Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

O objetivo geral deste método de alto rendimento usando transposase é identificar regiões de cromatina acessíveis no genoma humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos epigenômicos, como localizações de elementos reguladores em todo o genoma. As principais vantagens desta técnica são que ela é robusta, relativamente curta e requer menos material de partida em relação a outros métodos de medição da acessibilidade da cromatina, como DNase-seq ou FAIRE-seq.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o cenário regulatório dos linfócitos T humanos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras células primárias humanas, células cancerígenas, amostras clínicas humanas, células de outros mamíferos e organismos. Descongele uma alíquota de um mililitro de 10 milhões de PBMCs humanos e transfira-a para um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI suplementado. Eles, centrifugam as células a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mililitros de meio RPMI suplementado. Em seguida, transfira as células para um frasco de cultura T-75 e incube-as durante a noite com umidificação. No dia seguinte, transfira as células flutuantes com uma pipeta estéril de 25 mililitros para um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, conte as células vivas usando a exclusão de azul de tripano. Em seguida, isole as células CD4 positivas de 10 milhões de PBMCs vivas e não aderentes usando uma coluna de separação de microesferas. Uma vez que as células são isoladas, placa e ative as células T em condições de polarização Th1 e Th2 de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, isole seus núcleos.

Para ser, prepare um novo tampão de lise e mantenha-o resfriado no gelo. Além disso, em preparação para a reação de transposição, aqueça um agitador térmico a 37 graus Celsius. Em seguida, carregue meio milhão de células T em microtubos de 1,5 mililitro e gire-os a 500 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave as células com um mililitro de PBS frio e repita o ciclo de centrifugação, mas agora suspenda as células em um mililitro de tampão de lise fria. Misture as células com pipetagem suave para evitar que os núcleos sejam muito interrompidos. Em seguida, pegue rapidamente alíquotas de 10 microlitros para observar a fração de células.

Certifique-se de manter as células frias e trabalhar rapidamente. Dentro de cinco minutos, prossiga com a reação de transposição. Para começar, transfira 100.000 núcleos para um microtubo de 1,5 mililitro e gire a amostra a 500 Gs por 10 minutos em uma centrífuga fria.

Em seguida, remova suavemente o sobrenadante. Em seguida, adicione os componentes da reação de transposição aos núcleos. Em seguida, ressuspenda os núcleos com pipetagem suave e incube os núcleos no agitador térmico a 500 RMP por 30 minutos para completar a reação de transposição.

Em seguida, execute uma etapa de limpeza do DNA e elua os fragmentos de DNA em 20 microlitros de cloridrato de Tris. Em seguida, use um PCR para fazer uma amplificação inicial das bibliotecas de sequenciamento ATAC. Em seguida, avalie o número ideal de ciclos adicionais necessários para a amplificação final por PCR quantitativo.

A partir dos resultados medidos, determine o número de ciclos necessários para a amplificação final por PCR das bibliotecas de sequenciamento ATAC. Em seguida, execute a amplificação final. A configuração de um tamanho ideal de fragmentos de biblioteca de DNA pode melhorar o sequenciamento da próxima geração.

Primeiro, aqueça as esferas magnéticas à temperatura ambiente e prepare etanol fresco a 70% em água sem nuclease. Em seguida, adicione água livre de nuclease às bibliotecas de sequenciamento ATAC para um volume de 100 microlitros. Em seguida, adicione 50 microlitros de esferas magnéticas de ligação ao DNA ressuspensas.

Pipete as esferas no DNA pelo menos 10 vezes e espere cinco minutos. Se alguma gota de contas ficar presa na parede ou na tampa do tubo, gire brevemente o tubo. Agora, coloque a amostra ao lado do ímã por dois minutos e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo microtubo.

Meça o volume da coleção e adicione um volume de 70% de suspensão de esferas magnéticas. Misture as contas como antes e deixe-as incubar por cinco minutos antes de prosseguir. Em seguida, separe as contas usando o ímã por dois minutos e agora descarte o sobrenadante.

Ainda contra o ímã, adicione 200 microlitros de etanol a 70% às contas. Aguarde 30 segundos, descarte o etanol e repita a lavagem com etanol mais uma vez. Termine as lavagens removendo completamente o etanol restante e deixando as esferas secarem ao ar por cinco minutos no ímã.

Se necessário, gire brevemente o tubo e aspire qualquer etanol visível com uma pipeta de 10 microlitros. Agora, remova o tubo do ímã e adicione 22 microlitros de cloridrato de Tris. Após dois minutos, retorne o tubo ao suporte magnético e deixe a solução limpar.

Em seguida, colete 20 microlitros de eluato contendo a biblioteca preparada e armazene-a a menos 20 graus Celsius. Este protocolo produz bibliotecas de sequenciamento ATAC que normalmente são de três a 20 nanogramas por microlitro. Quando executados em um sistema para análise de integridade do DNA, eles têm uma aparência semelhante a uma escada.

Entre outros, outro controle de qualidade importante é o enriquecimento dos controles positivos. Em relação aos controles negativos, o par de primers três deve ser enriquecido pelo menos 25 vezes e o par de primers quatro deve ser enriquecido pelo menos 75 vezes. Após 10 milhões de leituras iniciais, se a amostra passar por todos os parâmetros cruciais no arquivo de relatório FastQC e 1.000 a 2.000 picos forem obtidos a partir de chamadas de pico, a biblioteca poderá ser sequenciada mais profundamente para mais de 30 milhões de leituras.

De bibliotecas que atendem aos padrões de qualidade, apenas seis a 20% das leituras são mapeadas para o genoma mitocondrial. As leituras únicas restantes mapeiam para o genoma humano de referência e sete a 12% estão dentro dos picos de sequenciamento ATAC. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer bibliotecas ATAC-seq, enviar e fornecer sequenciamento de ração e analisar os dados obtidos.

Uma vez dominada, a preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser feita em um ou dois dias úteis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que talvez você precise primeiro otimizar algumas etapas, como o número de células e a composição do tampão de lise em uma etapa de isolamento de núcleos. Após este procedimento, outros métodos, como a imunoprecipitação da cromatina, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual fator de transcrição se liga às regiões abertas da cromatina nas amostras examinadas?