Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

O objetivo geral deste procedimento é gerar cepas de Streptococcus mutans direcionadas e interrompidas por genes usando uma fusão de PCR em duas etapas e eletroporação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como o funcionamento de um gene de interesse. A principal vantagem desta técnica é que nenhuma reação enzimática além da PCR é necessária e a preparação celular competente para eletroporação é bastante simples. Embora este método possa fornecer informações sobre a técnica de interrupção do gene Streptococcus mutans, ele também pode ser aplicado a outras espécies microbianas, como Staphylococcus aureus. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não estão familiarizados com a eficácia dos primers aninhados para a segunda PCR. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Ayako Okada, instrutora de pesquisa de nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque S.mutans UA159 em uma placa de infusão de cérebro-coração ou ágar BHI e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em condições anaeróbicas. No dia seguinte, use um palito esterilizado para escolher uma única colônia e inoculá-la em cinco mililitros de caldo BHI. Incubar a cultura de S.mutans durante a noite a 37 graus Celsius em condições anaeróbicas. Em seguida, centrifugue a cultura a 2000 vezes G por 15 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS. Centrifugar novamente a 2000 vezes G durante 15 minutos. Ressuspenda o pellet celular resultante em 200 microlitros de PBS. Extraia o DNA genômico da suspensão usando um kit de extração de DNA genômico baseado em bead-beating. Primeiro, transfira a suspensão celular para um tubo de amostra de dois mililitros contendo contas de vidro. Em seguida, adicione 750 microlitros de solução de lise à suspensão celular. Tampe bem os tubos e coloque-os simetricamente no suporte do tubo do aparelho de interrupção de batimento de contas. Processe na velocidade máxima por cinco minutos. Centrifugar as amostras batidas a 10 000 vezes G durante um minuto. Transferir o sobrenadante para uma coluna de centrifugação num tubo de recolha de dois mililitros e centrifugar a 7000 vezes G durante um minuto. Adicione 1200 microlitros de tampão de ligação ao DNA ao filtrado e transfira 800 microlitros da mistura para a coluna de centrifugação em um tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugar a 10 000 vezes G durante um minuto. Descarte o fluxo. Adicione 200 microlitros de tampão de pré-lavagem à coluna de centrifugação para lavar a matriz da coluna e centrifugar de 10.000 vezes G por um minuto. Descarte o fluxo, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem à coluna de centrifugação para lavar a matriz da coluna e centrifugue novamente. Coloque cada coluna de centrifugação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 100 microlitros de tampão de eluição à matriz da coluna. Centrifugar a 10 000 vezes G durante 30 segundos para eluir o ADN genómico. Estimar a concentração e a pureza do ADN medindo a absorbância a 260 nanómetros e 280 nanómetros utilizando um espectrofotómetro. A primeira PCR é realizada usando o genoma do tipo selvagem de S. mutans e o gene sintético de resistência à estreptomicina como modelos de PCR. Três conjuntos de primers são usados para amplificar, respectivamente, a região flanqueadora a montante do gene da glicosiltransferase C ou gtfC, a região flanqueadora a jusante do gene gtfC e o gene de resistência à espectinomicina. Fracione cada produto de PCR em um gel de agarose a 1%. O tamanho de cada produto da primeira PCR deve ser de aproximadamente um KB. Use um cortador de banda de gel para extirpar as bandas correspondentes e purificar cada produto de DNA amplificado conforme descrito no protocolo de texto. O próximo passo é usar os três fragmentos molares aproximadamente iguais como modelos de PCR para realizar a segunda PCR. Esses fragmentos são amplificados e emendados usando primers apropriados para produzir a construção de ruptura. Como o sucesso desse procedimento depende da amplificação da construção de ruptura pela segunda PCR, é importante confirmar o segundo produto da PCR por eletroforese. Carregue 1/10 da mistura de reação de PCR em um gel de agarose a 0,8% para confirmar que o amplicon gerado tem o tamanho de banda previsto. Neste exemplo, os primers aninhados deram uma amplificação muito melhor. Transfira a mistura de PCR restante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 55 microlitros de água ultrapura para ajustar o volume total para 100 microlitros. Adicione 1/10 volume de acetato de sódio de três molares pH 5,2, seguido por 2,5 volumes de etanol a 100% e misture. Congele a menos 80 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a 15.000 vezes G a quatro graus Celsius por 20 minutos. Quando a centrifugação estiver concluída, verifique se há pellet no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante. Lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% e centrifugue a 15.000 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e secar o pellet ao ar durante cerca de 30 minutos. Por fim, dissolva o pellet com 10 microlitros de água ultrapura. As células competentes de S.mutans UA159 foram previamente preparadas e armazenadas como alíquotas de 50 microlitros a menos 80 graus Celsius. Adicione a mistura às cubetas de eletroporação com uma distância de 0,2 centímetro entre os eletrodos. Realize a eletroporação usando o modo Staphylococcus aureus do aparelho de eletroporação. Imediatamente após a eletroporação, suspenda as células em 500 microlitros de caldo BHI e adicione 50 microlitros da suspensão às placas de ágar BHI contendo espectinomicina. Incube as placas por dois a seis dias a 37