In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

O objetivo geral desses experimentos é avaliar os níveis de mitofagia em células humanas, C.elegans e camundongos. A mitofagia tornou-se um conceito muito importante na encruzilhada da neurodegeneração, doenças metabólicas e envelhecimento, e a compreensão das metodologias apresentadas aqui e do uso futuro delas pode estar ajudando a fazer avanços neste importante campo. As principais vantagens desta técnica são que ela detecta a mitofagia de maneira robusta e eficiente e permite a detecção da mitofagia tanto in vitro quanto in vivo.

Esta técnica aqui apresentada ajudará os pesquisadores a desenvolver novos insights e desenvolver novas estratégias de terapia contra doenças neurogenerativas, incluindo Alzheimer e Parkinson, onde sabemos que há uma disfunção mitocondrial. Além de fornecer informações sobre os mecanismos moleculares da mitofagia, esses métodos podem levar à descoberta de novos candidatos a medicamentos por meio da triagem de indutores de mitófagos. As demonstrações visuais desses métodos são críticas, pois os níveis de mitofagia são muito sensíveis a mudanças nas condições experimentais em C. elegans e camundongos.

Semeie de 300.000 a um milhão de células em um prato de micropoços com fundo de vidro de 35 milímetros, micropoço de 10 milímetros, para que as células atinjam 70% de confluência no dia seguinte. Mantenha as células em meio de cultura celular completo e incuba-as em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, diluir 15 microlitros do reagente de transfecção de DNA com 150 microlitros de meio livre de soro de acordo com o protocolo do fabricante.

Além disso, dilua de dois a cinco microgramas do DNA do plasmídeo mito-Keima com 150 microlitros de meio livre de soro. Adicione o plasmídeo mito-Keima diluído ao reagente de transfecção de DNA diluído e vortex a mistura por 10 segundos. Em seguida, incube a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA gota a gota às células, agite suavemente as placas por cinco a 10 segundos para misturar a solução. Neste ponto, coloque as células de volta na incubadora e incube-as por 24 horas. No dia seguinte, troque o meio para um novo meio de cultura de células completas e, em seguida, incube as células transfectadas por mais 24 horas.

Imagem das células transfectadas usando microscopia confocal. Visualize aleatoriamente 20 áreas com ampliação de 40 vezes para documentar um total de 100 a 200 células em cada poço. No primeiro dia, escolha larvas L4 de animais transgênicos que expressam DCT-1 GFP e DSRed LGG-1 em células musculares da parede corporal e coloque-as em uma placa de meio de crescimento de nematóides semeada OP50.

Coloque de cinco a 10 minhocas em cada placa de 3,5 centímetros usando pelo menos três placas. Quando terminar, incube os nematóides a 20 graus Celsius. Em seguida, no quinto dia, sincronize os nematóides selecionando 15 a 20 larvas transgênicas L4 e transferindo-as para placas frescas com sementes OP50.

Use pelo menos cinco placas para cada condição experimental. No sétimo dia, prepare algumas das placas veiculares para mitofagia que afeta drogas de interesse e algumas para usar como controles positivos. Em seguida, exponha as placas semeadas de E.coli à luz ultravioleta por 15 minutos a uma intensidade de 222 microwatts por centímetro quadrado, para garantir que os compostos indutores de mitofagia nas placas não sejam metabolizados por bactérias.

Agora, adicione o composto de interesse em 10 microlitros ao topo das placas semeadas e adicione uma quantidade equivalente de veículo composto às placas do veículo como controle negativo. Para controle positivo da indução de mitofagia, adicione paraquat, um tóxico mitocondrial. Agite suavemente as placas até que a solução cubra toda a superfície e deixe as placas secarem com as tampas fechadas, em temperatura ambiente, por pelo menos uma hora.

Depois de secos, transfira de 10 a 20 animais transgênicos adultos de dois dias para as placas. Incube-os a 20 graus Celsius por dois dias. No nono dia, prepare almofadas de agarose 2% e adicione uma gota de levamisol 20 milimolar em M9, por almofada.

Imobilize os animais transgênicos para imagem, colocando-os na gota de levamisol M9. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula na parte superior da gota. Coloque a amostra em um estágio de microscópio confocal e obtenha imagens das células musculares da parede do corpo único tirando imagens da pilha Z com ampliação de 63 vezes.

Coloque um fígado de camundongo mito-Keima fresco e isolado em uma placa de metal resfriada, no gelo, para resfriar rapidamente o tecido. Mantenha-o lá enquanto processa o tecido o mais rápido possível, pois o sinal da proteína mito-Keima permanece estável no gelo por até uma hora. Em seguida, use uma pinça curva para levantar a amostra de fígado e enxágue-a com cinco mililitros de PBS gelado.

Finalmente, imagem das seções de tecido usando microscopia confocal com duas excitações sequenciais. Usando o procedimento aqui apresentado, as células HeLa humanas foram transfectadas com o plasmídeo mito-Keima. As células saudáveis demonstraram uma rede mitocondrial bem organizada com poucas incidências de mitofagia.

No entanto, as células pré-tratadas com um desacoplador mitocondrial FCCP exibiram um aumento profundo na incidência de mitofagia. A mitofagia também foi medida usando a co-localização de LAMP2 e COXII. Para a detecção in vivo de mitofagia em C. elegans, nematóides transgênicos expressando MT rosella em células musculares da parede corporal foram tratados com oito milimolares de paraquat.

O nível de indução de mitofagia indicado por uma diminuição na razão de fluorescência sensível ao pH diminuiu significativamente nos nematóides tratados com paraquat. Além disso, o elevado número de eventos de co-localização entre GPF fundido com DCT-1 e LGG-1 fundido com DSRed, significa estimulação da mitofagia em resposta ao estresse oxidativo. Finalmente, essas imagens representam sinais mito-Keima do fígado e cerebelo de um camundongo mito-Keima.

Os tecidos precisam ser mantidos frios e fotografados o mais rápido possível, mas quando preparados adequadamente, podem ser usados para fornecer informações sobre a mitofagia em condições normais e fisiopatológicas. O uso desta técnica abriu caminhos para pesquisadores no amplo campo da neurodegeneração e biologia mitocondrial, para explorar funções mitocondriais em diferentes sistemas modelo, incluindo células cultivadas, vermes ou C.elegans e modelos de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de vários métodos a serem usados na avaliação quantitativa dos níveis de mitofagia em C.elegans e camundongos.