagem de transmissão do feixe de raios-x. Para um rastreio padrão cristal, um ângulo de oscilação de 0,5 °, um tempo de exposição de 0,5 s e 5% transmissão de feixe de raios-x são recomendados. As imagens de difração medido são automaticamente analisadas pelo pipeline EDNA e retornar um conjunto de estratégias para a coleção de um conjunto de dados completo 22.</li>
	</ol></li> <li>Raio x coleta de dados Nota: O usuário pode selecionar para coletar dados em modo de oscilação padrão ou feixe inversa, que permite que os companheiros de Friedel ser gravado perto no tempo e dose de raios-x e com aproximadamente o mesmo comportamento de absorção permitindo uma medição mais precisa das diferenças anômalas. O último é útil especialmente se esperam-se pequenas diferenças anômalas e/ou as amostras são radiação sensível ao realizar um experimento de difração anômala. Considerações sobre as melhores estratégias de coleta de dados para usar foram exaustivamente analisados 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. <ol><li>usando o software de controle de trajetória, importe os parâmetros de coleta de dados como sugerido pelo programa de estratégia que irá fornecer: i. Iniciar posição do eixo de rotação ω ii. Largura de oscilação de rotação do eixo ω ângulo para cada imagem de difração iii. Tempo de exposição para cada imagem de difração iv. Número de imagens para um conjunto de dados completo (indiretamente definindo o ângulo de rotação total ω-eixo para a coleta de dados inteira) v. percentagem de atenuação do feixe de raios-x para evitar excesso de exposição e radiação danos Nota: em nossa instituição, para executando a coleta de dados, os encanamentos de software para processamento automatizado dos dados recolhidos estão bem estabelecidos: dados (i) a difração são reduzidos (indexado, integrada e dimensionado) pelo pipeline xia2, que gera arquivos de mtz de reflexão para o usuário como entrada para eliminação e estrutura de solução/refinamento 48. (ii) quando um significativo sinal anômalo é detectado durante a análise de dados, um primeira estrutura automatizada rápida solução pipeline (fast_ep) usando SHELX tenta resolver a subestrutura do átomo pesado por experimental gradual, fornecendo um mapa de densidade de elétrons em fases sempre que possível. Um segundo mineroduto de solução mais abrangente estrutura compromete-se automaticamente tenta resolver e construir o structuestiver usando software independente suites 49 , 50 ,, 51 , 52; em casos onde é bem sucedido, o usuário será fornecido com um mapa de densidade modelo e elétron inicial. Isso fornece a base para o usuário completar o requinte e validar o modelo com os pacotes de software cristalográficas de escolha.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, descrevemos e validar um protocolo integrado para Caracterização bioquímica e estrutural de carboidratos apresentação com uma ênfase específica em proteínas de S. pneumoniae. No entanto, isto pode ser usado como um procedimento padrão para a análise de outra a partir de organismos diferentes e até mesmo outras proteínas solúveis não relacionadas.
A primeira parte do protocolo está focada em fornecer informações bioquímicas na estabilidade da proteína e estrutura quaternária, que pode ser explorada na preparação de amostras da proteína para cristalização. Na seção ensaios térmicos turno, descrevemos apenas o pH e as variações de concentração de NaCl para manter a natureza geral deste procedimento. Apesar disso, muitas outras condições do tampão podem ser testadas de forma semelhante, por exemplo, incluindo qualquer composto químico utilizado como aditivo estabilizador: em particular, a ligand(s) real que ligam para um específico SBP é notavelmente eficaz em aumentar a Tm por alguns graus Celsius31. Em alguns casos, as curvas de desnaturação podem ser mal definidas devido ao baixo sinal ou um fundo de fluorescência de alta, que é causado pela agregação de proteínas ou desdobramento parcial. Para evitar isso, uma titulação de proteína: tintura pode ser realizada para otimizar as curvas de desnaturação pouco claras. Se nenhuma melhoria é obtida, triagem de vários aditivos que podem melhorar a estabilidade da proteína é aconselhável, e telas adequadas tem sido descrito anteriormente54.
Normalmente, a maioria é monomérica em seu ambiente natural, mas como mostrado aqui multimerization pode ocorrer nas altas concentrações utilizadas em experimentos de cristalização, assim é a caracterização do comportamento de oligomerização fornecida por MALS e SEC essencial para avaliar o estado de oligomerização monodisperso estável mais favorável para a cristalização. No entanto, é difícil prever o efeito de diferentes produtos químicos incluídos na condição de cristalização no comportamento de oligomerização das proteínas. Se o exame da SEC e MALS mostra extensa agregação da amostra da proteína, recomendamos o seguinte para reduzir a probabilidade disso acontecer: usar amostra de proteína fresca (não congelar-descongelada) e expandir a análise de estabilização realizada com térmico ensaios, testes possíveis aditivos e detergentes suaves como um último recurso, para minimizar a agregação de turno. Neste trabalho, apresentamos as diretrizes básicas para cristalização com rastreio de cristalização comercial de matriz esparsa de alta produtividade para manter a natureza geral do presente protocolo. No entanto, a obtenção de cristais de proteína de difração de raios x de alta resolução pode precisar iterativo de ajuste fino para otimizar as condições de cristalização em relação a concentração precipitant, pH, adição de aditivos químicos, temperaturas diferentes, e outros fatores de mudança dinâmica de equilíbrio entre o cristal gota e reservatório16,17.
A segunda parte do protocolo descreve a caracterização os cristais de proteínas a fim de definir a melhor estratégia para coleta de dados de difração de raios x com um foco específico sobre a aquisição de dados anômalos para fase triste. Mesmo se a manter uma arquitetura geral semelhante (e existem muitas estruturas 3D depositadas potencialmente utilizável como modelos de partida), eliminação destas proteínas pelo método de substituição molecular não é sempre simples por causa da variabilidade do elementos de estrutura secundária e a flexibilidade intrínseca destas proteínas. Assim, propomos o método triste e destacar que estas proteínas podem já ter intrinsecamente ligado metais ou fato inespecificas de metais das condições de reserva de cristalização, que podem fornecer uma gama de elementos diffracting anômalas como um passo padrão em nosso protocolo geral.
Em conclusão, este protocolo define um padrão de fluxo de trabalho guiado de procedimentos que permitam a descrição detalhada das características bioquímicas e estruturais que pode ser explorada para aumentar a taxa de sucesso de determinação de estrutura, bem como acelerar a caracterização estrutural de apresentação em geral.

S. pneumoniae (pneumococo) é uma bactéria Gram-positiva que residem assintomaticamente em vias aéreas superiores do trato respiratório humano com a capacidade de migrar para nichos normalmente estéril causando otite média, pneumonia, sepse, septicemia, e meningite,1,2. Além disso, a infecção pneumocócica é a principal causa de pneumonia adquirida na Comunidade, que contribui para um fardo clínico e económico mundial3,4. Cepas resistentes aos antibióticos de S. pneumoniae espalharam-se pelo globo e embora um sete-valente e a vacina conjugada de proteína pneumocócica 13-valente ajudaram a reduzem a taxa de resistência aos antimicrobianos, variedades de substituição da uso de vacina surgiram e levaram a demanda crescente de investigação para o desenvolvimento de novos tratamentos para a doença pneumocócica5,6,7,8.
O pneumococo depende de açúcares importados de host como um carbono fonte9,10; com efeito, que dedica 30% de seu maquinário de importação para o transporte de carboidratos diferentes 3211,12,13. Estes importadores incluem pelo menos oito transportadores ABC13. Em transportadores ABC, a extracelular a desempenhar um papel fundamental na determinação da especificidade para o ligante e apresentá-lo para o transportador de integral de membrana para a absorção na célula. A representa os alvos válidos para a concepção de novas vacinas e antimicrobianos porque eles são proteínas de superfície e seu papel vital em processos celulares.
Caracterização de proteína alvo e descrição detalhada das características estruturais, como ligante bolsos e flexibilidade entre domínios, fornecem uma ferramenta útil para desenho de drogas baseada em estrutura14,15. Cristalografia de raios x é o método de escolha para a caracterização estrutural de proteínas em perto de resolução atômica, mas o processo de cristalização é imprevisível, demorado e não sempre bem sucedido. Métodos sistemáticos têm melhorado a taxa de sucesso e fatores importantes são a qualidade da amostra e a estabilidade. A taxa de sucesso de cristalização é influenciada pelas propriedades químicas de proteína e metodologia de preparação de amostra. O efeito destes pode ser avaliado e informado pela caracterização bioquímica16,17.
Uma outra complicação para design baseado em estrutura é o problema de fase cristalográfica, que deve ser abordado. Como estruturas de proteína mais se tornaram disponíveis, muitas estruturas podem ser resolvidas pelo método de substituição molecular, que exige uma estrutura homóloga18. Como a apresenta uma estrutura de domínio flexível, substituição molecular também pode revelar-se desafiador19. Se um modelo estrutural que é suficientemente semelhante à proteína alvo não estiver disponível, um número de técnicas pode ser usado para obter a progressiva experimental20. Entre estes, o método de dispersão anômala Single-comprimento de onda (SAD) surgiu como a principal técnica e tem sido extensivamente usado para resolver o problema de fase21. O uso do método triste tem sido ainda mais avançado com melhorias em hardware e software, bem como estratégias de coleta de dados para permitir a detecção e o uso de sinais fracos de anômalos para eliminação gradual de22,23, 24. Além disso, avanços em métodos diretos para solução de estruturas de macromoléculas, que, no passado, necessários dados de difração de resolução atômica, agora pode ser utilizado, por exemplo, combinando conhecimento estereoquímica conforme implementado no programa ARCIMOLDO25. Um recurso útil de métodos para resolver o problema da fase em cristalografia é dada por Taylor26.
Aqui nós apresentamos um protocolo Racionalizado para a caracterização do transporte de carboidratos SBP, SP0092 de S. pneumoniae, integrar técnicas bioquímicas e estruturais (Figura 1). Este protocolo passo a passo fornece um exemplo útil caso de teste de estratégias para melhorar a taxa de sucesso de estudos estruturais na apresentação, em geral, que são encontrados em todos os reinos da vida. Em particular, o protocolo destaca a importância de caracterizar o estado oligoméricos mais estável da proteína em solução em um método rápido e eficaz e permite a identificação das melhores espécies para acompanhar para experimentos de cristalização. Embora existam mais de 500 estruturas SBP relatadas na Protein Data Bank27, substituição molecular pode ser um desafio devido à natureza flexível inerente as dois domínios α/β, que são ligadas por uma dobradiça região19. Assim, a segunda parte do protocolo descreve como usar o método triste para eliminação de íons metálicos acoplados, que é comum na apresentação, bem como a incorporação de selenometionina e uso do selênio (Se) na fase triste.

<table><tbody><tr><td>Meio de selenometionina Dimensões moleculares completas</td><td></td><td>MD12-500</td><td>Baseado em um meio mínimo M9 sintético suplementado com glicose, vitaminas e aminoácidos, com exceção da L-metionina. Outros produtos equivalentes estão disponíveis comercialmente por outras empresas.</td></tr><tr><td>Placa óptica de 96 poços MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>A placa de reação óptica de 96 poços MicroAmp da Applied Biosystems com código de barras é otimizada para fornecer precisão e uniformidade de temperatura incomparáveis para amplificação de PCR rápida e eficiente. Esta placa, construída a partir de uma única peça rígida de polipropileno em um formato de 96 poços, é compatível com a Applied Biosystems&reg; Sistemas de PCR em tempo real de 96 poços e termocicladores.</td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td> <td>Laranja SYPRO</td><td>S6651</td><td>A Mancha de Gel de Proteína Laranja SYPRO é uma mancha fluorescente sensível e pronta para uso para proteínas em géis 1D. Corante proteico bastante universal e bem estabelecido para regiões hidrofóbicas.</td></tr><tr><td>Filme adesivo óptico MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>O filme adesivo óptico MicroAmp da Applied Biosystems reduz a chance de contaminação poço a poço e evaporação da amostra quando aplicado a uma microplaca. É ideal para medição óptica, pois fornece baixo fundo.</td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real rápido 7500</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>O sistema de PCR em tempo real rápido 7500 da Applied Biosystems permite ciclos térmicos de alta velocidade no formato padrão de 96 poços, reduzindo significativamente o tempo de execução para aplicações quantitativas de PCR em tempo real, fornecendo resultados em cerca de 30 minutos. O Kit de Atualização está disponível para atualizar um sistema PCR em tempo real 7500 padrão para a Configuração Rápida por meio de uma instalação de serviço de campo. Outra máquina RT-PCR pode ser usada. A exportação de dados não é fácil para o antigo software de análise de dados.</td></tr><tr><td>Coluna Superdex 200 increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL é uma coluna versátil e pré-embalada para cromatografia de exclusão de tamanho em purificação preparativa em pequena escala (mg), bem como para caracterização e análise de proteínas com pesos moleculares entre 10.000 e 600.000, como anticorpos. Separação ideal ideal para técnicas biofísicas de alta resolução.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>O DAWN HELEOS II é o principal detector de espalhamento de luz estático multiângulo (MALS) para caracterização absoluta da massa molar e tamanho de macromoléculas e nanopartículas em solução. O DAWN oferece a mais alta sensibilidade, a mais ampla faixa de peso molecular, tamanho e concentração e a maior seleção de configurações e módulos opcionais para capacidades aprimoradas. Outros sistemas de detecção de MALS de outras empresas além da Wyatt não foram testados, portanto, nenhum feedback adicional pode ser fornecido.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200 são colunas de cromatografia de exclusão de tamanho pré-embaladas para separações preparativas e analíticas de biomoléculas de alta resolução em pequena escala. O Superdex 200 tem uma faixa de separação para moléculas com pesos moleculares entre 10.000 e 600.000. A separação de picos não é tão ideal quanto para a versão "aumento", mas este modelo é ideal para o uso diário padrão.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade são colunas XK pré-embaladas projetadas para cromatografia de filtração em gel preparativa de alta resolução.</td></tr><tr><td>Placa de cristalização de gota sentada "grande" de 24 poços</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>A placa de cristalização "grande" de 24 poços é usada principalmente para triagem de cristais de proteínas por técnicas de difusão de vapor de gota sentada e para otimização da condição de cristalização. Possui reservatório bastante grande e recipiente de amostra, o que favorece o manuseio manual e o crescimento de cristais de proteína de grande porte. Além disso, suas superfícies planas podem ser facilmente seladas com fita transparente ou lamínulas.</td></tr><tr><td>Teste de pré-cristalização PCT</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>O teste de pré-cristalização PCT é usado para determinar a concentração de proteína apropriada para triagem de cristalização.</td></tr><tr><td>96 Poços CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>As placas de poços quadrados têm três poços de cristalização por reservatório, possibilitando testar 288 amostras por placa. Geralmente usado apenas para a triagem inicial porque sua borda quadrada dificulta a pesca de cristais.</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD7-601</td><td>O Universal V1-Puck (Uni-puck) é um recipiente de armazenamento e envio de pinos de amostra para uso com a maioria dos sistemas automatizados de montagem de amostras em todo o mundo - inclui os sistemas ACTOR, SAM e CATS entre outros (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI e em todos os EUA)</td></tr> <tr><td>Espuma Padrão Dewar</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD7-35</td><td>5,7" de diâmetro por 2,8" de profundidade. Capacidade de 800mL.</td></tr><tr><td>CryoLoop montado - 20 mícrons</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>CryoLoops montados com nylon de 20 mícrons de diâmetro. Estes laços de nylon são ligados a MicroTubos de aço inoxidável ocos&trade; que são usados para montar, congelar e proteger o cristal durante procedimentos criocristalográficos e coleta de dados de raios-X. Existem diferentes tamanhos e podem ser adaptados em comprimento. São ferramentas bastante versáteis.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de carregamento de disco de dewar</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD7-607</td><td>Esta ferramenta é usada para separar uni-pucks para carregá-los no robô dewar. Consiste em duas peças: uma parte do tubo de Teflon e uma parte da haste de metal.</td></tr></tbody></table>

caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-sp0092

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos e de vacinas para Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são necessárias para deter a ascensão rápida em cepas resistentes de múltiplas. Proteínas de ligação de substrato de carboidratos (a) representam metas viáveis para o desenvolvimento de vacinas à base de proteínas e novos agentes antimicrobianos devido à sua localização extracelular e a centralidade da importação de hidrato de carbono para o metabolismo pneumocócica, respectivamente. Descrito aqui é um protocolo integrado Racionalizado para realizar uma caracterização abrangente de SP0092, que pode ser estendido para outros hidratos de carbono a partir do pneumococo e outras bactérias. Este procedimento pode ajudar o design baseado em estrutura de inibidores para esta classe de proteínas. Apresentado na primeira parte deste manuscrito são protocolos para análise bioquímica, por meio de ensaio térmico turno, multi ângulo de espalhamento de luz (MALS) e cromatografia de exclusão (SEC), do tamanho que otimizam a estabilidade e homogeneidade da amostra direcionado para ensaios de cristalização e assim aumentar a probabilidade de sucesso. A segunda parte deste procedimento descreve a caracterização dos cristais SBP usando uma trajetória de síncrotron de difração anômala ajustáveis, comprimento de onda e protocolos de coleta de dados para dados de medição que podem ser usados para resolver a proteína cristalizada estrutura.

Este protocolo integrado provou-se ser bem sucedido com quatro (dois publicados e dois inéditos estruturas) de carboidratos seis objectivos de proteína vinculativos de pneumococo analisaram até à data,32,53. Nesta seção, apresentamos a caracterização bioquímica e estrutural de SP0092 como resultado representativo para orientar estudos estruturais da apresentação em geral.
Após o SP0092 SBP foi expressa e purificado conforme definido anteriormente32, a proteína purificada foi analisada para estabilidade de buffer usando um ensaio de mudança térmica: SP0092 exibe um aumento Tm em pH 6,5 e na presença de NaCl no 0 - 0,2 M intervalo de concentração (Figura 3A). Neste contexto, a solução-tampão para as etapas a seguir foi definida como: pH MES de 0,02 M 6.5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glicerol, 0.5 mM TCEP. Absoluta é a massa molar dos Estados diferentes oligomerização de SP0092 foi medida por MALS acoplado ao SEC medir um peso molecular de 187.2, 140.8, 97.0 e 49.4 kDa, correspondente à espécie tetramérica, trimeric, dimérica e monomérico, respectivamente ( Figura 3B). A análise do perfil do SEC em diluições diferentes proteínas revelou que a oligomerização é desencadeada pela concentração de proteína aumentada, sugerindo que os oligómeros maiores são mais estáveis em concentrações mais elevadas do que costuma ser usada no cristalização. Com efeito, as espécies oligoméricas maiores purificadas direcionado para ensaios de cristalização, cristais de proteína com sucesso produzido enquanto o monómero de espécies que não.
O otimizado cristais obtidos do nativo e metionina-Se rotulado de formas de SP0092 foram caracterizadas por difração de raios x. Medição da fluorescência de raio-x destes cristais revelou em ambos os casos picos de emissão para o Zn, sendo ligado à proteína, enquanto Se foi detectado apenas para os cristais de metionina-Se conforme o esperado. Mais tarde, exames de absorção de raio-x nas bordas Se e Zn foram realizadas, que forneceu dados experimentais diretos para ajustar o comprimento de onda do raio x incidente às respectivas bordas raio x absorção de Zn ou Se apresentam os cristais para maximizar o sinal anômalo obtidos a partir dos dados resultantes (Figura 4A–B).
Depois de medir três padrões de difração na baixa transmissão, obteve-se um conjunto completo de dados anômalo usando a estratégia de coleta de dados sugerida por EDNA (Figura 4). O sinal anômalo presente aciona o pipeline progressiva automatizado para a trajetória para determinar a estrutura da sub, e baseado em fases iniciais experimentais derivadas, produz inicial mapas e modelos, que podem ser refinados e validados (Figura 4 ).
Em resumo, possíveis armadilhas da técnica estão centradas principalmente na qualidade e disponibilidade de cristal. Otimização das condições de reserva, para melhorar a estabilidade da proteína, bem como a identificação do estado oligoméricas mais adequada da proteína para usar, quando mais do que um oligómero é identificado em solução, pode reduzir o risco de falha para a cristalização palco. Explorar o uso de íons metálicos acoplados identificadas numa fase precoce pode acelerar a solução da estrutura e evitar a produção desnecessária de selenometionina rotulada proteína quando métodos de substituição molecular falharem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Figura 1. Diagrama de fluxo de trabalho para a caracterização bioquímica e estrutural de carboidratos a. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Figura 2. Caracterização de cristal em GDA. (A) Screenshot da guia de controle fluorescência de raio-x do software de controle de trajetória GDA. (B) imagem de raio-x energia borda-digitalização controle guia no GDA. (C) Screenshot da coleção cristal triagem guia dados no GDA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Figura 3. Caracterização bioquímica de SP009239-491. Gráfico de superfície 3D (A) plotar a temperatura de fusão de SP009239-491 como uma função do pH e da concentração de NaCl da solução-tampão. (B) s e MALS resultados para SP009239-491. Absorção em 280 nm é mostrado em azul. As massas molares dos Estados oligomerização diferentes são mostradas em vermelho. Painel (B) foi modificado de32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Figura 4. Caracterização estrutural de SP009239-491. (A) e energia de absorção de raios-x (B) varredura na borda para SP009239-491 cristais Zn e Se. A fluorescência medida do Zn e Se contendo cristais é mostrada em azul e ciano, o calculado f' e f "dispersão anômala frações são em verde e vermelho, respectivamente. (C) exemplos de padrões de difração de raios x coletados de cristais de SP009239-491 . (D) Cartoon representação da estrutura de dímero de SP009239-491 . Um protomer é colorido branco e o magenta (resíduos 39-366) e violeta (resíduos 367-491), e os átomos de dispersão anômala são mostrados como bolas azuis e ciana para Zn e Se, respectivamente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 M ácido cítrico pH 4.0</td>
			<td>0,1 M ácido cítrico pH 4.5</td>
			<td>0,1 pH de fosfato M 5.0</td>
			<td>0.1 pH de citrato de M 5.5</td>
			<td>0,1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0,1 M pH de ADA 6.5</td>
			<td>0,1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0,1 M pH HEPES 7.5</td>
			<td>0.1 pH 8.0 do Imidazole de M</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M pH CHES 9</td>
			<td>0,1 M pH CHES 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0,1 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,5 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
	

Tabela 1. Composição de tampão para ensaio térmico de turno.

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

O objetivo geral deste procedimento é a caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação ao substrato de carboidratos de Streptococcus pneumoniae. Este método pode ajudar a fornecer dados importantes para auxiliar estudos instrucionais de proteínas de ligação ao substrato, como a identificação dos perfis de estabilidade do tampão, estados de oligomerização e estruturas atômicas. As vantagens desse procedimento é que ele fornece dados que podem aumentar a taxa de sucesso da cristalização e estruturar a solução para proteínas de ligação ao substrato de maneira robusta e direta.Primeiro, prepare 48 soluções tampão com uma faixa de pH de 4,0 a 9,5 e concentrações de cloreto de sódio variando de zero a 0,5 molar. Dispense 40 microlitros de cada solução em uma placa de 96 poços. Obtenha uma solução purificada da proteína de ligação ao substrato escolhida.Adicione cinco microlitros da solução SBP a cada poço para uma concentração de um a dois miligramas por mililitro. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma mancha fluorescente concentrada 20 vezes a cada poço. Misture as soluções pipetando para cima e para baixo.Sele a placa com filme adesivo transparente. Centrifugar a placa a 112 vezes G à temperatura ambiente durante dois minutos. Configure um sistema de PCR em tempo real para aumentar de quatro a 99 graus Celsius a uma taxa de três graus por minuto com um tempo de espera de 10 segundos.Configure o sistema para fazer leituras de fluorescência a cada meio grau. Defina a configuração do filtro de fluorescência. e atribua as amostras.Execute o experimento e identifique a condição de buffer com a temperatura de fusão mais alta. Em seguida, prepare um tampão com o pH escolhido e a concentração de cloreto de sódio que inclua 2,5% em volume de glicerol e uma concentração de TCEP de 0,5 milimolar. Caracterize o SBP purificado com cromatografia analítica de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangular.Identifique as espécies mais estáveis adequadas para cristalização e use SEC preparatório para obter frações puras dessas espécies. Realize testes de pré-cristalização para determinar a concentração ideal de proteína para cristalização. Use um sistema robótico de cristalização para dispensar as soluções de cristalização comerciais desejadas nos reservatórios de solução de uma placa de queda óptica de 96 poços.Em seguida, use o sistema para dispensar 100 nanolitros da solução de proteína em cada poço de gota de cristalização. Transfira 100 nanolitros de cada solução de cristalização dos poços do reservatório para as gotas de poço correspondentes. Sele a placa com filme adesivo óptico.Use um microscópio ou um sistema de imagem automatizado para avaliar a formação e o crescimento de cristais a cada um ou dois dias durante duas semanas e, posteriormente, uma vez por semana. Quando cristais suficientemente grandes e bem formados se formarem, prepare um lote da solução de cristalização com um adicional de 25% em volume de glicerol para servir como crioprotetor. Em seguida, encha um dewar de espuma com nitrogênio líquido.Mergulhe um invólucro de amostra unipuck no nitrogênio líquido e deixe o invólucro esfriar. Em seguida, corte o filme sobre uma gota contendo um cristal de interesse. Deposite 0,5 microlitros do crioprotetor em uma lâmina de cobertura próxima à gota ou na câmara de gota vazia da mesma condição, se disponível.Conecte a uma varinha magnética um cryoloop montado em uma base padrão SPINE. Use o cryoloop para transferir o cristal de interesse para a gota de crioprotetor. Em seguida, use o cryoloop para transferir o cristal do crioprotetor para a primeira posição vazia do invólucro de amostra unipuck submerso.Repita este processo para colher cristais adicionais. Depois que todos os cristais de interesse forem carregados no compartimento de amostra, use a haste do disco para colocar a placa de base do unidisco no gabinete. Transporte o unipuck em nitrogênio líquido para a linha de luz.Use pinças criogênicas e uma ferramenta de carregamento de disco para carregar o unipuck no trocador de amostras da linha de luz e para separar o invólucro da amostra. Em seguida, selecione a amostra no software da linha de luz para carregar e centralizar automaticamente a amostra no feixe de raios X. Adquira um espectro fluorescente de raios-x e identifique quaisquer elementos que possam ser usados em um experimento de difração anômala.Determine o comprimento de onda ideal para coletar dados de difração anômala realizando uma varredura de energia de borda de absorção de raios-x. Em seguida, adquira três padrões de difração de raios-x em intervalos de 45 graus no modo de oscilação padrão para determinar automaticamente os parâmetros da célula unitária cristalina, simetria e limite de difração. Importe os parâmetros de coleta de dados recomendados para o software da linha de luz e execute um experimento de difração anômala de comprimento de onda único ou múltiplo, conforme apropriado.A estabilidade da proteína de ligação ao substrato SP0092 em vários tampões de sal foi avaliada para identificar a solução tampão ideal. As maiores temperaturas de fusão foram encontradas para tampões com pH de 6,5 e concentrações de cloreto de sódio variando de zero a 0,2 molar. Um tampão com pH de 6,5 e concentração de cloreto de sódio de 0,2 molar foi selecionado para o procedimento.Os vários estados de oligomerização de SP0092 foram identificados e separados com SEC-MALS. Uma análise do perfil SEC em diferentes concentrações de proteína indicou que o aumento da concentração de proteína desencadeia oligomerização, sugerindo que oligômeros maiores são mais estáveis em altas concentrações. Consistente com isso, os grandes oligômeros produziram cristais em testes de cristalização, enquanto o monômero não.A fluorescência de raios-X de cristais SP0092 nativos e marcados com selenometionina indicou zinco ligado à proteína em ambas as formas. O sinal anômalo foi maximizado ajustando o comprimento de onda de raios-x incidente para as bordas de absorção de raios-x de zinco ou selênio. Um conjunto de dados anômalo completo foi então obtido e a análise automatizada desencadeada pela presença de um sinal anômalo gerou mapas iniciais das estruturas das proteínas.Os modelos incorporados a esses mapas iniciais foram então refinados e validados para produzir os modelos finais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como concluir uma caracterização estrutural abrangente de uma proteína de ligação ao substrato ou de qualquer alvo de proteína em potencial. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de novas terapias para doenças mirocócicas, pois fornece insights fundamentais para o design baseado em estrutura de inibidores para essa classe de proteínas.Esses métodos também podem ser aplicados a proteínas de ligação ao substrato de outros organismos e potencialmente podem ser usados para qualquer tipo de proteína.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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