Name: Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a injeção hidrodinâmica na pelve renal para expressão de proteínas em camundongos adultos. Esta técnica permite expressão gênica específica no rim, auxiliando pesquisas em nefrologia de forma reprodutível.

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American Heart Association [15GRNT25700209] suporte J.C. e com um prêmio de desenvolvimento de carreira do departamento de assuntos de veteranos [BX002797] suporte L.E.W. e o National Institutes of Health [R01-DK095867] O National Institutes of Health [DK093660], departamento de assuntos de veteranos [BX002190] e o centro de Vanderbilt para doença renal com suporte M.H.W. Este material é o resultado de trabalho apoiado com recursos e utilização das instalações do sistema de cuidados de saúde VA Tennessee Valley.

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<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar e não declarar nenhum conflito de interesses.

Neste protocolo é descrito um método robusto para atingir a expressão do gene pode ser reproduzido especificamente no rim. Nas mãos de um cirurgião experiente moderadamente encontramos a porcentagem de ratos transfectadas por esta técnica para estar na faixa de 50-100%, dependendo da idade do rato e a sensibilidade da leitura do transgene. O nível de expressão do gene do luciferase foi acima do fundo por vários meses em ratos recebendo piggyBac transposões e completamente mantido por várias semanas em ratos imun...

A técnica de injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se uma forma comumente usada para alcançar altos níveis de expressão gênica em rato fígado1,2. Os rins também são transfectados por esta técnica em um nível muito inferior, aproximadamente 100 vezes menos3. A injeção hidrodinâmica pelve renal descrita aqui fornece uma maneira simples de controlar a especificidade da expressão do órgão através de meios físicos, usando os mesmos princípios hidrodinâmicos que foram criados anteriormente no fígado4,5 , músculo6e outros órgãos de7,8. Esse método transfects células em animais vivos na vivo por meio de pressão e velocidade para forçar o fluido contendo DNA dentro das células, induzindo simultaneamente danos ao órgão que é rapidamente resolvido9. Usando técnicas cirúrgicas bem estabelecidas para visualizar o rim através de uma incisão de flanco10 juntamente com uma única injeção por seringa de insulina, temos encontrado sucesso transfeccao de vários tipos de células de rim, principalmente fibroblastos intersticiais, túbulos e coleta de duto de11. Dissecação destes ratos mostrou que outros órgãos não são transfectados em níveis altos o suficiente para visualizar por luciferase de imagem técnicas11. Uma vez que a técnica é não-virais, uso do plasmídeo para transfeccao permite rápida e fácil a preparação dos reagentes necessários para a injeção.
Nós usamos injeções localizadas de hidrodinâmicas para expressar a antioxidante Glutationa S-transferase A4, o receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina e a eritropoetina hormônio nos rins, tudo com os esperados efeitos biológicos11, 12 , 13. uma avaliação detalhada da via de administração, o volume de injeção, dosagem de DNA e escolha do promotor tem sido realizadas11. Além disso, ambos o piggyBac transposon sistema e/ou ciclofosfamida tratamento para suprimir a reação imune para o transgene foram mostrados para melhorar a longo prazo gene expressão resultados11. Outros pesquisadores usaram uma abordagem da veia renal em ratos com sucesso, alcançar a eficiência elevada do transfection por períodos de tempo superiores a um mês14. No entanto, correção genética dos fenótipos imitando doenças humanas geralmente são realizadas em ratos primeiro como um prova de conceito desde modelos genéticos mais mamíferos são modelos de rato. Nós em comparação a veia renal de injeção para injeção da pelve renal e descobriu que a injeção na pelve renal era superior da veia renal para expressão gênica (aproximadamente dez vezes maior) e sobrevivência11. A pelve renal é uma rota ideal de entrada para o rim porque é flexível o suficiente para tolerar variações de produção de urina e muitas vezes é capaz de manter sua integridade estrutural, mesmo quando dilatadas durante hidronefrose. Além disso, injeção na pelve renal permitiu acesso ao rim sem perfurar a cápsula renal, permitindo que o fluido injetado ser visivelmente mantido pelo rim melhor que injeção difuso. Outros órgãos do rato não tem uma rota de entrada diferente da vasculatura, mas o espaço urinário do rim é um local de injeção ideal. Além disso, a injeção na veia renal resultou em vazamento de sangue na cavidade abdominal. Estimou-se o volume total do rim dos rins do selvagem-tipo rato por ressonância magnética para ser aproximadamente 0,2 cm3, então o volume de um único rim é aproximadamente igual à quantidade de fluido injetado pela pelve renal hidrodinâmico injeção (100 µ l)15. Aqui, disponibilizamos todas as nuances detalhadas do protocolo de injeção hidrodinâmica pelve renal para alcançar a transfeccao reprodutível do rim.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anestésico - Substância não controlada</td></tr><tr><td>Seringa de insulina BD 0,5 mL 29G 1/2 polegada</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>seringas necessárias</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Farmacêutico / Veterinário</td><td></td><td>Analgesia - Substância Controlada</td></tr><tr><td>Dynarex Cortina de toalha descartável</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Coloque sobre a almofada de calor</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Use apenas DNA de plasmídeo livre de endotoxina</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Controle Positivo Rápido</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Controle positivo para teste de endotoxina</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Frasco de Teste Único</td><td>Rápido Charles River</td><td>R13500</td><td>Teste de endotoxina</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação Micro Extra Fina</td><td>Roboz Surgical Instrumento</td><td>RS-5882</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Bolsa de esterilização de selagem instantânea Fisherbrand - 9"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Para autoclavagem de ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Bomba de calor Gaymar</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Bomba de calor circulante de água</td></tr><tr><td>Germinador 500</td><td>Instrumento cirúrgico Roboz</td><td>DS-401</td><td>Para reutilizar ferramentas cirúrgicas durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Graefe Fórceps</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5136</td><td>Ferramenta Cirúrgica</td></tr><tr><td>Graefe Tecido Fórceps</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5153</td><td>Ferramenta Cirúrgica</td></tr><tr><td>Halsey Porta-Agulhas, 5" Comprimento</td><td>Instrumento Cirúrgico Roboz</td><td>RS-7841</td><td>Almofadas</td>de calor para ferramentas</tr><tr><td>cirúrgicas - 15" x 21" - precisa de pelo menos 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Para uso com Bomba de Calor</td></tr> <tr><td>GaymarIsoFlo (Isoflurano, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Para imagem e eutanásia</td></tr><tr><td>Vaporizador do Sistema de Entrega de Isoflurano</td><td>Isotec Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Para imagem e eutanásia</td></tr><tr><td>Anestésico</td>farmacêutico/<td>veterinário</td><td></td><td>de cetamina</td> - Substância controlada</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Tecidos</td></tr> <tr>de laboratório<td>Software de imagem viva</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Para imagens de animais vivos</td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Para imagens de animais vivos</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Espectrofotômetro para medição de DNA</td></tr><tr><td>Cotonetes Prevantics</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Para preparação de cirurgia de pele</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 suturas Cone 30"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Suturas não absorvíveis para a pele</td></tr><tr><td>Pomada Oftálmica da Marca Puralube</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Para manter os olhos úmidos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Trans IT - Solução de Entrega Hidrodinâmica QR</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Tampão de entrega hidrodinâmico para diluir o DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Suturas J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Suturas absorvíveis para camada muscular</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Barbeador para preparação da pele</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Ciências da Vida</td><td></td><td>Para imagens de animais vivos</td></tr></tbody></table>

injeção hidrodinâmica pelve renal para a expressão não-virais de proteínas no rim

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Injeção hidrodinâmica cria um ambiente local, de alta pressão para transfect vários tecidos com o Plasmídeo e outras substâncias. Injeção de veia de cauda hidrodinâmica, por exemplo, é um método bem estabelecido, pelo qual o fígado pode ser transfectado. Este manuscrito descreve uma aplicação dos princípios hidrodinâmicos pela injeção do rim do mouse diretamente com plasmídeo para expressão de genes específicos do rim. Os ratos são anestesiados e o rim é exposto através de uma incisão de flanco, seguida por uma injeção rápida de um plasmídeo que contém ADN solução diretamente na pelve renal. A agulha é mantida no lugar por 10 segundos e o local da incisão é suturado. No dia seguinte, ao vivo de imagem animal, borrão ocidental, ou imuno-histoquímica pode ser utilizado para ensaiar a expressão do gene ou outros ensaios adequados para o transgene de escolha são utilizados para a detecção da proteína de interesse. Métodos publicados para prolongar a expressão gênica incluem tratamento de integração e ciclofosfamida mediada por transposon transgene para inibir a resposta imune para o transgene.

A técnica de cirurgia e injeção são simples para executar uma vez dominado, exigindo sem grandes equipamentos ou materiais caros. Se novo para cirurgia de rim de flanco-incisão, um dia de treinamento em vários ratos agendada para eutanásia devem em que os ratos não são recuperados de cirurgia seguir porque a primeira tentativa desta cirurgia pode levar muito mais tempo do que o normal. Alternativamente, os investigadores familiarizados com técnicas similares podem achar bastante simples. ...

Este protocolo descreve um método para injetar plasmídeo no rim do rato através da pelve renal para produzir a expressão do transgene especificamente no rim.

Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é produzir expressão de proteínas a partir do DNA do plasmídeo no rim de camundongo adulto. Este método é uma nova ferramenta para abordar questões-chave em nefrologia, como a expressão de uma proteína de interesse afeta o rim adulto. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz expressão proteica de forma reprodutível, especificamente no rim, ao contrário de outros métodos que também podem produzir expressão gênica em outros órgãos.A demonstração visual desse método é crítica, pois a injeção da pelve renal requer exposição cuidadosa e deve ser feita rapidamente para que o DNA plasmático entre nas células. Comece ressuspendendo o DNA do plasmídeo no tampão de entrega hidrodinâmico. Em uma almofada de calor circulada de água coberta com uma almofada azul, coloque o mouse.Usando um barbeador projetado para cuidar de animais de estimação, raspe o lado esquerdo da parte de trás do mouse do ombro à garupa e do flanco à coluna. Limpe o cabelo solto e os detritos e aplique pomada veterinária em ambos os olhos para evitar a dessecação da córnea. Agora, prepare 100 microlitros contendo 10 a 50 microgramas de DNA plasmídico diluído em uma

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Gupta, K., et al. Injeção intrarrenal de Escherichia coli em um modelo de rato para pielonefrite.  J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a injeção intrarrenal de E. coli na pelve renal de um rato anestesiado para induzir uma infecção renal localizada, modelando a pielonefrite aguda. Ele destaca etapas cirúrgicas chave e técnicas assépticas necessárias para estabelecer um modelo de infecção reprodutível in vivo para análise posterior.

Injeção Intrarrenal de E. coli na pelve renal de um rato

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

Neste vídeo, apresentamos o protocolo de injeção hidrodinâmica de plasmídeos na pelve renal do rim de camundongo para transfecção de ácido nucleico. Essa técnica permite a entrega de plasmídeos específicos do órgão, utilizando o princípio da alta pressão hidrostática, que impulsiona com força os plasmídeos para o local específico sem causar lesão tecidual.

Injeção hidrodinâmica da pelve renal: uma técnica para entregar DNA diretamente em células renais de modelo murino

Neste vídeo, demonstramos a administração intrarrenal de medicamentos em ratos através da artéria renal. Este método é benéfico para melhorar o direcionamento do medicamento, a potência do medicamento e minimizar a toxicidade sistêmica.

Entrega intrarrenal de medicamentos em ratos: um método para administrar medicamentos terapêuticos em rim de rato por meio de injeção intra-arterial

Aqui, apresentamos um protocolo para usar mapas de destino e traçadores de linhagem para direcionar injeções em blastômeros individuais que dão origem ao rim de embriões de Xenopus laevis.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

A administração de drogas para a recuperação da função renal requer controlo da localização e distribuição do composto terapêutico. Aqui, descrevemos em detalhe uma técnica simples para entrega intra-renal de drogas em ratos. Este procedimento pode ser facilmente realizada sem mortalidade e alta reprodutibilidade.

Entrega intravascular de Biologics para o rim de rato

Este manuscrito descreve um modelo cirúrgico de pielonefrite em ratos usando infecção intra-renal direta por Escherichia coli na pelve renal. O procedimento experimental pode ser utilizado para estudar a patogênese da pielonefrite, bem como a inflamação e fibrose associadas.

Injecção Intrarenal de Escherichia coli Em um modelo de rato de peleonefrite

Este manuscrito descreve um método de entrega direcionada a um único rim através de um cateter colocado na aorta abdominal infrarenal no camundongo.

Entrega direta de medicamentos ao rim através da artéria renal

Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.

Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos

Este relatório detalha o método de injeção localizada de vetores AAV através da pelve renal para transferência eficaz e segura de genes para o rim de camundongo.

Entrega de genes eficaz e segura ao rim de camundongo por meio de injeção lenta e retrógrada da pelve renal de vetores de vírus adeno-associados

Aprenda a injeção hidrodinâmica na pelve renal para expressão de proteínas em camundongos adultos. Esta técnica permite expressão gênica específica no rim, auxiliando pesquisas em nefrologia de forma reprodutível.

Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim

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