Avaliação dos efeitos endócrinos compostos no desenvolvimento da função de vertebrados Rede Neural utilizando eletrodos multi matrizes

O objetivo geral deste protocolo experimental é testar os efeitos de compostos desreguladores endócrinos, como os bisfenóis, na atividade de pico de rede de redes neuronais de vertebrados estabelecidas em matrizes de múltiplos eletrodos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em neurobiologia do desenvolvimento e toxicologia ambiental, como o mecanismo de ação de toxinas ambientais no desenvolvimento da atividade da rede no cérebro embrionário. A principal vantagem dessa técnica é que os efeitos nos parâmetros da rede neuronal, como a taxa média de disparo, o número total de picos e a amplitude do pico, bem como a sincronia, agora podem ser estudados.

Nosso estudo anterior mostrou que os EDCs afetam a palavra e o comportamento, que é uma saída direta das redes neuronais, e nosso protocolo agora visa entender o efeito dos EDCs nessas redes. No dia do revestimento dos neurônios, remova um frasco de matriz extracelular do freezer de 20 graus Celsius negativos, borrife com etanol a 70% e coloque no gelo. Certifique-se de descongelar a matriz extracelular no gelo.

Não descongele à temperatura ambiente, pois o ECM polimeriza acima de zero graus Celsius. Trabalhe no capô BSL2 para diluir a matriz extracelular para 25% adicionando 300 microlitros de meio neurobasal frio à alíquota de 100 microlitros. Em seguida, use uma pipeta P200 para adicionar 100 microlitros de solução de matriz extracelular a 25% ao centro do conjunto de múltiplos eletrodos, tomando cuidado para não tocar nos eletrodos.

Remova imediatamente o ECM deixando uma película fina na superfície. Cubra a matriz de vários eletrodos e coloque na incubadora de cultura de tecidos até que esteja pronto para colocar os neurônios na placa. Comece o isolamento do neurônio do pintinho esterilizando a casca externa de um ovo E7 com 70% de etanol.

É importante manter condições estéreis a partir deste ponto. Certifique-se de que todos os instrumentos sejam esterilizados com etanol a 70% e que as soluções sejam estéreis. É útil usar uma capa de dissecação, mas não é absolutamente necessária para dissecções se for realizada rapidamente.

Então, depois de recuperar e decapitar o embrião, corte ao redor dos olhos e remova os globos oculares. Em seguida, use uma pinça fina Dumont número cinco e uma tesoura de mola para fazer uma incisão no lado ventral e remova as camadas externas da pele para expor o prosencéfalo e o tecto óptico. Descasque e remova a membrana de casca com cuidado.

Transfira o prosencéfalo para outra placa de Petri contendo HBSS e corte-o em pequenos pedaços de cerca de dois milímetros com uma tesoura de mola. Use uma pipeta de transferência estéril para transferir os pedaços de prosencéfalo para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Depois que os pedaços de prosencéfalo afundarem no fundo do tubo da centrífuga, remova o máximo de HBSS possível.

Em seguida, adicione um mililitro de EDTA de tripsina a 0,5% pré-aquecido e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Use uma pipeta Pasteur para remover cuidadosamente a tripsina sem perturbar os pedaços de tecido. Adicione um mililitro de meio neurobasal e deixe os pedaços de tecido afundarem.

Depois de remover o meio e repetir a lavagem, adicione dois mililitros de meio neurobasal e triture suavemente até que não sejam vistos mais pedaços de tecido. Dilua as células ressuspensas de um a 10 com meio neurobasal. Conte as células viáveis usando corante azul de tripano e um hemocitômetro.

Após a contagem, coloque as células dissociadas em matrizes de vários eletrodos revestidas com ECM a uma densidade de 2.200 células por milímetro quadrado. No dia seguinte, adicione 10 BPA micromolar em meio neurobasal às matrizes de múltiplos eletrodos tratadas. No dia da aquisição, substitua o meio de cultura por meio neurobasal fresco e devolva as matrizes à incubadora de CO2 por no mínimo duas horas antes da gravação.

Inicie o software de gravação e defina a temperatura do conjunto de vários eletrodos para 37 graus Celsius clicando no ícone de temperatura. Defina os parâmetros de aquisição selecionando fluxos no painel esquerdo da janela e clicando com o botão direito do mouse no ícone do musa. Em seguida, selecione adicionar processamento e detector de pico e clique em OK na janela pop-up.

O detector de pico seis por STD aparecerá abaixo do nome do arquivo. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no detector de picos, selecione adicionar processamento e detector de explosão e clique em OK na janela pop-up. O detector de explosão ISI aparecerá abaixo do ícone do musa.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse no detector de explosão, selecione adicionar compilador de processamento e estatísticas neurais. Na janela pop-up, certifique-se de que o cabeçalho do arquivo, as estatísticas agregadas do poço e a sincronia estejam selecionados, clique em OK. O compilador de estatísticas aparecerá abaixo. Clique no ícone do relógio na parte inferior da tela e altere as informações na seção de configurações para gravar a cada 5,1 minutos e gravar por cinco minutos.

Isso será iniciado imediatamente e será executado uma vez. Depois de recuperar a matriz de vários eletrodos da incubadora, coloque-a na unidade de gravação e trave-a no lugar. Comece a gravar a atividade da rede clicando em iniciar gravação na seção de gravação agendada.

Normalmente, um tempo de gravação de cinco minutos é suficiente, embora gravações mais longas de até 10 minutos possam ser obtidas. Após a gravação, retorne a matriz de vários eletrodos para a incubadora. O número médio de picos é significativamente menor em culturas de prosencéfalo de pintinhos E7 tratadas com BPA quando comparadas às culturas de controle.

O índice médio de sincronia é significativamente menor em culturas de prosencéfalo de pintinhos E7 tratadas com BPA quando comparadas às culturas de controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três horas, se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as condições estéreis o tempo todo, mesmo durante o registro da atividade do pico.

Após esse procedimento, o efeito de drogas potenciais, como antiepilépticos e antidepressivos, na atividade da rede pode ser avaliado como um passo para a compreensão de seu mecanismo de ação. Muitos EDCs têm efeitos sutis no cérebro durante o desenvolvimento, que se manifestam como mudanças no comportamento. O comportamento é uma saída direta da atividade de rede subjacente.

Nosso protocolo visa dissecar os efeitos desses compostos na atividade da rede.