Deteção do potencial de membrana mitocôndria para estudar CLIC4 HN4 induzida em Knockdown celular apoptose em Vitro

Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo citobiológico, incluindo a compreensão da apoptose e da disfunção mitocondrial. A principal vantagem dessa técnica é que os investigadores podem conduzir de maneira fácil e adequada o monitoramento em tempo real do potencial de membrana mitocondrial via rodamina-123 dentro de uma única célula. Cultive uma linhagem celular HN4 de carcinoma escamoso de células de cabeça e pescoço, conforme descrito no protocolo de texto.

Um dia antes da transfecção, coloque 0,5 milhão de células em dois mililitros por poço de meio de cultura sem antibióticos em placas de seis poços. Dilua suavemente 100 picomoles de RNA interferente pequeno CLIC4 ou RNA interferente pequeno embaralhado em 250 microlitros de meio de soro reduzido. Em seguida, dilua cinco microlitros de reagente lipossomal em 250 microlitros de meio de soro reduzido e incube por cinco minutos.

Combine o pequeno RNA interferente diluído com o reagente lipossomal diluído e misture suavemente. Adicione a mistura a cada poço contendo células no meio. Misture delicadamente balançando o prato para frente e para trás.

Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2. Substituir o meio por meio de crescimento normal quatro horas após a transfecção. Continue a incubar as células por mais 20 horas antes de prosseguir com o procedimento de marcação da rodamina-123.

Após o tratamento com RNA interferente pequeno CLIC4 de células HN4 em placas de seis poços, use uma pinça para colocar lamínulas circulares no fundo de novas placas de 12 poços. Pipete 150 microlitros de 100 microgramas por mililitro de polilisina no meio de cada lamínula dentro das placas de 12 poços. Após dois minutos, remova completamente a polilisina com pipetador.

Em seguida, remova o meio de cultura das células HN4 dentro do prato e adicione um mililitro de 0,25% de tripsina para separar as células. Após seis minutos, adicione dois mililitros de meio de cultura para neutralizar a tripsina. Misture delicadamente as células HN4 com pipeta cinco vezes e semeie as células em lamínulas circulares.

Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO2. Após oito horas de incubação, adicione dois micromoles por litro de rodamina-123 e misture suavemente o meio para cima e para baixo várias vezes para garantir uma distribuição uniforme no meio. Incube as células HN4 por 40 minutos a 37 graus Celsius.

Use uma pinça para remover as lamínulas e transfira-as brevemente para o tampão NPSS pré-aquecido para lavar o líquido restante. Coloque as lamínulas no fundo da câmara de aço inoxidável de 500 microlitros com um fundo de lamínula de vidro substituível de 25 milímetros selado no lugar por um O-ring. Fixe as lamínulas no lugar apertando a tampa da câmara.

Adicione 450 microlitros de tampão NPSS pré-aquecido à câmara montada. Em seguida, coloque o banho sob o campo visual do microscópio de fluorescência ou microscópio de fluorescência de varredura a laser confocal. Ligue o microscópio de fluorescência seguindo as instruções do fabricante.

Abra o software do sistema de imagem e selecione o novo botão na barra de comandos para iniciar um novo experimento. Ajuste o campo visual e o foco para encontrar a localização das células na luz branca. Em seguida, desligue a luz e aperte o botão para fechar a luz branca.

Clique no botão de foco na barra de comandos e selecione iniciar foco para ativar a fluorescência. Encontre a localização das células novamente através do microscópio com uma excitação de 507 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 529 nanômetros de passagem longa. Ajuste o campo visual e foque novamente, se necessário.

Selecione um campo visual contendo apenas 20 a 30 células HN4 separadas. Assim que um campo visual claro for alcançado, clique em fechar foco na barra de foco. Em seguida, clique em adquirir um na barra de comandos para adquirir um conjunto de imagens.

Em seguida, clique em regiões na barra de comandos e clique no botão OK para editar as regiões de medição. Para ajustar diferentes formas de células individuais, selecione a ferramenta de região de rastreamento. Circule a região de uma única célula e clique duas vezes quando terminar.

Repita o procedimento até que todas as células estejam circuladas. Clique em concluído e selecione salvar imagens para encontrar o local salvo. Clique em relógio zero e pressione rapidamente F4 para começar a monitorar a mudança de intensidade de fluorescência.

Registre a mudança em tempo real da intensidade da fluorescência uma vez a cada cinco segundos por cinco minutos. Quando a linha de base se tornar estável, adicione 50 microlitros de NPSS misturados com 0,5 microlitros de 100 milimoles por litro de ATP à câmara via pipetador. Ligue o microscópio confocal de fluorescência de varredura a laser seguindo as instruções do fabricante e abra o software incluído.

Clique na objetiva no menu de aquisição para selecionar a lente objetiva de óleo de abertura numérica 63X 1.4. Observe a amostra e encontre um campo visual claro sob o campo de luz. Pressione o botão de seleção de luz para alternar para o modo de fluorescência e selecione os filtros de fluorescência corretos para encontrar a localização da célula na escuridão por meio do microscópio.

Empurre o obturador para proteger a amostra quando a observação terminar. No menu Adquirir, ajuste o canal PMT adequado e clique em alcançar para ativar o caminho óptico estabelecido. Clique no menu de configuração e escolha laser para determinar o tipo de laser necessário.

Clique ao vivo para obter imagens em tempo real e certifique-se de que o campo visual contenha apenas 20 a 30 células HN4 separadas. Em seguida, selecione XYT no modo de aquisição no submenu de aquisição no menu de aquisição. Defina cinco segundos para o intervalo de tempo e 20 minutos para a duração.

Clique em aplicar quando todos os parâmetros forem liquidados. No menu quantificar, use a ferramenta desenhar polilinha para circular a área de gravação de cada célula. Selecione o perfil da linha e escolha começar a realizar a observação.

Registre a mudança em tempo real da intensidade de fluorescência por cinco minutos. Quando a linha de base se tornar estável, adicione 50 microlitros de NPSS misturados com 0,5 microlitros de 100 milimoles por litro de ATP à câmara por meio de um pipetador. Para realizar a análise estatística usando um microscópio de fluorescência comum, abra o software do sistema de imagem e selecione o botão Abrir na barra de comandos para abrir um experimento salvo.

Clique em regiões na barra de comandos e clique no botão OK para editar as regiões de medida. Selecione a ferramenta de região de rastreamento. Circule a região de uma única célula e clique duas vezes quando terminar.

Repita o procedimento até que todas as células tenham sido circuladas. Clique em concluído e selecione o botão F4 para avançar para obter um traço mostrando a intensidade da fluorescência. Quando terminar, clique no botão de seta para baixo localizado no canto inferior direito do gráfico e clique em mostrar dados do gráfico.

Clique em OK duas vezes e escolha o botão de dados de log para abrir a interface do software de processamento de dados. Em seguida, clique em registrar dados novamente para localizar os registros de flutuação em tempo real da intensidade de fluorescência que aparecem na planilha. Aqui são mostrados resultados representativos que mostram alterações induzidas por ATP da despolarização mitocondrial na célula HN4 sob diferentes intervenções, conforme resolvido por microscopia de fluorescência comum.

A despolarização da membrana mitocondrial aumentou rapidamente após o tratamento com ATP e gradualmente se recuperou para o nível normal em ambos os grupos. Traços representativos da intensidade fluorescente da rodamina-123 demonstram que o tratamento com MMP do pequeno RNA interferente CLIC4 aumentou a despolarização mitocondrial quando comparado ao grupo controle. Um histograma representativo revelou ainda que o knockdown de CLIC4 aumentou a despolarização mitocondrial em comparação com o grupo controle.

Aqui, os resultados representativos da microscopia confocal de varredura a laser também mostram alterações induzidas por ATP da despolarização mitocondrial na célula HN4 sob diferentes intervenções. A despolarização da membrana mitocondrial aumenta rapidamente após o tratamento com ATP e gradualmente se recupera ao nível normal em ambos os grupos. Traços representativos da intensidade fluorescente da rodamina-123 demonstram que o tratamento MMP do RNA interferente pequeno CLIC4 aumentou a despolarização mitocondrial em comparação com o grupo controle.

Da mesma forma, o histograma representativo revelou ainda que o knockdown de CLIC4 aumentou a despolarização mitocondrial em comparação com o grupo controle. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma melhor compreensão de como usar a rodamina-123 para realizar o monitoramento em tempo real do potencial da membrana mitocondrial por microscopia de fluorescência normal e microscopia confocal de varredura a laser. Uma vez dominada, esta técnica de microscopia com rodamina-123 pode ser feita em menos de 20 minutos para uma amostra, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não fazer nenhum contato com a câmara durante a injeção enquanto aguarda o processo de digitalização. Após este procedimento, outros métodos como Western Blot e citometria de fluxo podem ser realizados para responder a outras perguntas, como se ocorreu apoptose ou necrose. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo da ciência viva explorarem a disfunção mitocondrial e encontrarem evidências sólidas de apoptose celular em várias células vivas.

Não se esqueça de que trabalhar com rodamina-123 pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas e máscaras faciais devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.