Name: Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a medir a peroxidação lipídica em HDL usando ensaio fluorométrico bioquímico livre de células. Este método rápido e reprodutível permite análises em larga escala para estudar função do HDL em doenças cardiovasculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. T.A.A. é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. AJ e AH são suportados por NHMRC projeto grant 1108792. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

todos os experimentos utilizando amostras biológicas humanas foram realizados com aprovação de ética da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Los Angeles e o Comité de ética humana do Alfred Hospital, Melbourne.
 Nota: há muitas variações da função fluorocromo HDL ensaio (ver discussão) 32. Abaixo descrevemos o protocolo que dá os resultados mais consistentes e reprodutíveis. Uma visão geral do ensaio é mostrada na Figura 2.
 1. processamento de amostras <ol><li>uso soro fresco, não hemolizado (podem ser coletadas em tubos de separador de soro) ou plasma citrato obtidos após 12-14 horas de jejum. Se usando amostras criopreservadas, incluem controle apropriado conforme descrito neste protocolo.</li>
</ol> 2. Dia 0-preparação para o ensaio <ol><li>preparar layout de trabalho de experiência com os controles apropriados, amostras e Replica. Execute cada amostra pelo menos em triplica. Um layout bem representante 96 é mostrado na Figura 3.</li>
	<li>Calcular todos os volumes dos reagentes que serão utilizados para o ensaio com base no número de amostras e repetições. 
	Nota: Incluir um volume adicional de 10% em cada estoque de trabalho para garantir que haja volume suficiente para cada reagente para o experimento específico.</li>
	<li>Etiqueta tubos necessários para todas as diferentes etapas do ensaio, por exemplo, para a separação de HDL, medição de HDL-C (opcional) e o fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. Dia 1-preparação de controles <ol><li>preparação de estudo específico em pool controle <ol><li>criar uma amostra de soro ou plasma em pool de estudo todas as amostras. Se executando 20 amostras em cada placa em triplicado, combine 10 µ l de cada amostra em um controle de 200 µ l em pool. Dê uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C deste controle. 
		Nota: Usar esse controle em pool para padronizar o ensaio e contabilizar tudo possível conhecido (por exemplo, tipo de soro de matriz versus plasma, ciclos de gelo-degelo, criopreservação) e confundidores desconhecidas que podem afetar a variabilidade experimental 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Preparação específicas do laboratório de controle de qualidade (QCs) <ol><li>preparar um grande estoque de HDL em cada laboratório (por exemplo HDL isolada de 5 mL de plasma de 10 doadores saudáveis) e cryopreserve várias alíquotas do presente ações para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
		<li>Uso de pelo menos 10 diferentes Replica deste estoque para determinar o valor médio de HDLox. Uma faixa aceitável de medição HDLox valores para cada amostra QC incluída em cada ensaio é dentro &lt; 15% do coeficiente de variação deste valor médio.</li>
		<li>Dar uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C de controle (por exemplo, 40 mg/dL). 
		Nota: Uma abordagem detalhada como usar sangue de bancos de sangue para criar esses controles anteriormente foi descrito 27 , 28 , 32. Use QCs adicionais conforme necessário (por exemplo, uma de um doador saudável, conhecido por ter a função de HDL normal e uma de um doador conhecido por ter a função de HDL em grande parte anormal.</li>
	</ol></li> <li>Otimização de sinal de fundo e valores em branco (opcionais) <ol><li>para minimizar o plano de fundo, adicionar a quantidade apropriada de catalase (1-4 U/mL) no meio de incubação para remover rapidamente o formado de H 2 O 2 devido à oxidação do ar espontânea dos buffers. 
		Nota: Desde que os valores dos poços em branco (não HDL) estão sendo subtraídos os valores das amostras de HDL e os resultados estão sendo relatados em relação a um controle em pool (que está incluído no mesmo prato bem 96), encontramos que este passo é que praticamente não afecte t os resultados. Assim, a otimização do sinal de fundo com catalase pode ser omitida, se necessário.</li>
	</ol></li></ol> 4. Dia 1-separação de HDL-colesterol utilizando a precipitação de HDL Nota: Use um reagente precipitante comercialmente disponível de padronizada HDL colesterol para isolar apoB empobrecido soro de acordo com o fabricante ' s instruções. Estes reagentes são amplamente utilizados em ensaios colorimétricos para determinar os níveis de colesterol HDL.
<ol><li>Usar fresco (ou descongelar) amostra de soro ou plasma.</li>
	<li>Misturar volumes iguais (por exemplo, 80 µ l) de plasma e reagente precipitante do HDL colesterol (20% w/v polietilenoglicol em tampão glicina pH 10,0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix bem pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Centrifugar a 1000 a 2000 x g por 10 min.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante (fração de HDL).</li>
	<li>Idealmente usar imediatamente o HDL isolado para o fluorochromeassay de peroxidação lipídica de HDL. No entanto, se várias amostras são executadas no mesmo dia e outros passos, tais como a medição da concentração de HDL-colesterol também são feitas, então armazenar o HDL isolado a 4 ° C e usá-lo no dia seguinte para a função de fluorochromeHDL ensaio.</li>
</ol> 5. Dia 1-determinação de HDL-C, HDL isolado Nota: isto é opcional, se o valor de HDL-C de laboratório clínico é usado para normalizar HDLox pela quantidade de HDL-C.
<ol><li>Quantify o HDL-colesterol do plasma, utilizando padrão colorimétrico ensaios 27. Adicionar 50 µ l de reagente de colesterol em cada poço e determinar a concentração de colesterol, usando um leitor colorimétrico e um colesterol padrão fornecido em cada kit.</li>
</ol> 6. Dia 2-preparação dos reagentes <ol><li>soluções preparar HRP e colesterol de HRP 5 U/mL de solução (intervalo de 1-10 U/mL).</li>
	<li>Preparar 20mm fluorocromo (por exemplo, Amplex vermelho) soluções: descongelar um frasco de reagente fluorocromo e DMSO à temperatura ambiente. Antes da utilização, dissolva o reagente fluorocromo (1 mg) em 200 µ l de DMSO. Armazenar a solução estoque congelada no ≤-20 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Preparar controles positivos e negativos: uso 1 X ' amortecedor da reação ' sem colesterol e 20 mM H 2 O 2 solução de trabalho como um controle negativo e positivo, respectivamente.</li>
</ol> 7. Dia 2-fluorocromo ensaio <ol><li>Adicionar 50 µ l de tampão de reação como branco (controle negativo) 1x.</li>
	<li>Opcional: Adicionar solução de trabalho de 20 mM de H 2 O 2 como controle positivo em cada placa.</li>
	<li>Para minimizar a variabilidade experimental e certifique-se que a adição de reagentes e amostras é feitas de forma consistente e em tempo hábil, realizar todas as adições de amostras em uma placa separada de bem fundo redondo, claro, poliestireno ou polipropileno 96 (chapa 1). Em seguida, usar uma pipeta multicanal para transferir volumes específicos em 3 placas de 96 poços (placas de 2-4: polipropileno, plana botTom, preto) (que tem o layout idêntico) ( Figura 2, Figura 3).
	<ol><li>Por exemplo, primeiro adicione 160 µ l de HDL isolado em cada poço/amostra de placa 1 e depois com o uso da pipeta multicanal transferir 50 µ l de HDL-colesterol de cada poço/amostra para as placas de 96 poços pretas. Mudar dicas entre cada linha/coluna e usar dicas não filtrada para todas as transferências.</li>
	</ol></li> <li>Deixar amostras dos poços. Não jogue fora. Não há nenhum etapas de lavagem entre adição dos reagentes.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de HRP 5 U/mL (0,25 U) em cada Pocito. 
	Nota: Uso HRP antes da adição do reagente fluorocromo.</li>
	<li>Incube durante 30 min a 37 ° C. Não descartar amostras após incubação (sem etapas de lavagem entre adições de reagentes).</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de fluorochromereagent para uma concentração final de 300 µM. Neste ponto, a reação total volume é 150 µ l. Misture bem e proteger da luz.</li>
	<li>Avaliar a leitura fluorescente (no escuro) cada minuto mais de 120 min a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm). 
	Nota: Utilize um intervalo de 60 minutos mais curto com amostras frescas. Encontramos esse ensaio de 120 minutos dá mais dados podem ser reproduzidos com a utilização de amostras criopreservadas.</li>
	<li>Gravar dados usando o software apropriado.</li>
</ol> 8. Análise de dados 3 dia <ol><li>gravar unidades de fluorescência (unidades arbitrárias) 120 minutos após a adição do fluorocromo reagente para todas as amostras, incluindo poços em branco e todos os controles.</li>
	<li>Calcular o valor médio das unidades de fluorescência (com base em, pelo menos, triplica) (HDL ox_sample). Não tome valores atípicos (&gt; 2 SDs de valor médio) em consideração.</li>
	<li>Subtrair a fluorescência de fundo usando a seguinte equação: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>normalização para a quantidade de colesterol HDL (HDL-C): normalizar o valor de peroxidação lipídica HDLox para cada amostra (incluindo o controle em pool) pela HDL-C) (mg/dl). Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como n HDLox (HDL-C) medida para refletir o ajustamento para HDL-C. Use a seguinte equação: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>padronizar a expressão do HDLox valor de peroxidação lipídica de cada amostra contra o valor de um controle em pool. Normalize o n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica para cada amostra (ajustada para HDL-C) pelo n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica do controle em pool. Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como medida de boi nHDL para refletir a adaptação à variabilidade experimental e HDL-C. Use a seguinte equação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> Nota: esta abordagem é semelhante a outras abordagens experimentais estabelecidas para reduzir variabilidade experimental das medições, tais como internacional normalizado ratio (INR) 44 , 45. Esta abordagem foi validada em estudos clínicos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.</li> <li>Executar controle de qualidade dos resultados experimentais usando amostras de controlo de qualidade padrão. Cada laboratório deve estabelecer seus próprios controles de qualidade (QCs). Idealmente, há um QC para nHDLox de uma amostra com conhecidos HDL disfuncional e um QC para nHDLox de uma amostra de doadores saudáveis [por exemplo, uso amostras de jovens adultos que são estabelecidos banco de sangue de doadores e não tem conhecida comorbidade e fatores de risco para doença cardiovascular incluindo fumar]. Controle o último padroniza resultados entre diferentes laboratórios. Os valores médios destes QCs são com base em pelo menos 5 é replicada estabelecidas (normalmente usamos 10 repetições para este passo importante).
	<ol><li>Seleção se QCs medidos em cada ensaio têm valores dentro do intervalo esperado de valores. Assumindo uma variabilidade experimental máxima aceitável de 15%, todos os valores medidos experimentais devem cair dentro de 15% dos valores médios conhecidos do QC estabelecido. Use as seguintes equações: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> Nota: se também do controle da qualidade incluído amostras ( normal versus disfuncional HDL) dá HDLox valores fora do intervalo esperado (estabelecido em cada laboratório), em seguida, repetir a experiência.</li>
	</ol></li> <li>Executar controle de qualidade dos resultados experimentais, usando o coeficiente de variação (CV) para quantificar a variabilidade experimental: repetir todas as amostras com CV % &gt; 15%. Use a seguinte equação: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> Nota: é um típico intraensaio (dentro da mesma placa) e variabilidade experimental inter-ensaio (entre diferentes placas) &lt; 15%. 2) um típico intraensaio CV é entre 1-7% e um típico interassay CV é entre 3-10%.</li>
</ol>

Este protocolo e ensaio são relevantes para a patente PCT/US2015/018147.

O protocolo descrito aqui oferece uma ferramenta robusta para responder perguntas importantes pesquisas sobre o papel da função de HDL em aterosclerose e doenças humanas. O ensaio quantifica o teor de peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C usando amplificação enzimática (HRP). Essa abordagem evita as limitações conhecidas dos ensaios de função prévias HDL (por exemplo, o ensaio de efluxo de colesterol) incluindo a heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura que relatou, falta de...

Doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) é a principal causa de morte em todo o mundo1,2. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) colesterol geralmente estão inversamente associados com o risco para o desenvolvimento da aterosclerose1,2. Embora diversos estudos apoiam um papel atheroprotective para HDL1,2, o mecanismo pelo qual o HDL atenua o início e progressão da aterosclerose é complexo 3,4. Assim, tem sido sugerido que a complexa estrutura e função do HDL, ao invés de nível absoluto podem prever com mais precisão aterosclerose 5,6,7,8. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Estes i) reduzir seu potencial de efluxo de colesterol 9, ii) diminuir anti-inflamatório e aumento de HDL-associado a proteínas pró-inflamatórias 6,7, iii) diminuição fator os níveis de antioxidantes e atividade e HDLs capacidade de inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox)10 e iv) aumentar lipídico hidroperóxido conteúdo e redox atividade (HDLox)9,11. Robustos ensaios que avaliam as funções de pleotropic de HDL (tais como o efluxo de colesterol, função antioxidante) podem complementar a determinação de HDL-HDL-C, na clínica.
Função do HDL é geralmente avaliada por métodos baseados em células, tais como o colesterol efluxo ensaio8,12,13,14. Esses métodos têm limitações principais incluindo heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura relatado, a falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos 7,15. Estas desvantagens apresentam dificuldades para grandes estudos clínicos16. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. O efluxo de colesterol é uma das mais importantes funções de HDL, mas isso só pode ser determinado por ensaios cell-based. Outras abordagens para determinar a função do HDL como proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 e ensaios de quimiotaxia de monócitos baseada em célula de HDL função 17,22,25 não tem sido padronizados e não pode ser usados em estudos humanos em grande escala.
HDL tem antioxidante significativa atheroprotective efeito5,6,7,8. Determinou-se a função antioxidante de HDL na presença de LDL anterior célula livre ensaios fluorométrica 26. Estes métodos bioquímicos fluorométrica de função antioxidante de HDL foram originalmente desenvolvidos por Mohamad Navab e Alan Fogelman e seus colegas26. Embora muitos estudos humanos usaram estes métodos para determinar o HDL função 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipídios (HDL)-lipídeos (LDL) e interações lipid-fluorocromo podem limitar a reprodutibilidade destes celular grátis não enzimáticos bioquímicos ensaios de HDL função27,28.
Recente interesse centrou-se sobre as consequências funcionais da oxidação de HDL que é o resultado da oxidação de lipídios e proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudos prévios mostraram que oxidação de HDL prejudica HDL função 27,29,30. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Assim, teor de peróxido lipídico HDL pode ser usado para determinar o HDL função 9,17,20,31 e dada as limitações conhecidas dos ensaios prévios de HDL função7, de27,de 15,32, desenvolvemos um método alternativo de fluorométrica que quantifica o HDL lipid índice de peróxido (HDLox) 32. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C 32. O princípio bioquímico do ensaio é mostrado na Figura 1. Mostramos que essa abordagem baseada em fluorescência não tem as limitações de prévia HDL função ensaios27,28. Este ensaio tem sido ainda mais refinado e padronizado em nosso laboratório para que confiável pode ser usada em estudos humanos em grande escala, mesmo com criopreservado plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. a leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aqui, descrevemos este método simples, porém robusto para medir o teor de peróxido do lipídico HDL (HDLox). Este ensaio pode ser usado como uma ferramenta para responder perguntas de pesquisas importantes sobre o papel da função de HDL em doenças humanas onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel-chave (tais como aterosclerose)32.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes experimentais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polietilenoglicol) Reagente Precipitante</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Reagente vermelho Amplex</td>.<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteja da luz</td></tr><tr><td>DMSO.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteger da leve</td></tr><tr><td>Peroxidase de Rabanete de Cavalo (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td> Kit de Ensaio de Colesterol <td>Amplex Red A12216</td><td>. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteger da Esterase de Colesterol</td></tr><tr><td>Light.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteger da luz</td></tr><tr><td>Colesterol Referência padrão</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteger da luz</td></tr><tr><td>Resorufin fluorescense Referência padrão</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteja da luz</td></tr><tr><td>5x Buffer de Reação.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red. &bull; &le; &ndash; 20&deg; C &touro; Dessecado &bull; Proteger da luz</td></tr><tr><td>HDL Colesterol Reagente Automatizado</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Plasticware</td>placas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços (polipropileno, fundo plano, transparente).</td><td>Placas Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>de 96 poços (polipropileno, fundo plano, preto).</td><td>Tubos Eppendorf Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, estéril</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Multicanal Thermo Scientific, 8 canais, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.</td><td>&nbsp; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 software</td><td>Biotek, Vermont, EUA</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>strong>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Leitor de placas</td><td>Biotek, Vermont, EUA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Os níveis de colesterol (HDL-C) baixa lipoproteína de alta densidade são um dos mais poderosos preditores independentes de negativos de doença cardiovascular aterosclerótica (CVD). A estrutura e a função do HDL, ao invés de HDL-C podem prever com mais precisão a aterosclerose. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Função do HDL é geralmente determinada por célula com base em ensaios como ensaio de efluxo de colesterol mas estes ensaios tem numerosos de inconvenientes de falta de padronização. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. Oxidação de HDL prejudica a função do HDL. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Interações lipid-sonda devem ser consideradas quando a interpretação dos resultados de fluorescência não enzimáticos ensaios para medir o estado oxidativo de lipídios. Isto motivou-na desenvolver um método enzimático bioquímico celular livre para avaliar HDL peróxido teor lipídico (HDLox) que contribui para a disfunção de HDL. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C. Eis um protocolo describedfor determinação da peroxidação lipídica HDL usando o reagente de fluorocromo. Variabilidade do ensaio pode ser reduzida pela padronização rigorosa das condições experimentais. Valores mais altos de HDLox estão associados com a função de antioxidante HDL reduzida. A leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e fenótipos associados risco cardiovascular e metabólico. Esta abordagem técnica é um método robusto para avaliar a função do HDL em doenças humanas, onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel fundamental (tais como a aterosclerose).

50 µ l de cada amostra de HDL são adicionados em cada poço como no passo 7.3. 50 µ l de solução HRP 5 U/mL (0,25 U) são adicionados para cada poço como na etapa 7.5. As amostras são incubadas por 30 min a 37 ° C, como na etapa 7,6. 50 µ l de reagente fluorocromo são então somados para cada poço como na etapa 7,7 (concentração final de 300 µM). A leitura fluorescente (no escuro) é então avaliada cada minuto mais de 120 minutos a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/5...

Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

O objetivo geral deste método experimental é determinar a função da lipoproteína de alta densidade usando um ensaio bioquímico livre de células que mede o teor de peróxido lipídico de uma quantidade específica de HDL. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em vários campos da medicina, como o papel da função HDL nas anormalidades metabólicas das doenças cardiovasculares. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método bioquímico livre de células que pode ser usado para determinar com segurança a função do HDL.Embora esse método possa fornecer informações sobre o papel da função do HDL em doenças cardiovasculares e anormalidades metabólicas, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como doenças inflamatórias. Para iniciar este procedimento, prepare o layout de trabalho para a placa de 96 poços, incluindo os controles, amostras e réplicas apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Calcule o volume de reagentes necessários com base no número de amostras e réplicas.Usando um marcador permanente, rotule os tubos para cada etapa do ensaio. Em seguida, combine 10 microlitros de cada amostra para criar uma amostra de controle agrupada. Crie uma segunda amostra de controle agrupada para o laboratório clínico, a fim de determinar o valor de HDL-C.Depois de preparar um grande estoque de HDL, criopreserve várias alíquotas para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento. Agrupe pelo menos 10 réplicas diferentes para criar um controle de qualidade agrupado. Em seguida, determine o valor médio do HDLox conforme descrito no protocolo de texto.Crie um segundo controle de qualidade agrupado para o laboratório clínico, a fim de determinar o valor de HDL-C. Para começar, descongele uma nova amostra de plasma ou soro. Misture volumes iguais de reagente precipitante de colesterol HDL e plasmático.Pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar bem. Centrifugar a uma velocidade entre 1000 e 2000 vezes G durante 10 minutos. Depois disso, aspire o sobrenadante.Armazene o HDL isolado a quatro graus Celsius até que esteja pronto para realizar o ensaio de função HDL de fluorocromo. Se o valor de HDL-C do laboratório clínico for usado para normalizar o HDLox, quantifique o HDL-C do plasma conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, misture o colesterol e o HRP, de modo que as soluções preparadas contenham cinco unidades por mililitro de HRP.Descongele um frasco de reagente de fluorocromo e um frasco de DMSO à temperatura ambiente. Depois de descongelados, dissolva um miligrama de reagente de fluorocromo em 200 microlitros de DMSO. Armazene esta solução a uma temperatura abaixo de 20 graus Celsius negativos, enquanto protegida da luz.Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de reação 1X à placa de amostra como controle negativo. Adicione 50 microlitros de solução de trabalho de peróxido de hidrogênio 20 milimolar como controle positivo. Depois disso, coloque uma nova placa de fundo redondo de 96 poços para ser usada como placa de preparação.Adicione 200 microlitros de HDL isolado a cada poço desta placa de preparação. Usando uma pipeta multicanal, transfira 50 microlitros de HDL da placa de preparação para as placas experimentais, conforme descrito no protocolo de texto, com o número de placas experimentais sendo igual ao número de repetições no ensaio. Depois disso, adicione 50 microlitros de solução HRP preparada a cada poço.Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, adicione 50 microlitros de reagente de fluorocromo a cada poço, para um volume total de 150 microlitros por poço. Misture bem e proteja da luz. Usando um leitor de placa fluorescente, avalie a leitura fluorescente a 37 graus Celsius, no escuro, a cada minuto durante 120 minutos.Registre os dados usando o software apropriado e, em seguida, calcule o valor médio das unidades de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, um ensaio fluorométrico bioquímico livre de células é desenvolvido para quantificar o teor de peróxido lipídico HDL por miligrama de HDL-C. Isso é realizado por amplificação enzimática usando HRP.Um leitor de placas fluorescentes é então usado para medir a fluorescência no escuro, a cada minuto, por 120 minutos. Dados representativos para um paciente conhecido por ter HDL disfuncional são mostrados aqui, em comparação com o controle combinado. O HDL disfuncional é visto como tendo níveis de peróxido lipídico duas vezes maiores do que os observados no HDL agrupado de participantes saudáveis.Em seguida, o HDL é isolado e o HDLox é determinado em 50 indivíduos saudáveis e 100 pacientes infectados pelo HIV. Os pacientes infectados pelo HIV têm, em média, um teor de peróxido de HDL 60% maior por miligrama de HDL-C do que os indivíduos saudáveis. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de seis horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar todos os reagentes e controles antecipadamente, ser consistente, preciso e sempre incluir o controle experimental apropriado em cada placa experimental. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o HDL, determinar o teor de peróxido lipídico de uma quantidade específica de HDL e depredar nossa função de HDL. Não se esqueça de que trabalhar com bioespécimes pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Este protocolo fornece uma abordagem eficiente para medir a absorção de colesterol LDL com taxas de fluxo em tempo real usando uma célula viva, sistema em vários tipos de células de imagem. Esta técnica fornece uma plataforma para a atividade farmacológica de compostos afetando o influxo de LDL enquanto monitora para morfologia celular e citotoxicidade, portanto, potencial de tela.

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

As doenças oculares degenerativas que afetam a camada do epitélio pigmentado da retina do olho têm origem monogênica e poligênica. Vários modelos de doença e um software, LipidUNet, foram desenvolvidos para estudar mecanismos de doença, bem como potenciais intervenções terapêuticas.

Método LipidUNet-Machine Learning de Caracterização e Quantificação de Depósitos Lipídicos Usando Epitélio Pigmentado Retiniano Derivado de iPSC

Descrevemos um método para o uso de ciclodextrina para mediar a troca entre lipídios da membrana plasmática com lipídios exógenos. Essa técnica pode ser combinada com experimentos que estudam proteínas transmembranares, que se comportam de maneira diferente em ambientes semelhantes a jangadas lipídicas do que em ambientes não semelhantes a jangadas.

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Este protocolo detalha um ensaio in vitro para medir a captação de lipídios celulares em células endoteliais após estimulação com análogos fluorescentes BODIPY-C12 e BODIPY-C16 de ácidos graxos saturados de cadeia longa e muito longa. Este método é eficiente e adaptável a outros tipos de células, oferecendo uma abordagem útil para estudar o metabolismo lipídico.

Quantificação da captação de ácidos graxos endoteliais usando análogos de ácidos graxos fluorescentes

Aqui, descrevemos os protocolos para medir a quantidade de fosfolipídio fluorescente especificamente removido das partículas doadoras de lipídios pela lipoproteína de alta densidade (HDL) presente no plasma ou soro humano total. Mostramos que essa métrica de funcionalidade HDL prevê doenças cardiovasculares incidentes.

Ensaio de efluxo de fosfolipídios específico para lipoproteína de alta densidade

Aprenda a medir a peroxidação lipídica em HDL usando ensaio fluorométrico bioquímico livre de células. Este método rápido e reprodutível permite análises em larga escala para estudar função do HDL em doenças cardiovasculares.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade (Vídeo) | JoVE Journal

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Explorar mais vídeos