Name: Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda a glicosilação site-specific de proteínas recombinantes direcionando tióis de cisteína. Este método permite avaliar eficiência e efeitos estruturais da modificação pós-traducional em estudos de biologia estrutural.

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Esta pesquisa foi apoiada pela ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (05239 de P.B.S), Fundação Canadense para a inovação/Ontario Research Fund (de P.B.S), Fundação de lutar próstata câncer - Telus Ride para o pai (PBS) e Ontário Bolsa de pós-graduação (para Y.J.C. e N.S.).

Proteína glycosylation é uma modificação pós-traducional onde açúcares estão covalentemente ligados a polipeptídeos principalmente através de ligações com cadeias laterais de aminoácidos. Até 50% de proteínas de mamíferos são glicosilados 54, onde as proteínas glicosilados posteriormente podem ter uma variada gama de efeitos de alterando a afinidade de ligação biomolecular, influenciando a proteína dobráveis, alterando a atividade do canal, visando moléculas para celular tráfico, para citar alguns...

Armazene operado de cálcio (Ca2 +) entrada (SOCE) é a principal via pela qual as células imunes ocupam Ca2 + do espaço extracelular para o citoplasma. Em linfócitos T, células T receptores situados na membrana plasmática (PM) ligam antígenos que ativam quinases de proteína tirosina (revistos em 1,2,3). Uma cascata de fosforilação leva à ativação da fosfolipase-γ (PLCγ), que posteriormente, Medeia a hidrólise da membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em diacilglicerol e inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3 ). IP3 é um pequeno mensageiro diffusible que liga ao IP3 receptores (IP3R) sobre o retículo endoplasmático (ER), assim, abrindo este canal receptor e permitindo Ca2 + para fluir para baixo o gradiente de concentração da emergência lúmen para o citosol (revisto em 4). Receptor de sinalização da proteína G acoplada e receptores de tirosina quinase em uma variedade de outra células não-excitáveis e excitável tipos chumbo para a mesma produção de IP3 e a ativação do IP3Rs.
Devido a Ca2 + armazenamento capacidade finita do PS, o IP3-liberação mediada e resultante aumento citosólico Ca2 + é apenas transitório; no entanto, esta depleção do ER luminal Ca2 + profundamente efeitos do estroma interação molécula-1 (STIM1), um tipo-eu transmembrana (TM) proteína encontrada principalmente no ER membrana 5,6,7. STIM1 contém um lúmen-orientado Ca2 + sensoriamento domínio composto por um par de EF-mão e estéril α-motif (EFSAM). Três domínios coiled-coil citosólica orientado são separados da EFSAM pelo domínio do TM único (revisto em 8). Em cima de ER luminal Ca2 + da prostração, EFSAM sofre uma desestabilização acoplados oligomerização 7,9 que faz com que rearranjos estruturais do TM e domínios coiled-coil 10. Estas mudanças estruturais culminaram em uma captura de STIM1 ER-PM entroncamentos 11,12,13,14 através de interações com remodelamento PM 15, 16 e de Orai1 subunidades 17,18. Orai1 proteínas são as subunidades de PM que montam para formar Ca2 + canais de de21, 19,20,22. As interações de STIM1-Orai1 nos cruzamentos de ER-PM facilitam uma aberto Ca2 + lançamento ativado Ca2 + (CRAC) canal conformação que permite a circulação de Ca2 + para o citosol das altas concentrações do no espaço extracelular. Em células do sistema imunológico, as sustentado citosólico Ca2 + elevações através de canais de CRAC induzem a Ca2 +- calmodulina/calcineurina dependente desfosforilação do fator nuclear das células T ativadas que posteriormente entra no núcleo e começa o Regulamento transcricional de genes, promovendo a ativação de células T 1,3. O processo de ativação de canal CRAC por STIM1 23,24 via induzida pelo agonista ER luminal Ca2 + depleção e a resultante sustentado citosólico Ca2 + elevação é coletivamente denominado SOCE 25. O papel vital da SOCE em células T é evidente por estudos demonstrando que hereditários mutações em ambos os STIM1 e Orai1 podem causar imunodeficiência combinada grave síndromes 3,19,26, 27. EFSAM inicia SOCE após detecção ER-luminal Ca2 + depleção através da perda de Ca2 + coordenação no canônico EF-lado, finalmente levando à desestabilização acoplados auto associação 7, 28,29.
Glycosylation é a ligação covalente e processamento de estruturas de oligossacarídeo, também conhecido como os glicanos, através de várias etapas biossintéticas no ER e Golgi (revisto em 30,32,33). Existem dois tipos predominantes de glicosilação em eucariontes: N-vinculado e O-ligada, dependendo do aminoácido específico e átomo colmatar o enlace. Na N- glicosilação, os glicanos são anexados a amida de cadeia lateral do Asn, e na maioria dos casos, a etapa de iniciação ocorre no PS como o polipeptídeo cadeia move-se para o lúmen 34. O primeiro passo do N- glicosilação é a transferência de uma núcleo de quatorze-açúcar estrutura composta de glicose (Glc), manose (homem) e N- acetilglicosamina (GlcNAc) (ou seja, Glc3homem9GlcNAc2) da emergência lipídios de membrana por uma oligosaccharyltransferase 35,36. Outras medidas, tais como a clivagem ou transferência de resíduos de glicose, são catalisadas nas urgências por glycosyltransferases e glicosidases específico. Algumas proteínas que deixe o ER e mover para o Golgi podem ser ainda mais processados 37. O- glicosilação refere-se à adição dos glicanos, geralmente para o grupo hidroxila de cadeia lateral de resíduos Ser ou Thr, e essa modificação ocorre inteiramente no complexo de Golgi 33,34. Existem várias estruturas de glicano - Oque podem ser feitas de N- acetilglicosamina, fucose, galactose e ácido siálico com cada monossacarídeo adicionado sequencialmente 33.
Enquanto nenhuma sequência específica foi identificada como pré-requisito para muitos tipos de O- glicosilação, uma sequência de consenso comum tem sido associada com a N-ligados a modificação: Asn-X-Ser/Thr/Cys, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro 33. STIM1 EFSAM contém dois desses sites - glicosilação do consenso N: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. De fato, estudos anteriores mostraram que EFSAM pode ser N- glicosilados em células de mamíferos em Asn131 e Asn171 38,39,40,41. No entanto, estudos anteriores sobre as consequências da N- glicosilação na SOCE tem sido incongruentes, sugerindo suprimida, potencializado ou nenhum efeito por esta modificação borne-translational na SOCE ativação 38,= "xref" > 39 de40,,41. Assim, a investigação sobre as consequências de biofísicas, bioquímicas e estruturais subjacentes de EFSAM N- glicosilação é vital para compreender os efeitos regulatórios da modificação. Devido à exigência de altos níveis de proteínas homogêneas nesses experimentos em vitro , foi aplicada uma abordagem local-seletiva covalentemente anexar partes de glicose para EFSAM. Curiosamente, Asn131 e Asn171 de glicosilação causou mudanças estruturais que convergem dentro do núcleo EFSAM e aumentar as propriedades biofísicas que promovem SOCE mediada por STIM1 42.
O sistema químico de glycosyl grupos de tióis Cys tem sido bem estabelecido por uma obra seminal que primeiro demonstrou a utilidade desta abordagem de enzima livre para entender os efeitos específicos do site da glicosilação na proteína função 43 , 44. mais recentemente e com respeito a STIM1, os resíduos de Asn131 e Asn171 foram uma mutação de Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] foi usado para ligar covalentemente glicose para a enciclopédia tióis 42. Aqui, descrevemos esta abordagem que não só usa o mutagenesis de incorporar resíduos de Cys local específicos para a modificação, mas também se aplica a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) solução para avaliar rapidamente a eficiência de modificação e estrutural perturbações como resultado da glicosilação. Notavelmente, esta metodologia geral é facilmente adaptável para estudar os efeitos de ambos O- ou N- glicosilação de qualquer recombinantes produzidos a proteína.

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA Polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Use na etapa 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>Use na etapa 1.6.</td></tr><tr><td>Enzima de restrição DpnI</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>Utilizar no passo 1.8.</td></tr><tr><td>Kit de Plasmídeo Mini Presto</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>Use na etapa 1.16.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 códon (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>Utilização no passo 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>Use na etapa 1.9.</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa de 0,22 mm</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>Use na etapa 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA Resina de Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>Use na etapa 3.3.</td></tr><tr><td>3.500 Da MWCO Tubulação de Diálise</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>Utilizar nos passos 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 e 4.6.</td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>Use na etapa 3.9.</td></tr><tr><td>Coluna de Troca de Ânions HiTrap Q FF de 5 mL</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>Use na etapa 3.11.</td></tr><tr><td>Glicose-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>Use na etapa 4.1.</td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos de ultrafiltração Vivaspin 20</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>Use nas etapas 3.11, 4.2, 4.5 e 4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler Escada de Proteína Larga Não Corada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>Use nas etapas 3.7, 3.10 e 3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF Coluna de Troca de Ânions</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>Use na etapa 3.12.</td></tr><tr><td>Sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida Pura AKTA</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>Use na etapa 3.14.</td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN Varian Inova de 600 MHz</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>Use nas etapas 5.2 e 5.5.</td></tr></tbody></table>

direcionamento de tióis cisteína para in vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Do estroma interação molécula-1 (STIM1) é um tipo-eu proteína transmembrana localizado no retículo endoplasmático (ER) e membranas de plasma (PM). ER-residente STIM1 regula a atividade de PM Orai1 canais em um processo conhecido como armazenar entrada operado de cálcio (Ca2 +), que é o principal Ca2 + sinalização processo que orienta a resposta imune. STIM1 sofre N- glicosilação pós-traducional em dois locais de Asn luminal dentro do Ca2 + sensoriamento domínio da molécula. No entanto, a bioquímica, biofísica, e efeitos biológicos de estrutura de N- glicosilados STIM1 foram mal compreendidos até recentemente devido a uma incapacidade para obter facilmente altos níveis de proteína de - glicosilados homogênea N. Aqui, descrevemos a implementação de uma em vitro abordagem química que une partes de glicose para sites de proteína específica aplicáveis para entender os efeitos subjacentes do N- glicosilação na estrutura da proteína e mecanismo. Usando a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de solução avaliamos tanto eficiência da modificação, bem como as consequências estruturais do acessório glicose com uma única amostra. Esta abordagem pode ser adaptada facilmente para estudar as proteínas miríade glicosilados encontradas na natureza.

A primeira etapa desta abordagem requer a mutagênese dos resíduos de glicosilação candidato a Cys resíduos, que podem ser modificados usando a glicose-5-MTS. EFSAM tem sem resíduos de Cys endógenos, então não há considerações especiais que precisam ser feitas antes do mutagênese. No entanto, nativo Cys de resíduos devem ser uma mutação de resíduos não-modificável antes de realizar a química descrita. Ao efeito minimamente a estrutura nativa, sugerimos realizar um alinhamento global da seq...

Análises bioquímicas e estruturais das proteínas glicosilados requerem relativamente grandes quantidades de amostras homogêneas. Aqui, apresentamos um método químico eficiente para site-specific glicosilação de proteínas recombinantes purificado a partir de bactérias pela segmentação reativa Cys tióis.

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

O objetivo geral deste procedimento é incorporar resíduos de cisteína em proteínas por mutagênese dirigida ao local em locais nativamente glicosilados e empregar abordagens de fixação e avaliação de glicose in vitro para avaliar a eficiência e os efeitos estruturais da glicosilação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Biologia Estrutural, tais como, quais são as consequências estruturais da glicosilação de proteínas e como essas modificações afetam os mecanismos subjacentes de função? As principais vantagens desta técnica são que ela é facilmente adaptável ao estudo ou manuseio da glicosilação.É altamente eficiente e tanto as perturbações da estrutura quanto a eficiência podem ser avaliadas rapidamente. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças porque os padrões alterados de glicosilação têm sido associados a vários cânceres e distúrbios neurodegenerativos. Embora esse método possa fornecer informações sobre os efeitos das proteínas nativamente glicosiladas, ele também pode fornecer informações muito necessárias sobre como alterar os padrões de glicosilação que podem contribuir para essa gama de doenças.Para introduzir uma única mutação de cisteína no vetor de expressão, prepare dois tubos de reação de PCR individuais. No primeiro tubo, adicione o primer mutagênico direto e, no segundo tubo, adicione o primer mutagênico reverso. Adicione uma concentração final de tampão PCR 1X a ambos os tubos.Em seguida, configure um programa de cinco ciclos para os dois tubos de reação de PCR separados. Adicione um tempo de extensão de sete minutos e meio a 72 graus Celsius no final do quinto ciclo. Após a conclusão dos cinco ciclos, misture as duas reações de PCR separadas em um único tubo, centrifugue o tubo por cerca de três segundos e repita mais 20 ciclos seguindo as mesmas condições de PCR.Em seguida, execute 15 microlitros da amostra em um gel de agarose a 1% de DNA a 120 Volts por 40 minutos. Em seguida, mergulhe o gel em água contendo 0,5 miligramas por mililitro de brometo de etídio e agite-o em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, confirme a amplificação do modelo sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 302 nanômetros.Depois disso, adicione 0,5 microlitros de enzima de restrição DPN1 aos 25 microlitros restantes da mistura de reação de PCR. Incube a mistura por duas horas e meia a 37 graus Celsius para digerir o DNA molde metilado. Em seguida, adicione aproximadamente cinco a 10 microlitros da mistura digerida a 100 microlitros de células E.coli competentes para choque térmico e incube no gelo por 60 minutos.Em seguida, choque térmico da mistura célula-DNA a 42 graus Celsius por 45 segundos em um bloco de calor seco. Em seguida, incube imediatamente a mistura no gelo por três minutos. Em seguida, adicione 900 microlitros de caldo LB às células e transfira a suspensão para um tubo estéril de fundo redondo de 14 mililitros.Incubar a 37 graus Celsius com agitação constante a 190 rpm por 90 minutos. Em seguida, espalhe o pellet de células centrifugadas em placas de ágar suplementadas com antibióticos. Incube as placas a 37 graus Celsius por 16 horas.No dia seguinte, inocular assepticamente uma única colônia da placa em cinco mililitros de meio LB suplementado com antibiótico. Em seguida, cultive a cultura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação constante. Transforme o plasmídeo mutado do resíduo de cisteína em células E.coli por meio de tratamento de choque térmico, seguido pelo crescimento da cultura durante a noite em meio LB suplementado com antibióticos.No dia seguinte, espalhe diretamente 150 microlitros de suspensão celular em placas de ágar LB suplementadas com canamicina e mantenha as placas para incubação noturna a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transferir assepticamente uma única colônia em 20 mililitros de meio LB em um frasco Erlenmeyer e deixar para incubação durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transfira a cultura durante a noite para um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, pelete as células centrifugando a cultura líquida durante a noite a 2.400 vezes G por 15 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio mínimo M9 ao pellet celular e, em seguida, suspenda a mistura celular em um litro de meio M9 contendo canamicina. Continue aumentando a cultura líquida M9 a 37 graus Celsius com agitação constante a aproximadamente 190 rpm até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja aproximadamente 0,6 a 0,8.Em seguida, adicione 200 micromolares de IPTG à cultura M9 para induzir a expressão da proteína e deixe a cultura crescer durante a noite. No dia seguinte, pulverizar as células bacterianas da cultura durante a noite, centrifugando a aproximadamente 10.000 vezes G a quatro graus Celsius por 30 minutos. Usando uma pipeta de transferência motorizada de 10 mililitros, homogeneizar o pellet de células bacterianas congeladas em aproximadamente 40 mililitros de tampão de homogeneização.Em seguida, incubar o homogeneizado em um forno de hibridização por 90 minutos com rotação constante. Centrifugar a mistura a cerca de 15 000 vezes G a oito graus Celsius durante 40 minutos para separar a fracção proteica solúvel do pellet insolúvel. Em seguida, adicione 50% de volume por volume de pasta de grânulos de agarose de ácido nitrilotriacético de níquel ao sobrenadante e incube por inversão no forno de hibridização por 90 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, use uma coluna de purificação de proteína de fluxo por gravidade para coletar as esferas de agarose com proteína marcada com hexa-histidina ligada ao níquel. Por fim, lave as contas de agarose coletadas três vezes. Eluir as proteínas em uma série de frações de dois mililitros.Em seguida, confirme a proteína marcada com hexa-histidina purificada nas frações eluídas executando um gel SDS-PAGE corado com azul de Coomassie. Agrupe as frações de proteínas eluídas em uma membrana de diálise com um corte de peso molecular de 3.500 daltons e incube em tampão redobrado a quatro graus Celsius durante a noite com agitação magnética. Em seguida, adicione aproximadamente uma unidade de trombina por miligrama de proteína à proteína combinada na membrana de diálise e incube novamente por um dia a quatro graus Celsius.No dia seguinte, remova a proteína da bolsa de diálise e concentre-a aproximadamente dez vezes usando um concentrador centrífugo de ultrafiltração com um corte de peso molecular de 10.000 daltons. Em seguida, dilua novamente o concentrado de proteína aproximadamente 20 vezes em tampão de redobramento sem cloreto de sódio. Para purificar a proteína, carregue-a em uma coluna de troca aniônica pré-embalada equilibrada com o mesmo tampão livre de cloreto de sódio.Comece a eluir as proteínas em um gradiente de zero a 60% de um cloreto de sódio molar contendo tampão de redobramento. Transfira as frações de proteínas agrupadas para uma bolsa de diálise. Realize uma etapa de diálise a quatro graus Celsius durante a noite para trocar a proteína no tampão de redobramento experimental com a concentração molar ideal de cloreto de sódio.Primeiro, dialise 1,5 mililitros de aproximadamente 60 proteínas micromolares em um litro de tampão de modificação para glicosilação de proteína. Após 24 horas, a quatro graus Celsius, transferir a proteína modificada para um tubo de microcentrífuga e adicionar glicose-5-MTS solubilizada por DMSO até uma concentração final de dois milimolares. Bata suavemente no tubo da microcentrífuga a cada 10 minutos enquanto incuba a amostra no escuro por uma hora em temperatura ambiente.Após a incubação, faça diálise a quatro graus Celsius para trocar novamente a proteína no tampão experimental final. Meça a massa precisa da proteína usando espectrometria de massa de ionização por eletrospray. Finalmente, use a RMN da solução para calcular a eficiência de modificação e identificar as mudanças estruturais dos resíduos de cisis glicosilados na proteína.Um DNA modelo amplificado por PCR mutacional bem-sucedido é mostrado neste gel representativo de agarose 1% DNA. A escada de DNA e uma quantidade equivalente de DNA molde que não foi amplificada por PCR são usadas como controles no gel. A banda superior com coloração de brometo de etídio de alta intensidade mostra o gabarito amplificado do tamanho desejado.Em seguida, a proteína foi purificada usando uma coluna de troca aniônica. O cromatograma mostra um perfil de eluição observado a 280 nanômetros em azul exibindo três picos eluindo contra um gradiente de cloreto de sódio indicado em vermelho com concentração crescente até 0,6 molar. O painel inferior mostra um gel SDS-PAGE corado com azul de Coomassie das frações proteicas.A glicosilação dos resíduos de cisteína foi determinada por espectrometria de massa de ionização por eletrospray. O cromatograma mostra as massas da proteína não modificada e modificada antes e depois da glicosilação do resíduo de cisteína. Para confirmação, a RMN da solução foi realizada mostrando a sobreposição espectral HSQC dos deslocamentos químicos da amida específicos do resíduo, indicando modificações e perturbações estruturais da proteína glicosilada.Quando dominado, todos os estágios, desde a mutagênese até a avaliação da RMN, podem ser concluídos em aproximadamente 12 dias, excluindo o tempo de espera para síntese de primers, sequenciamento de DNA e serviços de espectroscopia de massa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de avaliar os efeitos estruturais e biofísicos das mutações da cisteína na ausência da modificação do tiol como medidas de controle da linha de base. Após este procedimento, outros métodos, como estabilidade, estrutura secundária, ligação iônica, avaliações de interação proteína-proteína, podem ser realizados para revelar como as propriedades biofísicas das funções proteicas subjacentes são afetadas pela glicosilação.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de sinalização de cálcio avaliarem individual e cumulativamente os papéis da asparagina 131 e da asparagina 171 e da glicosilação na interação estromal da sinalização da molécula um de cálcio associada à entrada de cálcio operada por armazenamento.

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