Name: In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda métodos de deteção de mitofagia in vitro e in vivo em células humanas, C. elegans e ratos. Estas técnicas robustas ajudam investigadores a estudar disfunção mitocondrial em doenças neurodegenerativas.

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Podemos agradecer ao Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle o plasmídeo mt-Keima e mt-Keima integrado as células Hela. Agradecemos a Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau para a leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural de NIH (VAB), o Instituto Nacional sobre envelhecimento, bem como um 2014-2015 e 2016-2017 NIA intralaboratório concedem (FEP, VAB). FEP foi apoiado por HELSE SOR-OST RHF (projeto n: 2017056) e o Conselho de pesquisa da Noruega (projeto n: 262175).
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR:
FEP projetado o manuscrito e elaborou o projecto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH e ED escreveram seções diferentes do papel; NT, JP, HN e VAB revisto o manuscrito e fornecido a perícia.

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
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<li>Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+autophagy+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).</li>
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<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
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<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
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<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

O laboratório de Bohr tem arranjos de CRADA com ChromaDex e GlaxoSmithKline.

Medição de mitophagy é tecnicamente exigente. Aqui, apresentamos várias técnicas robustas que permitem ambos detecção qualitativa de mitophagy e quantificação dos níveis de mitophagy nos modelos experimentais de laboratório mais comuns.
Para adquirir dados replicáveis, um projeto experimental com pelo menos três repetições biológicas é necessário. Todos os pesquisadores envolvidos em experimentação e análise devem ficar cego para identidades de grupo experimental. Além disso, campos de imagem ...

Mitophagy é essencial para a manutenção mitocondrial. Mitocôndria celular múltiplas vias de sinalização se cruzam e é organelas celulares sub universais responsáveis pela produção de energia celular, metabolismo celular e cálcio homeostase1,2,3, 4. as mitocôndrias constantemente experimentam desafios de fontes endógenas e exógenas, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e tóxicos mitocondriais, respectivamente, que levam à geração de mitocôndrias disfuncionais e "envelhecidas". Acúmulo de mitocôndrias danificadas diminui a eficiência da produção de ATP, enquanto aumenta a quantidade de ROS prejudiciais e tem sido associado a doenças relacionadas com a idade, como doenças metabólicas, AD e PD1,5,6 . Para evitar a disfunção celular mitocôndria induzida, necessidade de células especificamente reconhecer danificado mitocôndrias e eficientemente removê-los através de um processo celular denominado autofagia mitocondrial (mitophagy). Isto demonstrou a importância da mitophagy em saúde e doença ilustra a necessidade de métodos precisos e eficientes detectar mitophagy tanto in vitro e in vivo.
Mitophagy é um processo de várias etapas que envolvem muitas proteínas e complexos de proteína a5,7,8. Em breve, uma mitocôndria danificada primeiro é reconhecida e tragada por um phagophore double-membraned, que pode se originam da membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, núcleo ou mitocôndria em si9,10. O esférico phagophore alonga e eventualmente lacra as mitocôndrias no interior, que constitui o autophagosome mitocondrial (mitophagosome). O mitophagosome então se funde com o lisossomo para degradação, formando um autolysosome em que a mitocôndria danificada é degradadas e reciclados7,8. Principais proteínas autophagic também envolvidas em mitophagy incluem: autofagia relacionados 7 (ATG7) e Beclin1 (iniciação), proteína Microtubule-Associated 1A/1B-luz corrente 3 (LC3-II) (LGG-1 em c. elegans) e p62 (componentes do phagophore), e glicoproteína de membrana lisossomal-associado 2 (luz2)6,7. Além disso, há várias proteínas essenciais exclusivos para mitophagy, incluindo induzida por PTEN putativo quinase 1 (rosa-1), proteína Nuclear de ponto 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interagindo proteína 3 como (NIX/BNIP3L) (DCT-1 em c. elegans), entre outros5,6,11.
Um método comum para detectar mudanças nos níveis de autofagia é pela relação de LC3-II/LC3-I ou II/LC3-actínio. No entanto, esse método é inespecífico, como um aumento desta relação pode refletir uma iniciação maior ou uma fusão prejudicada de mitophagosome a lisossoma12. Outro método consiste em avaliar o colocalization entre um marcador de autofagia (por exemplo, LC3) e uma proteína mitocondrial (por exemplo, Translocase de exterior mitocondrial membrana 20 (TOMM20, que pode ser degradado por proteasomes)). No entanto, isto só pode indicar alterações nos níveis de mitophagy total e não consegue distinguir da execução no qual bloqueio ocorre. Isso pode ser esclarecido usando inibidores dos lisossomos (por exemplo, A E64d + Pepstatin, denominado EP) em paralelo para causar o acúmulo de mitophagosomes. A diferença entre o número de mitophagosomes na linha de base e o número de mitophagosomes após o tratamento com EP pode indicar mitophagy. Estas limitações têm solicitado o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Tendo em conta a crescente relevância da mitophagy em um amplo espectro de doenças humanas, apresentamos várias técnicas de deteção de mitophagy robusta que podem ser útil para pesquisadores. Podemos cobrir técnicas tanto in vitro e in vivo e recomenda combinar várias técnicas para verificar alterações de mitophagy.

<table><tbody><tr><td>camundongo mt-Keima</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagente de transfecção de DNA</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM meio (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>#31985062</td><td>meio sem soro</td></tr><tr><td>plasmídeo mtKemia: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo COXII (camundongo)</td><td>abcam</td><td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo LAMP2 (coelho)</td><td>NOVUS</td><td></td><td></td></tr>#CD107b <tr><td>cabra-anti-coelho com comprimento de onda de 568 nm de proteína fluorescente vermelha (RFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25306</td><td>Alexa Fluor 568 corante</td></tr><tr><td>cabra-anti-camundongo com comprimento de onda 488 nm de proteína fluorescente verde (GFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488 corante</td></tr><tr><td>prolongar o antifade de ouro com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>SIGMA Corning Costar</td><td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>corrediça de câmara de 4 poços</td><td>THermofisher, Nunc Lab-Tek</td><td>#171080</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F Placa de 96 poços</td><td>Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>LC3B anticorpo coelho</td><td>NOVUS</td><td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA anticorpo</td><td>Progen Biotechnik</td><td>#anti-DNA camundongo monoclonal, AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>#D1306</td><td>meio de montagem antifade com DAPI</td></tr><tr><td>IN Analisador de células (leitor fluorescente)</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#IN Analisador de células 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>Software de colocalização</td><td>Volocity</td><td>#Volocity 6.3</td><td>alternativa Zeiss ZEN 2012</td> software</tr><tr><td>Software de Investigação de Células IN</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>meio de cultura de células</td><td>Thermofisher</td><td>#DMEM&ndash; Penicilina-Estreptomicina Média Eagle Modificada</td><td></td>de Dulbecco</tr><tr><td>(10.000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Cultura</td><td>de Células Thermofisher</td><td>#Thermo Forma 3110 CO2 Incubadora</td><td></td>com Camisa de Água</tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>câmera</td><td>Olympus</td><td></td> Microscópio confocal <td>Olympus DP71</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>software confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>software de análise de imagem</td> Análise de colocalização <td>Image J</td><td>, etc</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>software de análise estatística</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, EUA</td><td></td><td>Material do pacote de software GraphPad Prism</td></tr><tr><td>para fazer uma picareta de minhoca</td><td>Surepure Chemetals</td><td>#4655</td><td>A palheta é feita de fio de irídio de 30 gauge 90% platina 10%</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Consulta de material para Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td>Manter animais transgênicos em 20 &deg; C</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Consulta de material a Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>Consulta de material a Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>Consulta de material a Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed:: LGG-1</td><td>Consulta de material para Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraquat:</td><td>ver dados suplementares para preparação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tampão M9</td>, <td>ver dados suplementares para preparação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tampão M9-levamisol</td>, <td>ver dados suplementares para preparação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Lâminas de microscópio de vidro e lamínulas</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>#B9992000</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19 Peças Pacote de Esterilização Canina Economia</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19 Peças Pacote de Esterilização Canina Economia</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermofisher</td><td>#AM9625</td><td>10x PBS precisa ser diluído para 1x PBS usando o agitador ddH2O</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-676-178</td><td>Pacote de Agitador de Plataforma Aberta Orbital Orbital MaxQ HP da Thermo Scientific Uma</td></tr><tr><td>almofada de agarose de 2%</td><td>veja dados suplementares para preparação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Vibroslice</td><td>Instrumentos de precisão mundial</td><td>#BLADES-2</td><td>lâmina de borda única</td></tr><tr><td>placa de metal</td><td>MSC</td><td>#78803988</td><td>0.012 in de espessura x 6 in de largura x 12 in de comprimento, Chapa de Aço Inoxidável 430</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>detergente</td></tr><tr><td>Hidrato de dicloreto de viologênio metílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#856177</td><td>paraquat</td></tr><tr><td>Incubadora para nematóides</td><td>AQUALYTIC</td><td></td><td>Incubadora para manter 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Para nematóides (etapa 2)</td></tr><tr><td>microscópio de epifluorescência</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>Para nematóides (etapa 2)</td></tr><tr><td>Reticulador UV</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash; BLX-E365 Fonte de</td><td>luz UV; 356 nm</td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo de deteção de mitophagy em células humanas, c. eleganse os ratos

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

As mitocôndrias são as potências de células e produzem energia celular na forma de ATP. Disfunção mitocondrial contribui para o envelhecimento biológico e uma grande variedade de doenças, incluindo doenças metabólicas, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD) e síndromes de envelhecimento prematuro. Manutenção da saúde mitocondrial depende de biogênese mitocondrial e eficiente apuramento das mitocôndrias disfuncionais através de mitophagy. Métodos experimentais para detectar com precisão a autofagia/mitophagy, especialmente em modelos animais, tem sido um desafio para desenvolver. Recentes progressos no sentido da compreensão dos mecanismos moleculares de mitophagy permitiu o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Aqui, apresentamos várias técnicas versátil para monitorar mitophagy em células humanas, Caenorhabditis elegans (por exemplo, Rosella e estirpes DCT-1 / IgG-1) e os ratos (mt-Keima). Uma combinação destas técnicas de deteção de mitophagy, incluindo a avaliação entre espécies, irá melhorar a precisão das medições mitophagy e levar a uma melhor compreensão do papel do mitophagy na saúde e na doença.

Deteção de Mitophagy em células humanas:
Usando o procedimento aqui apresentado, as células HeLa humanas foram transfected com mt-Keima do plasmídeo. Células saudáveis demonstraram uma bem organizada rede mitocondrial (GFP, 488 nm) com alguns casos de mitophagy (RFP, 561 nm). No entanto, as células pré-tratados com um desacoplador mitocondrial Compararia (30 µM para 3h) exibiu um profundo aumento na incidência de mitophagy (<strong...

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

O objetivo geral desses experimentos é avaliar os níveis de mitofagia em células humanas, C.elegans e camundongos. A mitofagia tornou-se um conceito muito importante na encruzilhada da neurodegeneração, doenças metabólicas e envelhecimento, e a compreensão das metodologias apresentadas aqui e do uso futuro delas pode estar ajudando a fazer avanços neste importante campo. As principais vantagens desta técnica são que ela detecta a mitofagia de maneira robusta e eficiente e permite a detecção da mitofagia tanto in vitro quanto in vivo.Esta técnica aqui apresentada ajudará os pesquisadores a desenvolver novos insights e desenvolver novas estratégias de terapia contra doenças neurogenerativas, incluindo Alzheimer e Parkinson, onde sabemos que há uma disfunção mitocondrial. Além de fornecer informações sobre os mecanismos moleculares da mitofagia, esses métodos podem levar à descoberta de novos candidatos a medicamentos por meio da triagem de indutores de mitófagos. As demonstrações visuais desses métodos são críticas, pois os níveis de mitofagia são muito sensíveis a mudanças nas condições experimentais em C. elegans e camundongos.Semeie de 300.000 a um milhão de células em um prato de micropoços com fundo de vidro de 35 milímetros, micropoço de 10 milímetros, para que as células atinjam 70% de confluência no dia seguinte. Mantenha as células em meio de cultura celular completo e incuba-as em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, diluir 15 microlitros do reagente de transfecção de DNA com 150 microlitros de meio livre de soro de acordo com o protocolo do fabricante.Além disso, dilua de dois a cinco microgramas do DNA do plasmídeo mito-Keima com 150 microlitros de meio livre de soro. Adicione o plasmídeo mito-Keima diluído ao reagente de transfecção de DNA diluído e vortex a mistura por 10 segundos. Em seguida, incube a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA gota a gota às células, agite suavemente as placas por cinco a 10 segundos para misturar a solução. Neste ponto, coloque as células de volta na incubadora e incube-as por 24 horas. No dia seguinte, troque o meio para um novo meio de cultura de células completas e, em seguida, incube as células transfectadas por mais 24 horas.Imagem das células transfectadas usando microscopia confocal. Visualize aleatoriamente 20 áreas com ampliação de 40 vezes para documentar um total de 100 a 200 células em cada poço. No primeiro dia, escolha larvas L4 de animais transgênicos que expressam DCT-1 GFP e DSRed LGG-1 em células musculares da parede corporal e coloque-as em uma placa de meio de crescimento de nematóides semeada OP50.Coloque de cinco a 10 minhocas em cada placa de 3,5 centímetros usando pelo menos três placas. Quando terminar, incube os nematóides a 20 graus Celsius. Em seguida, no quinto dia, sincronize os nematóides selecionando 15 a 20 larvas transgênicas L4 e transferindo-as para placas frescas com sementes OP50.Use pelo menos cinco placas para cada condição experimental. No sétimo dia, prepare algumas das placas veiculares para mitofagia que afeta drogas de interesse e algumas para usar como controles positivos. Em seguida, exponha as placas semeadas de E.coli à luz ultravioleta por 15 minutos a uma intensidade de 222 microwatts por centímetro quadrado, para garantir que os compostos indutores de mitofagia nas placas não sejam metabolizados por bactérias.Agora, adicione o composto de interesse em 10 microlitros ao topo das placas semeadas e adicione uma quantidade equivalente de veículo composto às placas do veículo como controle negativo. Para controle positivo da indução de mitofagia, adicione paraquat, um tóxico mitocondrial. Agite suavemente as placas até que a solução cubra toda a superfície e deixe as placas secarem com as tampas fechadas, em temperatura ambiente, por pelo menos uma hora.Depois de secos, transfira de 10 a 20 animais transgênicos adultos de dois dias para as placas. Incube-os a 20 graus Celsius por dois dias. No nono dia, prepare almofadas de agarose 2% e adicione uma gota de levamisol 20 milimolar em M9, por almofada.Imobilize os animais transgênicos para imagem, colocando-os na gota de levamisol M9. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula na parte superior da gota. Coloque a amostra em um estágio de microscópio confocal e obtenha imagens das células musculares da parede do corpo único tirando imagens da pilha Z com ampliação de 63 vezes.Coloque um fígado de camundongo mito-Keima fresco e isolado em uma placa de metal resfriada, no gelo, para resfriar rapidamente o tecido. Mantenha-o lá enquanto processa o tecido o mais rápido possível, pois o sinal da proteína mito-Keima permanece estável no gelo por até uma hora. Em seguida, use uma pinça curva para levantar a amostra de fígado e enxágue-a com cinco mililitros de PBS gelado.Finalmente, imagem das seções de tecido usando microscopia confocal com duas excitações sequenciais. Usando o procedimento aqui apresentado, as células HeLa humanas foram transfectadas com o plasmídeo mito-Keima. As células saudáveis demonstraram uma rede mitocondrial bem organizada com poucas incidências de mitofagia.No entanto, as células pré-tratadas com um desacoplador mitocondrial FCCP exibiram um aumento profundo na incidência de mitofagia. A mitofagia também foi medida usando a co-localização de LAMP2 e COXII. Para a detecção in vivo de mitofagia em C. elegans, nematóides transgênicos expressando MT rosella em células musculares da parede corporal foram tratados com oito milimolares de paraquat.O nível de indução de mitofagia indicado por uma diminuição na razão de fluorescência sensível ao pH diminuiu significativamente nos nematóides tratados com paraquat. Além disso, o elevado número de eventos de co-localização entre GPF fundido com DCT-1 e LGG-1 fundido com DSRed, significa estimulação da mitofagia em resposta ao estresse oxidativo. Finalmente, essas imagens representam sinais mito-Keima do fígado e cerebelo de um camundongo mito-Keima.Os tecidos precisam ser mantidos frios e fotografados o mais rápido possível, mas quando preparados adequadamente, podem ser usados para fornecer informações sobre a mitofagia em condições normais e fisiopatológicas. O uso desta técnica abriu caminhos para pesquisadores no amplo campo da neurodegeneração e biologia mitocondrial, para explorar funções mitocondriais em diferentes sistemas modelo, incluindo células cultivadas, vermes ou C.elegans e modelos de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de vários métodos a serem usados na avaliação quantitativa dos níveis de mitofagia em C.elegans e camundongos.

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Este vídeo demonstra um ensaio in vivo para estudar a mitofagia em Caenorhabditis elegans. Ao expor os nematóides a uma droga indutora de mitofagia, a ocorrência de mitofagia é avaliada pela co-localização entre DCT-1, um receptor de mitofagia na mitocôndria danificada e a proteína de membrana autofagossômica LGG-1.

Um ensaio in vivo para detectar mitofagia em nematóides transgênicos

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A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

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Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

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