Name: Geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica Docetaxel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a gerar modelos de células de câncer de próstata resistentes ao Docetaxel usando linhagens DU145 e 22Rv1. Este método permite estudar mecanismos moleculares de resistência a terapias antimitóticas e identificar alvos terapêuticos.

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V.R.-B. recebe financiamento do departamento E.U. de saúde &#38; humanos serviços, NIH, National Cancer Institute conceder número 1 K22 CA207458-01 e J.D.-D. recebe financiamento do departamento E.U. de saúde &#38; humanos serviços, NIH, National Cancer Institute conceder número 1 R01 CA207311-01.

1. determinação da concentração de Docetaxel, causando 50% diminuição na capacidade de formação de Colônia (IC50) Nota: neste protocolo, concentração de Docetaxel IC50 foi avaliada usando a formação da colônia capacidade. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (i.e., ensaios MTS) podem ser usados com base na investigadores &#39; preferências.
<ol><li>DU145 crescer ou 22Rv1 células em balão 2 75cm e preparar o estoque suficiente de 10mm Docetaxel diluído em DMSO para ser utilizado em experiências futuras.</li>
	<li>Para placa células para determinação de IC50 de Docetaxel, remova a mídia do recipiente, lavar cuidadosamente as células com 5 mL de PBS e incubar com 2ml 0.05% Trypsin-EDTA para 3-5 min a 37 ° C para separar as células da superfície do balão.</li>
	<li>Enxaguar as células trypsinized do frasco com 5 mL de mídia fresca e coletar a suspensão de células em um tubo de 15 mL. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, 3 min, temperatura ambiente (RT)).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de mídia fresca... contar as células. Diluir a suspensão de células para 2 a 2,5 x 10 5 células/mL para DU145 e 4-4,5 x 10 5 células/mL para 22Rv1, misture bem pipetando para cima e para baixo e 2 mL da suspensão em cada poço de duas placas de 6-poços de sementes.</li>
	<li>Após 24 h, quando as células encontram-se na confluência de 70-80%, adiciona concentrações de Docetaxel aumentando a dose de 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM e 1000 nM para cada poço. Tratar o controle bem com DMSO em maior volume usado para Docetaxel ( Figura 2A).</li>
	<li>Depois de 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar 2 mL de mídia fresca. Dentro de aproximadamente 4-5 dias, as placas estarão prontas para a coloração.</li>
	<li>Para manchar as colônias, lave-os delicadamente com 2-3 mL de PBS e incube-os com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p/v em formol a 10%) por dentro do capô de cultura de tecidos ou uma coifa de 20 min.</li>
	<li>Remover placas coloração de solução e lavagem com 2-3 mL de H 2 O, retire H 2 O e placas de secar ao ar.</li>
	<li>Analisar os resultados através da visualização dos poços para determinar qual deles tem a concentração de Docetaxel que diminui a viabilidade celular em 50% (IC50). Manualmente a contagem das colónias com a ajuda de uma caneta (para evitar a contagem das colônias mesmas duas vezes) e representam o percentual de viabilidade celular em um gráfico ( Figura 2A). Finalmente, tirar imagens digitais das placas para representação de figura (como mostrado na Figura 3A).</li>
</ol> 2. Geração de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel Nota: realizar tratamentos de célula usando o mesmo estoque de solução de Docetaxel utilizado para determinação da concentração de fármaco IC50 (preparar estoque suficiente antecipadamente a experimental Use). Mantenha sempre um pequeno frasco de células da etapa anterior, no caso de algo não funciona bem. Células parentais devem ser cultivadas em paralelo em um pequeno frasco durante todo o processo e expostas ao veículo (DMSO) em volumes correspondentes imitando os montantes utilizados em balões o Docetaxel Tratado.
<ol><li>Células DU145 placa ou 22Rv1 em frascos de 2 a 150 cm, contendo 20 mL de mídia (3.5 x 10 6 células por balão para DU145 e 6.5 * 10 6 células por balão para 22Rv1). Recomenda-se uso de balões de 10 a 20 de células ter células suficientes, ao final do protocolo.</li>
	<li>Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência ( Figura 2B, antes Docetaxel), adicionar Docetaxel na concentração IC50 determinada na etapa 1 do protocolo (5 nM para as células descrito neste protocolo).</li>
	<li>Depois de 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar mídia fresca, livre de Docetaxel ( Figura 2B, 72 h após Docetaxel). Altere os meios de comunicação a cada 3-4 dias. Aproximadamente 1-2 semanas, clones resistentes aparecerão evidentes sob o microscópio ( Figura 2B, 7 e 14 dias depois de Docetaxel).</li>
	<li>Mídia, Aspire, lavar cuidadosamente as células com 15 mL de PBS e incubar com 4 mL 0,05% Trypsin-EDTA para 3-5 min a 37 ° C para separar as células da superfície do balão.</li>
	<li>Resuspend trypsinized células de frasco com 8 mL de mídia fresca. Células de piscina de todos os frascos de tratados. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, 3 min, RT).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de mídia fresca placa as células em frascos de 2 150 cm (3.5 x 10 6 células por balão para DU145 e 6.5 * 10 6 células por balão para 22Rv1).</li>
	<li>Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência, adicione 5 nM Docetaxel (concentração inicial de IC50) novo.</li>
	<li>Repita as etapas de 2,3 para 2,6 no dia 3.</li>
	<li>Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência, células de deleite com 2 X IC50 Docetaxel concentração (10 nM para as células descrito neste protocolo).</li>
	<li>Repetir passos 2.3 a 2.8, seguindo uma dose-escalonamento das concentrações de Docetaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM e 250 nM), para gerar uma população estável de células crescendo em seus balões sob a mais alta concentração final. Para concentrações mais elevadas, o protocolo de escalonamento de dose pode ser implementado por até 6 meses até que a concentração de 1.000 nM é alcançado ( figura 1A).</li>
</ol> 3. Funcionais caracterização de adquiriu Docetaxel resistência por ensaio de formação de colônia Nota: neste protocolo, chemoresistance foi avaliada utilizando ensaios de formação de colônia. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (i.e., ensaios MTS) podem ser usados com base na investigadores &#39; preferências.
<ol><li>Placa 2.000 células (DU145 ou 22Rv1, parental e Docetaxel-resistente) por bem em placas de 6-poços, usando 2 mL de mídia por alvéolo.</li>
	<li>Após 24 h, adicionar o aumento das concentrações de Docetaxel (células parentais: 0.25, 0.5, 1, 2,5 e 5 nM; Células de DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM). Para tanto, DU145 e 22Rv1 linhas de célula. Adicionar o DMSO somente para um bem como um controle no mesmo volume utilizado para a dose mais elevada de Docetaxel.</li>
	<li>Após 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar mídia fresca livre de Docetaxel.</li>
	<li>Incubar as placas durante 1-2 semanas até que colônias são visíveis sob o microscópio.</li>
	<li>Para manchar as colônias, lave-os delicadamente com 2-3 mL de PBS e incube-os com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p/v em formol a 10%) por dentro do capô de cultura de tecidos ou uma coifa de 20 min.</li>
	<li>Remover placas coloração de solução e lavagem com 2-3 mL de H 2 O, retire H 2 O e placas de secar ao ar.</li>
	<li>Analisar resultado visualizando os poços e manualmente, contando as colónias com a ajuda de uma caneta (para evitar a contagem das colônias mesmas duas vezes) e representam o percentual de viabilidade celular em um gráfico. Levar imagens digitais das placas para representação de figura ( Figura 3A).</li>
</ol> 4. Fenotípica caracterização de Docetaxel resistência adquirida fenótipo através de análise de qRT-PCR Nota: células Docetaxel-resistente (DR) apresentam um perfil de expressão diferente em comparação com suas linhas de célula parental 28 , 29. portanto, o sucesso da seleção pode ser verificado por qRT-PCR utilizando primers para marcadores específicos (para sequências da primeira demão, consulte a seção materiais; para obter detalhes, consulte a seção de resultados). Isso deve ser feito após cada rodada de seleção começam após a terceira rodada. Alternativamente, também é possível a avaliação do fenótipo resistente ao Docetaxel pela mancha ocidental.
<ol><li>Extrair RNA das células parentais e Docetaxel resistente usando um kit de extração de RNA e a seguir o fabricante &#39; instruções de s (veja a Tabela de materiais e reagentes para detalhes). Usando um mínimo de 1-2 x 10 6 células recomenda-se.</li>
	<li>Quantify RNA em 260 nm a absorvência, usando um espectrofotômetro. Para melhor pureza, os rácios de absorvância nm nm/280 260 devem estar perto de 2.0.</li>
	<li>PerfoRM reverso transcrição para obter DNA complementar (cDNA) usando o kit de transcrição reversa e seguindo o fabricante &#39; instruções de s (consulte a Tabela de materiais e reagentes para detalhes), usando 1 µ g de RNA em um 20 µ l mistura de reação (se é necessário uma maior quantidade de cDNA, ampliar o mix de reação conformemente).</li>
	<li>Preparar a reação de qPCR em triplicado para cada gene de interesse, como segue: - 2 µ l de primer para a frente de 10 µM - 2 µ l de primer reverso de 10 µM - 10 mistura de mestre SYBR Green PCR µ l - 5 µ l H 2 O -1 µ l de o cDNA recém preparado da etapa 4.3. 
	Nota: Consulte a Tabela de materiais para as sequências dos primers utilizados neste protocolo.</li>
	<li>Definir o programa PCR como segue: - 95 ° C por 15 min - 94 ° C por 30 s | 
	-56 ° C durante 40 s | 40 vezes - 72 ° C por 30 s |</li>
	<li>Para analisar resultados de qPCR e determinar alterações na expressão gênica entre parentais e DR amostras, os valores de limiar (Ct) de ciclo para cada gene de interesse são determinados em triplicado e a média normalizada para o controle de carregamento (média três vias de actina ) para DR (Ct DR) e células parentais (parental do Ct). Valores das células parentais são normalizados para 1. ΔCt (DR - Ct, Ct parental) é determinado a obter mRNA final prega mudanças e representado em um gráfico. Um aumento de &#62; 2 ou uma diminuição de &#60; 0,5 são considerados significativos e uma boa validação do estabelecimento do Docetaxel adquiriu o fenótipo resistente ( Figura 3B).</li>
</ol>

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<li>Rodriguez-Bravo, V., Carceles-Cordon, M., Hoshida, Y., Cordon-Cardo, C., Galsky, M. D., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+GATA2+in+lethal+prostate+cancer+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Urology%22%5BJournal%5D)">The role of GATA2 in lethal prostate cancer aggressiveness.</a> Nature reviews. Urology. 14 (1), 38-48 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este manuscrito, descrevemos um método para gerar sistemas de modelo de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel que permite o estudo dos mecanismos que contribuem para a aquisição do fenótipo chemoresistance. Enquanto essa abordagem é altamente confiáveis e reprodutíveis, devem ser consideradas algumas limitações potenciais. Desde que somente uma pequena fração da população em massa de células irá expor chemoresistance28, recomenda-se começar com uma grande população de células (nós geralmente chapear 20 frascos de 150 cm2, que representam aproximadamente 1,2 x 108 células). Etapas-chave do protocolo devem ser consideradas para garantir o sucesso do procedimento. Em primeiro lugar, é muito importante usar o mesmo Docetaxel preparadas ações para uso de longo prazo (estoque de 10mm alíquotas podem ser usadas por anos quando armazenado adequadamente na-80 ° C). Pequenas mudanças na alíquota do Docetaxel podem afetar os resultados de IC50, geração de sincronismo de linha da célula e os resultados de formação de colônia. Em segundo lugar, é fundamental iniciar o protocolo determinando o IC50 em cada linha da célula individual, desde que as variações podem ocorrer ao usar um novo lote de células. Em terceiro lugar, é essencial para monitorar o que o tratamento medicamentoso é eficaz, verificando as células sob o microscópio frequentemente para que quaisquer erros podem ser detectados rapidamente e corrigidos. Finalmente, recomendamos sempre manter um estoque de etapas intermediárias em caso de contaminação ou problemas inesperados que poderiam afetar a viabilidade das células no meio do protocolo. Importante, o nosso protocolo visa gerar modelos de resistência aos medicamentos, expondo as células de câncer de próstata a altas doses de Docetaxel para 72 h seguido por períodos de tempo de recuperação, em vez de concentrações constantes da droga na tentativa de imitar o melhor clínico cenário relatado para tratamento de câncer de próstata com este agente de taxano15,16.
Além disso, note-se que as células resistentes apresentam uma alta plasticidade, o que pode levar a uma perda progressiva das propriedades de resistência adquirida ao longo do tempo. Portanto, estendendo o uso dessas células para mais de 2-3 meses em cultura não é recomendado. Se uma fonte permanente é necessário é aconselhável gerar continuamente novos lotes de células resistentes. No entanto, se os lotes de células têm sido cultivadas por um tempo prolongado, ensaios de formação de colônia e qPCR podem ser usados para reavaliar sua resistência. Outra alternativa é aumentar a resistência minguante, tratando as células com uma alta dose de Docetaxel para 72 h (500-1.000 nM). Após um período de recuperação de uma a duas semanas, o fenótipo pode ser re-testado por qPCR e colônia formação ensaios. Também é possível, embora não seja recomendado, para armazenar as alíquotas de células tratadas em nitrogênio líquido (em FBS, 10% DMSO). Por favor, note que depois de um ciclo de congelamento e descongelamento, o fenótipo chemoresistance deve sempre ser reavaliado com os métodos acima mencionados.
Apesar dessas limitações, nós28,29 e outros30,31,32,33 foram capazes de empregar com êxito esses sistemas modelo para identificar a chave romance celular e mecanismos moleculares, levando a elevados tumor-iniciando capacidade de sobrevivência da célula e agressividade nas células resistentes ao Docetaxel. Usando estes sistemas de modelo de células de câncer, descobrimos que as células exibem um fenótipo indiferenciado, caracterizado pela ausência de marcadores de diferenciação epitelial e relacionadas com a próstata e a superexpressão de targetable do desenvolvimento (entalhe e Vias de sinalização Hedgehog), sobreviver exposição quimioterápicos28. Em um segundo estudo, usando estes modelos juntamente com os conjuntos de dados de gene paciente publicamente disponível24,25, descobrimos que o fator de transcrição pioneiro GATA2 é altamente overexpressed em metastático resistente a castração células de câncer de próstata resistente a quimioterapia. GATA2 aumenta a sobrevivência das células, ativando diretamente uma quinase a jusante IGF2 dependente sinalização rede29. Notadamente, estes estudos ajudados a identificar novos papéis-chave de GATA2 no câncer de próstata metastático avançado agressividade34.
O desenvolvimento de resistência às drogas é um problema que não está limitado a Docetaxel e câncer de próstata, como é comum entre muitos outros tipos de cancros tratados com uma grande variedade de medicamentos quimioterápicos. Com efeito, aplicam restrições semelhantes sobre a disponibilidade de modelos experimentais, e é concebível que nosso protocolo pode ser adaptado para estudar outros tipos de câncer e seus mecanismos de chemoresistance respectivos.
A geração de células resistentes ao Docetaxel, conforme descrito no presente protocolo pode ser usada como uma ferramenta funcional para identificar mecanismos moleculares e celulares relevantes romance de chemoresistance. Isso abre a porta para encontrar novos destinos, sobre a qual o desenvolvimento de novos tratamentos para câncer de próstata altamente maligno pode articular, mais uma vez empurrando as fronteiras do que sabemos sobre essa doença e como tratar seus pacientes.

Um aumento da taxa de proliferação, causada pela perda de controlo do ciclo celular é uma marca registrada de câncer1. Esta propriedade funcional processa células cancerosas exclusivamente dependente a fidelidade dos processos-chave do ciclo celular durante a S - e M-fases, que levou ao desenvolvimento de vários ciclo celular distorçer drogas que induzem o DNA danos ou defeitos mitóticos. Apesar de numerosos agentes antimitóticos, como inibidores de quinases mitóticas ou proteínas do motor, estão actualmente a ser desenvolvido e testado em ensaios clínicos, legado do microtubule direcionamento MTAs (agentes) continuam a ser a única abordagem clinicamente aprovada para direcionamento de mitose em câncer2,3,4. MTAs ou desestabilizam (vimblastina, vincristina, Vinorelbina) ou estabilizar microtúbulos (derivado de taxano agentes Paclitaxel, Docetaxel ou Cabazitaxel) e, assim, evitar a formação de um funcionamento fuso mitótico5,6. Esses agentes acionar o eixo conjunto posto7,8, que resulta em uma prolongada detenção mitótica e a morte eventual de célula em células cultivadas9,10 e defeitos mitóticos em tumores11 ,12 e são, portanto, útil para tratar uma grande variedade de cânceres, entre eles o câncer de próstata13.
Câncer de próstata é o mais frequentemente diagnosticado câncer e das principais causas de câncer relacionados a mortes em homens14. Agentes antimitóticos como Docetaxel melhorar a sobrevida do paciente com câncer de próstata e são dos pilares no tratamento desta doença15,16,17. Infelizmente, apesar do encolhimento do tumor inicial, as células do tumor frequentemente desenvolvem resistência aos medicamentos durante o tratamento. Vários mecanismos celulares têm sido implicados em causar o desenvolvimento de chemoresistance, incluindo desregulamentação de apoptotic e vias inflamatórias ou ativação/superexpressão de bombas de efluxo de drogas como o ATP-binding cassette transportador P-glicoproteína (P-gp/ABCB1), o último dos quais resulta na exportação de agentes quimioterápicos, fora as células18,19. Resistência à taxanos também tem sido associada com outras causas, tais como mudanças na expressão de tubulina isotipos ou mutações de tubulina, que impedem a interação entre a droga e seu alvo 20,21. Além disso, resistência tem sido relacionada com acúmulo de instabilidade do genoma e tumor heterogeneidade22,23. No entanto, os mecanismos que contribuem para a resistência de taxano não são completamente compreendidos, que manifesta-se pela ausência de estratégias terapêuticas que impedem a sua aparência. Portanto, há uma necessidade urgente para gerar modelos experimentais que auxiliam na dissecação desses mecanismos e identificar novas abordagens terapêuticas que impedem o desenvolvimento de resistência a estas drogas.
Neste artigo nós descrevemos um método que permite a geração de Docetaxel-resistente (DR) células cancerosas da próstata. Além disso, descreveremos como validar o status de resistência dessas células utilizando ensaios de formação de colônia e RT-PCR quantitativo. As células produzidas por esse método tem a vantagem de muitas das características moleculares encontradas em bancos de dados de amostra de tumor humano disponível publicamente com o benefício adicional de fornecer a versatilidade para executar uma grande variedade de ensaios experimentais sobre recapitulando longos períodos de tempo do que o permitido por amostras do tumor. Estes modelos de câncer de resistência de terapia podem ser expandidos por muitas semanas em cultura de tecidos e entre outras abordagens, pode ser geneticamente manipulados, visualizados por métodos de microscopia e analisados para expressão gênica. Além disso, eles podem ser xenotrasplanted em ratos para analisar mais efeitos no tumor de formação e crescimento em vivo. Atualmente, o principal método alternativo para estudar a resistência a medicamentos no contexto do câncer de próstata é a análise direta de amostras do tumor. Enquanto estas amostras apresentam um sistema muito potente para reunir informações sobre expressão gênica e status mutacional dos tumores determinados, acesso a eles pode ser muito limitado, e são difíceis de manter por mais manipulações e análise experimental, que pode ser feito facilmente com as linhas de célula geradas com este protocolo24,25. Importante, no futuro, alternativa abordagens tais como a geração de humanos organoids derivada diretamente de pacientes seria uma ferramenta muito poderosa e alternativa para o presente método26,27. Uma vez que eles serão recapitulate em um contexto 3D, um tumor que estava em seu ambiente original, organoids será o modelo perfeito entre linhagens celulares e tumores humanos. Ainda, os modelos de celular experimental descritos neste protocolo são ainda mais acessíveis para manter e apropriado para uma análise mais rápida. Os resultados obtidos através do estudo dessas linhas de células podem ser extrapolados para e corroborados em amostras humanas e culturas 3D. Portanto, este protocolo pode ser de interesse para os investigadores procuram modelos de celular estudar os mecanismos de chemoresistance em qualquer linha de celular, desde que nosso protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros tipos de câncer e drogas. Os métodos descritos aqui são fáceis de aplicar em qualquer laboratório, acessível e permitir estudos preliminares dos mecanismos moleculares e celulares da resistência às drogas.

<table><tbody><tr><td>Células DU145</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>22Rv1 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1148</td><td>em DMSO (10mM)</td></tr><tr><td>Frasco de cultura de tecidos 150cm2</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr> placas <tr><td>de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Suplementado com 10% de FBS e 1% de Penicilina/Estreptomicina</td></tr><tr><td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.05%Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III primeiro sistema de síntese de fita para RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina a 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Primers para qRT-PCR:</td> <td>Vida tecnologias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCCCCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTINA F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTINA R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica docetaxel

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule direcionamento MTAs (agentes) são dos pilares no tratamento de uma ampla variedade de tumores. No entanto, a resistência adquirida de quimioterápicos é um mecanismo comum de progressão da doença e uma característica determinante do prognóstico de tumores malignos. No cancro da próstata (PC), resistência à MTAs como o Docetaxel taxano dita insucesso do tratamento, bem como a progressão para estágios letais da doença que são definidos por um prognóstico pobre e altas taxas de mortalidade. Apesar de estudado durante décadas, a matriz de mecanismos que contribuem para a resistência adquirida não são completamente compreendidas e, portanto, representar uma limitação significativa para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que poderia beneficiar pacientes nestas fases de avançadas doença. Neste protocolo, descrevemos a geração de Docetaxel resistentes linhas de células de câncer de próstata que imitam características letais de câncer de próstata avançado e, portanto, pode ser usado para estudar os mecanismos pelos qual chemoresistance adquirida surge. Apesar de potenciais limitações intrínsecas a um modelo de célula com base, tais como a perda das propriedades de resistência ao longo do tempo, resistente ao Docetaxel linhas celulares produzidas por esse método tem sido utilizadas com sucesso em estudos recentes e oferecer a oportunidade de avançar nosso compreensão molecular da chemoresistance adquirida no câncer de próstata letal.

Este protocolo vai levar à geração de células de câncer de próstata resistente a Docetaxel (DR). O cronograma para conclusão pode variar de 4 a 7 meses como resumidos na representação esquemática das etapas protocolo na figura 1A e figura 1B. O investimento de tempo pode diferir dependendo da linhagem celular de escolha e a gama de concentrações de droga usado conforme descrito no protocolo. Importante, a determinação da concentração de Docetaxel IC50 para cada linha de celular permite o desenho da droga aumentando o intervalo de concentração para uso no protocolo para as células de escolha (Figura 2A). Uma vez que o protocolo é iniciado, os efeitos iniciais Docetaxel em células DU145 e 22Rv1 podem ser observados em pontos diferentes do tempo sob o microscópio para monitorar se o protocolo está funcionando corretamente. Sugeriu que os pontos de tempo para monitorar o processo de tratamento de Docetaxel são: antes da exposição ao Docetaxel (linha de base), após a exposição de Docetaxel para 72 h, dias 7 e 14 dias. Observe que apenas uma minoria de células tumorais sobreviver à exposição de Docetaxel e gerar clones, que podem ser observadas ao microscópio (Figura 2B).
Ensaios de formação de colônia representativa e gráficos de quantificação de parental e as células recém-gerado Docetaxel-resistente (DR) são mostradas na Figura 3A. Observe que as células resistentes ao Docetaxel geradas podem sobreviver as concentrações de drogas até 1,000-fold mais elevadas do que as células parentais.
Finalmente, o fenótipo resistente ao Docetaxel pode ser validado por qRT-PCR (Figura 3B). Observe que células resistentes ao Docetaxel, em comparação com as células parentais, exibem regulação característica de ABCB1 e GATA2 e para baixo-regulamento de CK19 e CDH1. Estes genes foram selecionados para validação porque temos já experimentalmente demonstrado no nosso trabalho anteriormente publicado GATA2 upregulation e downregulation de CK19 juntamente com CDH1 em ambos de28,de modelos de célula DR29. O gene ABCB1 também foi selecionado como um gene descontínuas que tem sido mostrado por outros para ser consistentemente upregulated em células resistentes aos medicamentos18,19. No entanto, é importante notar que outros genes podem ser escolhidos de acordo com a literatura e dependendo dos modelos de célula e as drogas escolhidas para a geração de células resistentes pelo pesquisador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
Figura 1: linha do tempo para a geração de modelos de célula de câncer de próstata resistente ao Docetaxel. (A) diagrama representativo do protocolo cronograma para geração de modelos de célula Docetaxel-resistente. Ilustração retrata o tratamento Docetaxel, etapas de validação e tempo necessário para cada parte. (B) representação esquemática das etapas de validação do protocolo incluindo ensaios de formação de colônia funcional das células parentais e Docetaxel-resistente, tratados com as concentrações de Docetaxel indicadas para 72 h (em vermelho), representante gráfico da percentagem de colônia e qRT-PCR para validação fenotípica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
Figura 2: geração de sistemas de modelo de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel. (A) diagrama representando a determinação do Docetaxel IC50 nas linhas de células de câncer de próstata parental DU145 e 22Rv1 (etapa 1 do protocolo). Esperado percentagens de viabilidade celular e o Docetaxel concentrações crescentes de dose necessária estão incluídas. Gráficos de viabilidade indicando 5 de células DU145 representante e 22Rv1 nM como o IC50 após 72 h de exposição Docetaxel são incluídos. Os experimentos são triplica e dados representam as imagens de microscopia de campo claro representante SD. (B) média ± de DU145 e células de 22Rv1 no indicaram vezes durante a geração da resistência Docetaxel (etapa 2 do protocolo). Setas vermelhas indicam um clone Docetaxel resistente após a conclusão do protocolo. Barras de escala = 50 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
Figura 3: Caracterização fenotípica e funcional dos modelos de célula resistente ao Docetaxel. (A) ensaios de formação de representante da colônia de células parentais e Docetaxel-resistente, tratados com as concentrações de Docetaxel indicadas por 72 h. percentagem de colônias para cada concentração de tratamento é representada no gráfico incluído. Os experimentos são triplica e dados representam a média ± SD. escala barras = 5 mm. (B) DR/parental mRNA dobra aumento relativo quantificada por qRT-PCR de ABCB1, GATA2, CK19 e CDH1 são mostrados. Todos os dados brutos de qPCR é normalizado de actina (Veja o protocolo para obter detalhes). Os experimentos são triplica e dados representam a média ± DP. * p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Resistência às terapias de câncer contribui para a morte e a progressão da doença. Determinar as bases mecanicistas da resistência é crucial para melhorar a resposta terapêutica. Este detalhes de manuscrito o protocolo para gerar modelos metastizado resistente de células de câncer de próstata (PC) para ajudar a dissecar as vias envolvido na progressão para resistência de Docetaxel em pacientes de PC.

Geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar modelos experimentais de células cancerígenas resistentes ao docetaxel como uma plataforma para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam a resistência à terapia antimitótica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia das células cancerígenas e genomaticas, como identificar as vias de sinalização que contribuem para a progressão da doença e determinar possíveis estratégias direcionáveis. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma maneira confiável e fácil de gerar modelos experimentais para estudar as respostas a medicamentos anticâncer, além de usar amostras de tumores de pacientes e modelos animais.Demonstrando o procedimento estarão Lisa Mohr, uma pós-doutoranda do meu laboratório, e Jungreem Woo, outro pós-doutorando em nossa equipe. Para iniciar este procedimento, coloque as células DU145 ou 22Rv1 nos frascos quadrados de 150 centímetros contendo 20 mililitros de mídia. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, adicione Docetaxel a cinco nanomolares.Após 72 horas, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um novo meio sem docetaxel. Mude a mídia a cada três ou quatro dias. Aguarde uma a duas semanas até que os clones apareçam no balão.Aspire o meio, lave cuidadosamente as células com 15 mililitros de PBS e incube-as com quatro mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA por três a cinco minutos a 37 graus Celsius para separar as células da superfície do frasco. Em seguida, ressuspenda as células tripsinizadas do frasco usando oito mililitros de meio fresco. Retirar as células de todos os frascos tratados e forçá-las por centrifugação.Em seguida, remova o superna-den, ressuspenda o pellet celular em 20 mililitros de meio fresco e coloque as células em frascos quadrados de 150 centímetros. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, adicione cinco Docetaxel nanomolar novamente. Repetir os procedimentos como indicado anteriormente até que os clones apareçam no balão.Em seguida, coloque as células em frascos quadrados de 150 centímetros novamente. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, trate-as com Docetaxel 10 nanomolares. Repita as mesmas etapas da maneira crescente da dose de docetaxel e continue agrupando os clones sobreviventes após cada tratamento de concentração.No final do processo, você obterá um pool de células resistentes prontas para uso experimental. Neste procedimento, placa 2.000 células usando 2 mililitros de meio por poço nas placas de seis poços. Após 24 horas, adicione concentrações crescentes de Docetaxel para as linhas celulares DU145 e 22Rv1.Adicione DMSO apenas a um poço como controle no mesmo volume usado para a dose mais alta de Docetaxel. Após 72 horas, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um novo meio sem docetaxel. Incube as placas por uma a duas semanas até que as colônias sejam visíveis ao microscópio.Para manchar as colônias, lave-as suavemente com dois a três mililitros de PBS. Incube-os com dois a três mililitros de solução de cristal violeta por 20 minutos dentro da capela de cultura de tecidos ou capela de exaustão. Em seguida, remova a solução em repouso e lave as placas com dois a três mililitros de água.Em seguida, remova a água e seque as placas ao ar. Tire imagens digitais das placas para representação de figuras. Analise o resultado visualizando os poços e contando manualmente as colônias com a ajuda de uma caneta marcadora.E representam a porcentagem de viabilidade celular em um gráfico. Aqui está um diagrama que descreve a determinação do Docetaxel IC50 nas linhagens celulares de câncer de próstata parental DU145 e 22Rv1. As porcentagens esperadas de viabilidade celular nas concentrações crescentes de dose de docetaxel necessárias são mostradas aqui.E aqui estão as imagens representativas de microscopia de campo claro das células DU145 e 22Rv1 nos momentos indicados durante a geração de resistência ao docetaxel. As setas vermelhas indicam um clone resistente ao docetaxel após a conclusão do protocolo. Aqui são mostrados os ensaios representativos de formação de colônias correspondentes à validação funcional das células resistentes ao docetaxel.As células foram expostas a concentrações crescentes de Docetaxel e a sobrevivência avaliada pela coloração com cristal violeta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar e validar linhagens celulares resistentes a medicamentos, que podem ser usadas para exames e procedimentos de sua escolha, como análise de expressão gênica e manipulações genéticas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

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Cancer Research

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