Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

O objetivo geral deste procedimento é a caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação ao substrato de carboidratos de Streptococcus pneumoniae. Este método pode ajudar a fornecer dados importantes para auxiliar estudos instrucionais de proteínas de ligação ao substrato, como a identificação dos perfis de estabilidade do tampão, estados de oligomerização e estruturas atômicas. As vantagens desse procedimento é que ele fornece dados que podem aumentar a taxa de sucesso da cristalização e estruturar a solução para proteínas de ligação ao substrato de maneira robusta e direta.

Primeiro, prepare 48 soluções tampão com uma faixa de pH de 4,0 a 9,5 e concentrações de cloreto de sódio variando de zero a 0,5 molar. Dispense 40 microlitros de cada solução em uma placa de 96 poços. Obtenha uma solução purificada da proteína de ligação ao substrato escolhida.

Adicione cinco microlitros da solução SBP a cada poço para uma concentração de um a dois miligramas por mililitro. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma mancha fluorescente concentrada 20 vezes a cada poço. Misture as soluções pipetando para cima e para baixo.

Sele a placa com filme adesivo transparente. Centrifugar a placa a 112 vezes G à temperatura ambiente durante dois minutos. Configure um sistema de PCR em tempo real para aumentar de quatro a 99 graus Celsius a uma taxa de três graus por minuto com um tempo de espera de 10 segundos.

Configure o sistema para fazer leituras de fluorescência a cada meio grau. Defina a configuração do filtro de fluorescência. e atribua as amostras.

Execute o experimento e identifique a condição de buffer com a temperatura de fusão mais alta. Em seguida, prepare um tampão com o pH escolhido e a concentração de cloreto de sódio que inclua 2,5% em volume de glicerol e uma concentração de TCEP de 0,5 milimolar. Caracterize o SBP purificado com cromatografia analítica de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangular.

Identifique as espécies mais estáveis adequadas para cristalização e use SEC preparatório para obter frações puras dessas espécies. Realize testes de pré-cristalização para determinar a concentração ideal de proteína para cristalização. Use um sistema robótico de cristalização para dispensar as soluções de cristalização comerciais desejadas nos reservatórios de solução de uma placa de queda óptica de 96 poços.

Em seguida, use o sistema para dispensar 100 nanolitros da solução de proteína em cada poço de gota de cristalização. Transfira 100 nanolitros de cada solução de cristalização dos poços do reservatório para as gotas de poço correspondentes. Sele a placa com filme adesivo óptico.

Use um microscópio ou um sistema de imagem automatizado para avaliar a formação e o crescimento de cristais a cada um ou dois dias durante duas semanas e, posteriormente, uma vez por semana. Quando cristais suficientemente grandes e bem formados se formarem, prepare um lote da solução de cristalização com um adicional de 25% em volume de glicerol para servir como crioprotetor. Em seguida, encha um dewar de espuma com nitrogênio líquido.

Mergulhe um invólucro de amostra unipuck no nitrogênio líquido e deixe o invólucro esfriar. Em seguida, corte o filme sobre uma gota contendo um cristal de interesse. Deposite 0,5 microlitros do crioprotetor em uma lâmina de cobertura próxima à gota ou na câmara de gota vazia da mesma condição, se disponível.

Conecte a uma varinha magnética um cryoloop montado em uma base padrão SPINE. Use o cryoloop para transferir o cristal de interesse para a gota de crioprotetor. Em seguida, use o cryoloop para transferir o cristal do crioprotetor para a primeira posição vazia do invólucro de amostra unipuck submerso.

Repita este processo para colher cristais adicionais. Depois que todos os cristais de interesse forem carregados no compartimento de amostra, use a haste do disco para colocar a placa de base do unidisco no gabinete. Transporte o unipuck em nitrogênio líquido para a linha de luz.

Use pinças criogênicas e uma ferramenta de carregamento de disco para carregar o unipuck no trocador de amostras da linha de luz e para separar o invólucro da amostra. Em seguida, selecione a amostra no software da linha de luz para carregar e centralizar automaticamente a amostra no feixe de raios X. Adquira um espectro fluorescente de raios-x e identifique quaisquer elementos que possam ser usados em um experimento de difração anômala.

Determine o comprimento de onda ideal para coletar dados de difração anômala realizando uma varredura de energia de borda de absorção de raios-x. Em seguida, adquira três padrões de difração de raios-x em intervalos de 45 graus no modo de oscilação padrão para determinar automaticamente os parâmetros da célula unitária cristalina, simetria e limite de difração. Importe os parâmetros de coleta de dados recomendados para o software da linha de luz e execute um experimento de difração anômala de comprimento de onda único ou múltiplo, conforme apropriado.

A estabilidade da proteína de ligação ao substrato SP0092 em vários tampões de sal foi avaliada para identificar a solução tampão ideal. As maiores temperaturas de fusão foram encontradas para tampões com pH de 6,5 e concentrações de cloreto de sódio variando de zero a 0,2 molar. Um tampão com pH de 6,5 e concentração de cloreto de sódio de 0,2 molar foi selecionado para o procedimento.

Os vários estados de oligomerização de SP0092 foram identificados e separados com SEC-MALS. Uma análise do perfil SEC em diferentes concentrações de proteína indicou que o aumento da concentração de proteína desencadeia oligomerização, sugerindo que oligômeros maiores são mais estáveis em altas concentrações. Consistente com isso, os grandes oligômeros produziram cristais em testes de cristalização, enquanto o monômero não.

fluorescência de raios-X de cristais SP0092 nativos e marcados com selenometionina indicou zinco ligado à proteína em ambas as formas. O sinal anômalo foi maximizado ajustando o comprimento de onda de raios-x incidente para as bordas de absorção de raios-x de zinco ou selênio. Um conjunto de dados anômalo completo foi então obtido e a análise automatizada desencadeada pela presença de um sinal anômalo gerou mapas iniciais das estruturas das proteínas.

Os modelos incorporados a esses mapas iniciais foram então refinados e validados para produzir os modelos finais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como concluir uma caracterização estrutural abrangente de uma proteína de ligação ao substrato ou de qualquer alvo de proteína em potencial. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de novas terapias para doenças mirocócicas, pois fornece insights fundamentais para o design baseado em estrutura de inibidores para essa classe de proteínas.

Esses métodos também podem ser aplicados a proteínas de ligação ao substrato de outros organismos e potencialmente podem ser usados para qualquer tipo de proteína.