Geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica Docetaxel

O objetivo geral deste procedimento é gerar modelos experimentais de células cancerígenas resistentes ao docetaxel como uma plataforma para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam a resistência à terapia antimitótica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia das células cancerígenas e genomaticas, como identificar as vias de sinalização que contribuem para a progressão da doença e determinar possíveis estratégias direcionáveis. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma maneira confiável e fácil de gerar modelos experimentais para estudar as respostas a medicamentos anticâncer, além de usar amostras de tumores de pacientes e modelos animais.

Demonstrando o procedimento estarão Lisa Mohr, uma pós-doutoranda do meu laboratório, e Jungreem Woo, outro pós-doutorando em nossa equipe. Para iniciar este procedimento, coloque as células DU145 ou 22Rv1 nos frascos quadrados de 150 centímetros contendo 20 mililitros de mídia. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, adicione Docetaxel a cinco nanomolares.

Após 72 horas, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um novo meio sem docetaxel. Mude a mídia a cada três ou quatro dias. Aguarde uma a duas semanas até que os clones apareçam no balão.

Aspire o meio, lave cuidadosamente as células com 15 mililitros de PBS e incube-as com quatro mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA por três a cinco minutos a 37 graus Celsius para separar as células da superfície do frasco. Em seguida, ressuspenda as células tripsinizadas do frasco usando oito mililitros de meio fresco. Retirar as células de todos os frascos tratados e forçá-las por centrifugação.

Em seguida, remova o superna-den, ressuspenda o pellet celular em 20 mililitros de meio fresco e coloque as células em frascos quadrados de 150 centímetros. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, adicione cinco Docetaxel nanomolar novamente. Repetir os procedimentos como indicado anteriormente até que os clones apareçam no balão.

Em seguida, coloque as células em frascos quadrados de 150 centímetros novamente. Após 24 horas, quando as células estiverem em cerca de 70 a 80% de confluência, trate-as com Docetaxel 10 nanomolares. Repita as mesmas etapas da maneira crescente da dose de docetaxel e continue agrupando os clones sobreviventes após cada tratamento de concentração.

No final do processo, você obterá um pool de células resistentes prontas para uso experimental. Neste procedimento, placa 2.000 células usando 2 mililitros de meio por poço nas placas de seis poços. Após 24 horas, adicione concentrações crescentes de Docetaxel para as linhas celulares DU145 e 22Rv1.

Adicione DMSO apenas a um poço como controle no mesmo volume usado para a dose mais alta de Docetaxel. Após 72 horas, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um novo meio sem docetaxel. Incube as placas por uma a duas semanas até que as colônias sejam visíveis ao microscópio.

Para manchar as colônias, lave-as suavemente com dois a três mililitros de PBS. Incube-os com dois a três mililitros de solução de cristal violeta por 20 minutos dentro da capela de cultura de tecidos ou capela de exaustão. Em seguida, remova a solução em repouso e lave as placas com dois a três mililitros de água.

Em seguida, remova a água e seque as placas ao ar. Tire imagens digitais das placas para representação de figuras. Analise o resultado visualizando os poços e contando manualmente as colônias com a ajuda de uma caneta marcadora.

E representam a porcentagem de viabilidade celular em um gráfico. Aqui está um diagrama que descreve a determinação do Docetaxel IC50 nas linhagens celulares de câncer de próstata parental DU145 e 22Rv1. As porcentagens esperadas de viabilidade celular nas concentrações crescentes de dose de docetaxel necessárias são mostradas aqui.

E aqui estão as imagens representativas de microscopia de campo claro das células DU145 e 22Rv1 nos momentos indicados durante a geração de resistência ao docetaxel. As setas vermelhas indicam um clone resistente ao docetaxel após a conclusão do protocolo. Aqui são mostrados os ensaios representativos de formação de colônias correspondentes à validação funcional das células resistentes ao docetaxel.

As células foram expostas a concentrações crescentes de Docetaxel e a sobrevivência avaliada pela coloração com cristal violeta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar e validar linhagens celulares resistentes a medicamentos, que podem ser usadas para exames e procedimentos de sua escolha, como análise de expressão gênica e manipulações genéticas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.