Name: Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a executar ATAC-seq em linfócitos T humanos primários para mapear regiões cromatínicas acessíveis. Este método robusto requer pouco material inicial e revela o panorama regulatório do genoma.

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Este trabalho é apoiado pela Fundação de ciência de Israel (grant 748/14), Marie Curie integração conceder (CIG) - FP7-pessoas-20013-CIG-618763 e eu-núcleo programa de planejamento e orçamento do Comité e o Israel Science Foundation concedem n º 41/11.

todos os procedimentos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Bar Ilan e o protocolo segue as orientações fornecidas pelo Comitê aprova os experimentos.
 1. purificação da ingenuidade humana células CD4 + e polarização para T Helper 1 (Th1) e células Th2 Nota: Aqui descrevemos o procedimento a partir de células mononucleares de sangue periférico humano congelado (PBMC). O primeiro passo consiste em isolar as células CD4 + usando microbeads e colunas que normalmente dão-nos mais do que 95% das células CD4 +. No entanto, esta etapa pode variar de acordo com o protocolo preferido em cada laboratório. O protocolo para a ativação de células T e polarização foi modificado de Jenner et al (2009) 18. isolamento de CD4 + células de 10 milhões PBMCs dá origem a 4 milhões de células CD4 +. Eles são divididos em dois balões e cultivados em células Th1 e Th2 polarizador condições rendendo as células Th1 e Th2 3 milhões em apenas uma semana.
 Nota: arrefecer o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar.
<ol><li>Descongelar 1 mL de PBMC humano (10 7 células) em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio RPMI suplementado com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino. Centrifugar a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com uma pipeta estéril 25 mL em 15 mL de meio RPMI completado. Transferir as células (com pipeta estéril 25 mL) para um frasco de cultura T75.</li>
	<li>Deixar as células durante a noite em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO 2).</li>
	<li>Transferir as células flutuantes com uma pipeta estéril 25 mL para tubo de 50 mL. Determinar o número de telemóvel e viabilidade pela exclusão trypan azul.</li>
	<li>Células isolar CD4 + de 10 milhões vive não-aderente PBMC por selecção positiva usando colunas de acordo com o fabricante e CD4 + microbeads &#39; recomendações de s (veja a Tabela de materiais e equipamentos) com o seguinte modificações: 10 7 PBMCs são rotulados com 30 µ l de CD4 microbeads em 120 µ l de BSA de 0,5% em PBS.</li>
	<li>Ativar as células T CD4 + para 72 h por rhIL-2 (10 ng/mL), ligados a placa anti-CD3 (5 µ g/mL) e anti-CD28 solúvel (2 µ g/mL). Para a polarização Th1, adicione rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Para a polarização de Th2, adicionar rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).</li>
	<li>Cultura de células para adicionais 7 dias na presença de rhIL-2 (10 ng/mL) e as mesmas citocinas polarizadores (rhIL-12 para Th1 e rhIL-4 para Th2).</li>
</ol> 2. Isolamento de núcleos Nota: ATAC-seq é executada com núcleos intactos. Lise tampão contendo 0.05% nonilfenil polietilenoglicol (ver Tabela de materiais e equipamentos) foi calibrado para isolar núcleos de células Th1 e Th2 de humano primários. É recomendável calibrar este passo com os reagentes de laboratório e células. Um excesso de células intactas de insuficiente detergente diminui a eficiência da reação de transposição. Eficiência de lise celular é determinada pelo número de núcleos (células positivas de trypan azul) em relação ao número total de células. 
Nota: Prepare o tampão de lise (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl 2). Arrefecer uma centrífuga com um rotor de balanço-balde de 4 ° C. as células em uma centrífuga de balanço-balde em vez de uma centrífuga de ângulo fixo de granulação reduz a perda de células/núcleos. Para evitar núcleos ou perda de celular, pipeta com cuidado ao descartar o sobrenadante.
<ol><li>Adicionar nonilfenil fresco polietilenoglicol (para obter uma concentração final de 0.05%) e 100 x inibidores de protease (para obter uma concentração final de 1-x) para o frio do lysis imediatamente antes do uso. Mantenha o buffer no gelo</li>
	<li>Células Count T para determinar sua quantidade e viabilidade usando trypan azul método. Viabilidade que seja inferior a 90% de resultados na maior digestão específico.</li>
	<li>Transferência de 0,5 x 10 6 T células (células Th1 ou Th2) para microtubos de 1,5 mL. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) solução fria. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão de Lise fria (contendo nonilfenil polietileno glicol e inibidores da protease). Mantenha o tubo no gelo. Pipeta suavemente para não perturbar os núcleos.</li>
	<li>, Rapidamente, Pegue 10 µ l e conte as células com um contador de célula automatizada enquanto o microtubo com lisados células está no gelo. Esta etapa não deve exceder cinco minutos para não danificar os núcleos. Pelo menos 80% das células deve ser lysed.</li>
	<li>Continuar imediatamente com a reação de transposição. Manter os núcleos preparados sobre o gelo</li>
</ol> 3. Reação de transposição Nota: nesta etapa, núcleos isolados são incubados com procarióticas Tn5 transposase (TDE1) carregado com adaptadores para sequenciamento NGS. Tn5 hiperativo, simultaneamente, fragmentos de DNA e ligates adaptadores em acessíveis regiões do genoma (processo tagmentation). A relação entre núcleos e Tn5 transposase é crítica para clivagem preferencial na cromatina acessível. Este protocolo é calibrado para 100.000 núcleos em um volume de reação de 100 μL. No entanto, a reação pode ser escalada para baixo.
<ol><li>Definir a temperatura em uma coqueteleira térmica a 37 ° C.</li>
	<li>Núcleos de 100.000 transferir para um microtubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar 500 x g por 10 min a 4 ° C e delicadamente Retire o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar os componentes de reação de transposição para os núcleos especificados no quadro 1.</li>
	<li>Resuspenda pipetando gentil.</li>
	<li>Incubar a reação de transposição em uma coqueteleira térmica a 37 ° C por 30 min com leve agitação (500 rpm). 
	Nota: A limpeza de DNA é executada por fase sólida reversível imobilização grânulos 19 (ver Tabela de materiais e equipamentos) ou colunas de purificação do PCR. No final da limpeza, eluir os fragmentos de DNA em 20 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar o EDTA no buffer de eluição.</li>
</ol> 4. Enriquecimento de PCR das bibliotecas ATAC-seq Nota: esta etapa destina-se a amplificar os ATAC-seq biblioteca ou seja, fragmentos de DNA com adaptadores inseridos. Para permitir a mistura de várias bibliotecas de ATAC-seq na pista mesmo sequenciamento de nova geração (&#34; multiplexação &#34;) uso unindexed Primer 1 (Ad1_noMx) 1 para todas as amostras, e uma diferente indexados (código de barras) 2 Primer (Ad 2.1-2,24) 1 para cada amostra. As sequências de primeira demão são fornecidas no complementado Tabela de materiais e equipamentos.
<ol><li>Amplificação por PCR inicial Nota: A concentração de trabalho de Primer 1 (Ad1_noMx) e Primer 2 é de 25 µM. Todos os primers são diluídos do estoque original de 100 µM para 25 µM. Em todas as reações de PCR, use Primer 1 (Ad1_noMx) e apenas um do indexado 2 Primer.
	<ol><li>Adicionar os componentes da reação de PCR como especificado na tabela 2, a um tubo estéril de PCR.</li>
		<li>Lugar PCR do tubo em um termociclador e realizar a amplificação por PCR usando as ciclismo condições detalhadas na tabela 3.</li>
	</ol></li> <li>Avaliação do número de ciclos de amplificação adicional Nota: O número de ciclos PCR adicionais deve produzir quantidade suficiente de biblioteca fragmentos fou um sequenciamento de próxima geração bem sucedido executado, enquanto minimizado para evitar GC e dimensionar o viés 20. A determinação do número de ciclos PCR (N) necessário para amplificação de fragmento de biblioteca ideal é feita por PCR quantitativo (qPCR).
	<ol><li>Diluir 1 de Primers (Ad1_noMx) e 2 (usado para a amplificação da biblioteca inicial) de 25 µM a 6,25 µM.</li>
		<li>Adicionar os componentes ópticos da polimerase ou uma placa, como indicado na tabela 4.</li>
		<li>Lugar em um instrumento de qPCR e ciclo como especificado no quadro 5.</li>
		<li>Para estimar o número necessário de ciclos de amplificação adicional (N), lote número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y.</li>
		Ciclos de <li>o número de amplificação adicional (N) é 1/3 do número de ciclos em que a reação de qPCR alcançado o planalto. a Figura 2 fornece exemplos para três bibliotecas ATAC-seq patamar no ~ 2.350 unidades de fluorescência relativo, RFU (linha grossa verde). O número de ciclos PCR, em que um terço da quantidade máxima (RFU 783, marcado no eixo y) é amplificado corresponde a 8 ciclos por duas das bibliotecas (curvas de amplificação de vermelho e azul) e 9 ciclos PCR para a biblioteca de terceiro (rosa).</li>
	</ol></li> <li>Amplificação por PCR final <ol><li>amplificar o restante µ 45 l da reação de PCR. Coloque um tubo PCR contendo a reação de amplificação da etapa 4.1.2 em um termociclador. Execute o programa PCR descrito na tabela 6. Use o número de ciclos de amplificação (N) previamente determinado (etapa 4.2.5).</li>
	</ol></li></ol> 5. Seleção de ATAC-Seq bibliotecas do tamanho Nota: na nossa experiência, seleção de tamanho de amplificado ATAC-seq bibliotecas melhora os resultados de sequenciamento de próxima geração porque elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular da final biblioteca ATAC-seq. 
Nota: Permitir que os grânulos magnéticos aquecer a temperatura ambiente 30 min antes do uso. 
Prepare-se fresco 70% de etanol em água livre de nuclease.
<ol><li>Resuspenda os grânulos magnéticos misturando.</li>
	<li>Adicionar água nuclease-livre para as bibliotecas de ATAC-seq (obtidas na etapa 4.3.1.) e levar até 100 µ l.</li>
	Adicionar 50 µ l de <li>(0.5 x) de ressuspensão grânulos magnéticos do DNA-ligando a 100 µ l de bibliotecas amplificadas. Misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Incube as amostras por 5 min à temperatura ambiente. Se necessário, girar rapidamente para baixo os microtubos.</li>
	<li>Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado por 2 min separar as esferas magnéticas do sobrenadante. Depois de 2 min, transfira o sobrenadante para um microtubo novo.</li>
	<li>Medir o volume do líquido sobrenadante pipetando e adicionar 0,7 x de grânulos magnéticos. Mix pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.</li>
	<li>Incubar 5 min à temperatura ambiente. Lugar num suporte magnético para 2 min.</li>
	<li>Após o 2 min incubação, desprezar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l acabadas etanol a 70% para lavar os grânulos quando os tubos forem depor magnético.</li>
	<li>Manter o microtubo sobre o ímã por 30 s e depois descartar o etanol. Repita a etapa 5.7.for duas lavagens de etanol final.</li>
	<li>Remover completamente o restante do etanol e deixe que os grânulos secar ao ar por 5 min enquanto o tubo é sobre o ímã. Se necessário, gire brevemente o microtubo. Remover os vestígios de álcool etílico com uma ponta de pipeta p10.</li>
	<li>Remover o microtubo de ímã e adicione 22 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Não eluir as ATAC-seq bibliotecas em tampão contendo EDTA.</li>
	<li>Incubar o tubo para 2 min à temperatura ambiente e coloque sobre o suporte magnético.</li>
	<li>Quando a solução é clara, 20 µ l de eluted bibliotecas de transferência para um novo microtubo estéril.</li>
	<li>Loja do tamanho selecionado ATAC-seq bibliotecas em -20 ° C.</li>
</ol> 6. Análise da qualidade das bibliotecas ATAC-Seq <ol><li>validação da qualidade da ATAC-seq bibliotecas por PCR em tempo real Nota: é importante avaliar a relação sinal / ruído das bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração sequenciamento. Isso é feito, determinando a quantidade relativa de fragmentos de DNA de loci acessível e inacessível usando PCR quantitativo (qPCR). Os loci inacessível (controlo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) são amplificados por pares da primeira demão, 1 e 2. Os loci acessível (controle positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) são amplificados por pares da primeira demão, 3 e 4. Positivos e negativos de loci foram definidos a partir de perfis de acessibilidade (DHS-seq) cromatina das células humanas CD4 + (ENCODE adesões ENCSR000EQE e ENCSR000EQG). Primeira demão negativo 1 situa-se em uma grande região intergênica heterocromático (230 kb de TRADB2 e 88 kb de FOXD2). Região de controle negativo, 2 é dentro o primeiro intron do gene CDC73. Positivo par de primer 3 está dentro de uma região de cromatina aberta a jusante do gene E Cyclin (CCNE1) ao par de primer positivo 4 é centralizada dentro do promotor da proteína quinase C substrato 80K-H (PRKCSH). Importante, estes loci de controle mostra um padrão semelhante de acessibilidade em outros tipos de células humanas do ENCODE projeto 3, sugerindo que eles podem ser aplicados para monitorar ATAC-seq bibliotecas de um amplo espectro de tipos de células humanas. Cartilha eficiência e especificidade de todos os pares da primeira demão foi verificado por qPCR em uma diluição serial do DNA genômico (a partir de células humanas de Th) e uma análise de curva derretimento dos obtidos produtos amplificados.
	<ol><li>Isolar o DNA genômico, usando um comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais e equipamentos).</li>
		<li>Diluir o ATAC-seq amplificado biblioteca 01:10 (1 µ l biblioteca + 9 µ l de água livre de nuclease) e o DNA genômico de ~ 5 ng / µ l.</li>
		<li>Preparar a mistura de reacção (tabela 7) para cada par de primer de controlo positivo e negativo, tendo em conta que as reações são realizadas em triplicata.</li>
		<li>Incubar em termociclador qPCR, de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor de mestre mistura qPCR.</li>
		<li>Analisar os resultados em instrumento de qPCR &#39; software s (consulte a Tabela de materiais e equipamentos). Escolha o DNA genômico como uma amostra de controle. Os valores obtidos representam um enriquecimento das regiões acessíveis (amplificados pelos iniciadores de controle positivo). Um exemplo é mostrado na tabela 8. 
		Nota: Estimativa do tamanho médio de biblioteca e concentração: a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA de bibliotecas ATAC-seq é determinada por sistemas automatizados electroforese de alta sensibilidade, de acordo com o fabricante &#39; instruções s. É aconselhável medir a concentração da amostra em um dados usando o kit de alta sensibilidade de dsDNA e pelo menos 2 µ l de cada amostra de DNA. 
		Nota: Sequenciamento de próxima geração - antes da multiplexação as bibliotecas, calcule a molaridade de cada biblioteca ATAC-seq usando a fórmula: (ng / µ l x 10 6) / (comprimento do fragmento de 660 x biblioteca média). Mire &#62; 30 milhões leituras de cada biblioteca ATAC-seq para avaliar aberta da cromatina regiões de amostras humanas. Se você quiser determinar se a biblioteca é bom o suficiente para o sequenciamento de NGS, inicialmente, Mire lê 10 milhões (5% da faixa de sequenciamento em instrumento de sequenciamento de DNA no modo de execução rápido). Tenha em mente que para inferir nucleossoma posicionamento, sequenciamento emparelhado-final é necessário 1.</li>
	</ol></li></ol> 7. Análise dos resultados obtidos Next-Generation sequenciamento <ol><li>inferir a qualidade do sequenciamento diz inspecionando os arquivos FastQC, separadamente para cada biblioteca.</li>
	<li>Alinhar o lê a referência humana do genoma (conjunto hg19) usando Bowtie 21 software em ambiente Unix/Linux. O comando é &#39; bowtie -m 1 - q -S genoma diretório reads.fastq output_aligned.sam &#39;. Diretório de genoma representa a pasta onde os índices de genoma de gravata são armazenados. O parâmetro -m 1 é para não permitir o alinhamento de leituras para mais de um locus no genoma, - q é para o arquivo de entrada deve estar no formato fastq, destina-se a saída que está no formato de SAM -S.</li>
	<li>Remover duplicadas leituras usando SAMtools 22 rmdup opção no ambiente Unix/Linux. Os comandos são &#39; samtools Ver os output_aligned.sam -b -S | samtools classificar -o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. O primeiro comando, vista, altera o formato de SAM em formato BAM, que é então classificado. A opção de rmdup é então aplicada sobre o arquivo BAM classificado. Opcionalmente, um pode ajustar as leituras para o local de inserção do transposon, conforme descrito na ATAC-seq original papel 1. Isso é feito usar BEDtools comandos 23 no ambiente Unix/Linux. Os comandos são &#39; bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed -i output_aligned genoma do _rmdup.bed -p - m-5 - 4G &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. O primeiro comando, bamTobed, altera o formato BAM em formato de cama, que pode ser usado para o comando shiftBed. O arquivo do genoma é um arquivo delimitado por tabulação que contém o comprimento de cada cromossomo no genoma. O arquivo é adicionado geralmente no diretório BEDtools.</li>
	Chamada de pico <li>Executar usando análise baseada em modelo de ChIP-seq (MACS2) 24 software no ambiente Unix/Linux no arquivo deslocado de cama, com os seguintes parâmetros: - nomodel - extsize 75-- shift -30. Esses parâmetros são usados para ajustar as leituras para que o local de inserção do transposon é no meio de cada leitura do sequenciamento.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo de ATAC-seq descrito aqui tem sido empregado com sucesso para a análise da cromatina acessível em células primárias (humano Th1, Th2 pilhas e pilhas de B) bem como as linhas de células cultivadas (células de câncer de mama humano MCF10A e células de glioblastoma U261). Aplicação de ATAC-seq para outros tipos de células pode exigir alguma otimização de protocolo, especialmente na etapa de Lise. Se a concentração de detergente não-iônico é muito alta, pode haver um maior percentual de contaminação de DNA mitoco...

ATAC-seq1,2 é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar3 e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II1. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial para decifrar os mecanismos que regem o Regulamento transcriptional em qualquer tipo de célula de interesse. Descrevemos a adaptação da ATAC-seq para as células Th1 e Th2 humanas primárias.
Na ATAC-seq, hiperativo Tn5 transposase carregado com adaptadores para sequenciamento de próxima geração (NGS) fragmentação de DNA de casais com marcação de DNA com adaptadores (ou seja, o processo de "tagmentation")1. Após amplificação por PCR, as bibliotecas de DNA resultantes estão prontas para a próxima geração sequenciamento (Figura 1). O tagmentation preferencial da cromatina acessível é detectado pela análise de enriquecimento local de leituras de sequenciamento ATAC-seq.
O procedimento experimental curto e exigência de menos matérias-primas, em relação a outros métodos para medir a acessibilidade da cromatina e posicionamento de partícula como de DNase-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, tem promoveu o uso de ATAC-seq em vários sistemas biológicos, incluindo células humanas primárias1,7 e amostras clínicas8, bem como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de fruta11 e vários mamíferos12.
A identidade da transcrição de fatores que estão ligados a loci acessível podem ser descobertos por analisar o enriquecimento de seus motivos de sequência de ligação ou combinando ATAC-seq com imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida de alta produtividade (de sequenciamento de DNA ChIP-seq). Essa abordagem permitiu a identificação de fatores de transcrição de linhagem-específicos importantes para hematopoiese em rato13. A natureza global e imparcial da ATAC-seq permite estudar a regulação gênica em organismos para os quais reagentes tais como anticorpos para análise de ChIP não estão disponíveis. Por exemplo, evolutivas variações no cis-regiões reguladoras foram identificadas pelo estudo craniana crista neural células de seres humanos e os chimpanzés14, variações do desenvolvimento em elementos reguladores durante o início do mouse embriogénese15, mudanças na paisagem regulamentar durante um ciclo de vida de unicelulares owzarzaki c.9e a evolução dos promotores e potenciadores em toda espécie de mamífero 2012.
ATAC-seq também tem sido fundamental para medir a acessibilidade de cromatina em células individuais, assim revelando variabilidade dentro das populações de células, que normalmente evita todo o genoma estudos7,16. Além disso, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças que ocorrem em regiões reguladoras de DNA em condições de doença, em que as amostras são raras. Por exemplo, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças na paisagem regulamentar durante o início da leucemia mieloide aguda (LMA)17 ou Ras-conduzido mixomas11.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 25 mL</td><td>Corning Costar</td><td>4489</td><td>Podem ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado</td><td>Countes Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tecido</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares de sangue periférico&nbsp;( PBMC)</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; PCS&shy; 800 e tímido; 011</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina (200 mM)</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>03-020-1B</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>03-031-1B</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS),&nbsp; Inativado por calor, Indústrias</td><td>Biológicas</td> de Grau Europeu <td>04-127-1</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Microesferas MACS CD4, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>Controle de Isotipo IgG1 de Mouse FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28 SAFIRE Purified</td><td>Biogems</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>IL2 Humano Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL4 Humano Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>IL12 Humano Recombinante p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; TIFN-&gama anti-humano purificado;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, grau analítico</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio, hexahidratado, grau de biologia molecular</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Tris, ultra puro, 99,9% puro</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Alternativa NP-40 (Polietilenoglicol Nonilfenil)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>este coquetel inibidor de protease é um pó. Para fazer 100 x solução diluída em 1 mL de água de grau de biologia molecular.</td></tr><tr><td>Grânulos de imobilização reversa de fase sólida magnética: Grânulos AMPure XP</td> Kit de purificação PCR <td>Beckman</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Kit de Preparação para Biblioteca de DNA Nextera (TDE1 transposase e tampão TD)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBPróximo de Alta Fidelidade 2 x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBPróximo Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CFX Connect PCR em Tempo Real&nbsp; Detecção&nbsp; Sistema</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>master mix para qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Ímã para tubos eppendorf</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Centrífuga de resfriamento de balde oscilante com os baldes para tubos falcon de 15 mL e tubos eppendorf</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>Pode ser de outros fornecedores. É importante que tenha baldes para tubos eppendorf.</td></tr><tr><td>Termo-agitador</td><td>MRC</td><td></td><td>Pode ser de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Fita de Tela D1000 de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes D1000 de Alta Sensibilidade</td><td>Sistema TapeStation Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 Plataforma</td><td></td><td></td><td>baseada em fita G2991AA para eletroforese</td></tr><tr><td>Kit de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Reagente para Análise TapeStation de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Nome e sequência do primer</td> Ad1_noMX <td>da empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad1-noMx: 5'-P5 sequência-transposase sequência-3'Ad2.1_TAAGGCGA</td></tr>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.1_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.2_CGTACTAG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.2_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.3_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.4_TCCTGAGC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.4_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.5_GGACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.5_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.6_TAGGCATG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.6_expected sequência índice leia: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.7_CTCTCTAC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.7_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.8_expected sequência índice leia: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.9_GCTACGCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.9_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.10_CGAGGCTG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.10_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.11_AAGAGGCA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.11_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.12_GTAGAGGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.12_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.13_expected sequência índice leia: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.14_ACCACTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.14_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.15_TGGATCTG</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.15_expected sequência índice: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.16_CCGTTTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.16_expected sequência índice leia: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.17_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência transposase-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.18_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.19_AGGTTGGG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.19_expected sequência índice lida: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.20_expected sequência índice leia: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência de transposase-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.21_expected sequência índice leia: 5'-P7 sequência-[sequência índice]-sequência transposase-3'Ad2.22_TGGTCACA</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.22_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.23_TTGACCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.23_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'Ad2.24_CCACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.24_expected sequência índice lida: sequência 5'-P7-[sequência índice]-sequência de transposase-3'F1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos t humana primária pela atac-seq

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.

O resultado final do presente protocolo é uma biblioteca de ATAC-seq de normalmente 3-20 ng / µ l. Quando executado em um sistema para análise de integridade de DNA (ver Tabela de materiais e equipamentos), eles mostram a escada-como a aparência2 (Figura 3A). O tamanho médio dos fragmentos de DNA é tipicamente ~ 450-530 bp.
Controle de qualidade adequado das ...

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

O objetivo geral deste método de alto rendimento usando transposase é identificar regiões de cromatina acessíveis no genoma humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos epigenômicos, como localizações de elementos reguladores em todo o genoma. As principais vantagens desta técnica são que ela é robusta, relativamente curta e requer menos material de partida em relação a outros métodos de medição da acessibilidade da cromatina, como DNase-seq ou FAIRE-seq.Embora esse método possa fornecer informações sobre o cenário regulatório dos linfócitos T humanos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras células primárias humanas, células cancerígenas, amostras clínicas humanas, células de outros mamíferos e organismos. Descongele uma alíquota de um mililitro de 10 milhões de PBMCs humanos e transfira-a para um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI suplementado. Eles, centrifugam as células a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mililitros de meio RPMI suplementado. Em seguida, transfira as células para um frasco de cultura T-75 e incube-as durante a noit

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Descrevemos aqui uma abordagem relativamente rápida e simples para mapear o tempo de replicação de mamíferos em todo o genoma, desde o isolamento celular até a análise básica dos resultados do sequenciamento. Um mapa genômico de um programa de replicação representativo será fornecido seguindo o protocolo.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Aprenda a executar ATAC-seq em linfócitos T humanos primários para mapear regiões cromatínicas acessíveis. Este método robusto requer pouco material inicial e revela o panorama regulatório do genoma.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

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