Name: O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a reconstituir organoides intestinais a partir de células-tronco Lgr5+ e células de nicho de Paneth para análise funcional. Este método permite modificações genéticas e bioquímicas específicas por tipo celular.

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Este estudo foi viabilizado pelo financiamento da sociedade holandesa de câncer (KWF; EMCR 2012-5473) e a World câncer pesquisa fundos International (WCRF; projeto n º 2014-1181)

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e leis de bem-estar animal local.
1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos
<ol><li>Conjunto de autoclave 1 de intestinal tesoura, tesoura normal e fórceps em recipiente estéril.</li>
	<li>Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na tabela de materiais.</li>
	<li>Incube o meio completo a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Degelo reconstituído a membrana basal, colocando-o em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C.</li>
	<li>Encha 4 placas de Petri com frio tampão fosfato-salino ou abreviado PBS (4 ° C).</li>
</ol>2. isolamento de pequenas criptas intestinais
<ol><li>Sacrifica-se por inalação de CO2 - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5mouse sobre um fundo C57BL6/J. Disse o peritônio longitudinalmente com uma tesoura.</li>
	<li>Segure o estômago com a pinça e cortar transversalmente no meio.</li>
	<li>Usando a tesoura intestinal de agora em diante, puxe para fora o intestino e colocá-lo em uma placa de Petri contendo PBS. Nota: Tesoura Intestinal tem uma acentuada e uma ponta romba. Destina-se a ponta romba dessas tesouras para não danificar a arquitetura da cripta-vilosidades durante a abertura do intestino.</li>
	<li>Comece colocando a ponta romba para o estômago e empurre suavemente através do piloro. Continue cortando com a tesoura e puxar com a pinça.</li>
	<li>Uma vez que o intestino delgado inteiro é aberto longitudinalmente, lavá-lo em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguá-lo suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.</li>
	<li>Uma vez que todos os restos de fezes são limpas, proceda a achatar o intestino em uma placa de corte, luminal para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e por sua aparência pálida em comparação com a parte externa.</li>
	<li>Com uma lâmina de vidro, retire com cuidado as vilosidades raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido.</li>
	<li>Corte o intestino com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 mm.</li>
	<li>Coloque os pequenos fragmentos intestinais em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS frio gelo.</li>
	<li>Limpe os fragmentos de tecido, removendo as impurezas restantes pipetando-los acima e para baixo na PBS. Descartar o sobrenadante e repita este passo até o PBS é completamente claro.</li>
	<li>Adicione 15 mL PBS frio, para trazer o volume total final de PBS para 25 mL. Adicionar 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 45 min em um rolo em 4 ° C.</li>
	<li>Descarte o PBS/EDTA.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de PBS e separe as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido acima e para baixo (pelo menos três vezes). Recolha o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 2.13 quatro vezes. Adicione o meio de cultura para alcançar um volume final de 50 mL.</li>
	<li>Granule as células por centrifugação (300 x g por 5 min).</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura e as criptas de pelotas por centrifugação (80 x g durante 3 minutos).</li>
</ol>3. única célula preparação
<ol><li>Descartar o sobrenadante de criptas peletizadas e Resuspenda-los em 1ml tripsina como-enzimas juntamente com 50 µ l DNAse (50 µ g/mL).</li>
	<li>Incube as células em um banho de água a 32 ° C por 2 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio de cultura. Dissocia as criptas em única células pipetando severamente acima e para baixo pelo menos 5 vezes.</li>
	<li>Filtrar a solução através de um filtro de 40 µm (para eliminar grumos e outras impurezas) e as células única a 300 x g por 5 min de Pelotas.</li>
</ol>4. chapeamento e citometria de fluxo
<ol><li>Prepare-se 50 mL de solução salina tamponada de 1 x Hank ou HBSS/2% solução de soro (FCS) de vaca fetal e resuspenda o pellet em 1 mL para cada 106 células</li>
	<li>Adicione à suspensão de células Lin BV421– (CD31, CD45, TER119) na concentração de 1: 100 e CD24-APC e CD117-PE os dois em uma concentração de 1: 250 anticorpos durante 30 min.</li>
	<li>Tipo Lgr5+ células-tronco e células de Paneth em baixa separada ligam os tubos. Para obter detalhes sobre a classificação de protocolos para Lgr5+ e células de Paneth, consulte Roth et al . 7 e. Schewe et al 6<ol>
<li>Centrifugar as células classificadas a 300 x g durante 5 min. Ressuspender as células em meio de 100 µ l com os componentes descritos como em 1.3 (consulte a Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Por exemplo, por modificação genética ou química) tratar as células de Paneth (n = 2000) ou as células-tronco Lgr5+ (n = 2000).<ol>
<li>Para tratar as células, usar 5 µ l de reagente de transfeccao lipossoma-mediada em um volume total de 100 µ l meio de cultura e RNA de interferência pequeno (siRNA) na concentração de 100 nM. Incube durante 30 min a 37 ° C para siRNA ou durante o tempo necessário para a modificação escolhida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as células duas vezes em meio de cultura 500 µ l.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e ressuspender as células em meio de cultura 10 µ l.</li>
	<li>Os dois componentes celulares da piscina (Paneth ou Lgr5+ células) em um 20 µ l volume total e centrifugar 300 x g por 5 min à RT</li>
	<li>Co Incubar o Paneth e células de Lgr5+ por 10 min a RT</li>
	<li>Remover 10 µ l do sobrenadante e deixar um menisco do líquido para ter certeza de não aspirar o centrifugado.</li>
	<li>Adicionar 30 µ l de leite reconstituído da membrana basal das células para um volume total de 40 µ l, Ressuspender as células e a placa em uma placa bem 96 previamente aquecido. Depois de 10 min, adicionar 200 µ l de meio completo (veja a Tabela de materiais). Médio de mudança cada 48 h.</li>
	<li>Multiplicidade de organoides contagem no dia 5.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Os autores têm nenhum interesse financeiro concorrente ou outros conflitos de interesses

O ORA permite a análise funcional refinada dos dois componentes essenciais de nicho de células-tronco intestinal, ou seja, Lgr5+ e células de Paneth. Esta abordagem tem sido empregada anteriormente por nós e outros, com pequenas modificações,6,10,11. Aqui, apresentamos o procedimento ORA como um protocolo do laboratório reproduzíveis e padronizada. Além disso, relatamos sobre os efeitos da Apc downre...

O epitélio intestinal é o tecido mais rapidamente auto renovadora no corpo dos mamíferos e, como tal, tem sido objeto de uma infinidade de estudos vista a identificação e caracterização funcional das células-tronco adultas que residem no fundo da cripta de Lieberkühn, afectada pela expressão do gene Lgr5 e dependente de sinais de Wnt canônico1. Nomeadamente, Lgr5+ células-tronco são flanqueadas e suportadas por células especializadas de nicho, ou seja, células de Paneth, que também dependem de sinalização de Wnt para sua maturação2. Juntos, esses tipos de duas células subjacentes a auto-renovação do revestimento epitelial intestinal e preservar o equilíbrio homeostático diário: Lgr5+ células-tronco rapidamente dividir e dar origem a progenitora e mais especializada intestinal epitelial células; Células de Paneth fornecem factores essenciais de nicho (por exemplo, Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ tronco células2. A capacidade das criptas intestinais quando chapeado ex vivo para formar estruturas organizadas e auto renovadora chamado organoids, ou "minicoragem", tem sido explorada como uma ferramenta experimental para fornecer informações sobre processos de auto-renovação e diferenciação em condições normais e patológicas, incluindo câncer4. Organoides culturas se estabeleceram de vários tecidos, incluindo o intestino, pâncreas, fígado e rim, de rato e humanos amostras4. O método de extração e os fatores de crescimento, empregados para desenvolver essas culturas organoides são tecido-específica e projetadas para dirigir a diferenciação da linhagem multi e imitar tão perto quanto possível do original nicho de células-tronco in vivo. Organoids pode ter aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças genéticas, a avaliação da eficácia terapêutica em câncer, a análise de toxicidade da droga ou o estudo da organogênese em vitro5.
Em geral, a principal limitação das culturas organoides quando estabelecido a partir de amostras de tecido é uma falta de especificidade celular. Por exemplo, organoids intestinais estabelecidas de criptas toda intestinais não permitem a análise de componentes celulares individuais englobadas dentro da fonte de tecido (por exemplo, toda criptas contêm Lgr5+, Paneth, e células progenitoras).
Aqui, descrevemos um método novo, referido como ORA, que combina as vantagens das culturas de organoides intestinal com a análise funcional dos seus componentes mais fundamentais, ou seja, tronco (Lgr5+) e células de nicho (Paneth). Isto é conseguido através da capacidade única de Paneth e células de Lgr5+ para associar fisicamente uns com os outros quando co incubados e dar origem a organoids2,6,10. Nós aproveitou-se desse recurso e pre-tratados os tipos de duas células individualmente antes de permitir-lhes reconstituir o organoids. Ao fazer isso, cada componente da célula pode ser exposto a determinada droga, fator de crescimento, inibidor de bioquímica, modificação genética ou tratamento químico antes da reconstituição e formação de organoides. Portanto, usando o ensaio ORA permitirá a determinação de se um tratamento medicamentoso específico ou modificação genética tem um efeito específico sobre as células-tronco ou sua contraparte de nicho.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Concentração final: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Concentração final: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Concentração final: 10 mM</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Concentração final: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Noggin murino recombinante *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentração final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Concentração final: 10 &micro; M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Concentração final: 1 &micro; M</td></tr><tr><td>R-espondina murina recombinante *</td><td>R& D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentração final: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Concentração final: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* A combinação desses reagentes constitui o meio</td><td></td><td></td><td></td> de cultura completo</tr></tbody></table>

o ensaio de reconstituição de organoides (ora) para a análise funcional do tronco intestinal e nicho de células

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

O epitélio intestinal é caracterizado por uma taxa extremamente rápida de volume de negócios. Nos mamíferos, o forro epithelial todo se renova dentro de 4-5 dias. Células-tronco adultas intestinais residem no fundo das criptas de Lieberkühn, são afectadas pela expressão do gene Lgr5 e preservar a homeostase através de sua característica alta taxa proliferativa1. Ao longo do intestino delgado, Lgr5+ células-tronco são entremeadas com células secretoras especializadas, chamadas células de Paneth. Células de Paneth secretam compostos antibacterianos (i.e., lisozima e cryptdins/defensinas) e exercem um papel de controlo sobre a flora intestinal. Mais recentemente, foi descoberta uma nova função para as células de Paneth, ou seja, sua capacidade para fornecer suporte de nicho de células-tronco Lgr5+ através de vários ligantes chaves como Wnt3, EGF e Dll12.
Quando isolada ex vivo e cultivados na presença de fatores de crescimento específicos e componentes da matriz extracelular, criptas intestinais todo dão origem a long-lived e auto renovar estruturas 3D chamado organoids que muito se assemelham a cripta-vilosidades arquitetura epitelial do intestino delgado adulto3. Organoides culturas, quando estabelecida de toda criptas, permitem o estudo de auto-renovação e diferenciação de nicho de células-tronco intestinal, embora sem abordar a contribuição dos seus componentes individuais, ou seja a Lgr5+ e Células de Paneth.
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o ensaio de organoides que aproveita a capacidade de Paneth e células de Lgr5+ para associar e formar organoids quando cultivadas co. Esta abordagem, aqui referida como "ensaio de reconstituição de organoides" (ORA), permite a modificação genética e bioquímica de Paneth ou Lgr5+ células-tronco, seguidas por reconstituição em organoids. Como tal, permite a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinal.

O ensaio de reconstituição de organoides permite a análise funcional separada dos componentes essenciais da ameia e células-tronco do epitélio intestinal, aqui demonstrado pelo RNA de interferência pequeno (siRNA) do gene Apc .
Para atingir este objectivo, primeiro utilizamos o fluorescente ativado celular classificação (FACS) para separar puras camundongos C57BL6/J 8000 Lgr5+ de células e 6000 célul...

Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5+) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

O objetivo geral do ensaio de reconstituição organoide é a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinais Lgr5 positivo nas células de Paneth por meio de sua modificação genética ou bioquímica seguida de reconstituição em organoides auto-renovadores. Este método permite abordar questões-chave específicas no campo das células-tronco intestinais, como modificação genética ou bioquímica em células-tronco e de nicho. A principal vantagem dessa técnica é que, ao contrário de outros ensaios que usam criptas inteiras, ela emprega células-tronco e nicho classificadas, permitindo assim a análise específica do tipo de célula.A demonstração em vídeo desse método é crítica, especialmente quando se trata das etapas de dissociação do tecido e manuseio celular. Se não forem executadas corretamente, essas etapas levarão a uma baixa viabilidade celular, especialmente após a classificação dos fatos. Comece este procedimento com a preparação de materiais e sacrifício de um camundongo Lgr5 em um fundo C57BL / 6J, conforme descrito no protocolo de texto.Disseque o peritônio longitudinalmente com uma tesoura. Segure o estômago com a pinça e corte-o transversalmente ao meio usando uma tesoura intestinal deste ponto em diante. Retire o intestino e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS.Comece colocando a ponta romba no estômago e empurre-a suavemente através do piloro. Prossiga cortando com a tesoura e puxando com a pinça. Uma vez que todo o intestino delgado esteja aberto longitudinalmente, lave-o em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguando-o suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.Depois que todos os restos de fezes forem removidos, prossiga para achatar o intestino em uma tábua de cortar, com o lado luminal voltado para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e por sua aparência pálida quando comparado com a parte externa. Com uma lâmina de vidro, remova suavemente as vilosidades raspando o intestino achatado.Execute a etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido. Em seguida, corte o intestino delgado com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de dois a cinco milímetros. Coloque os fragmentos do intestino delgado em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado.Limpe os fragmentos de tecido removendo quaisquer impurezas remanescentes pipetando-os para cima e para baixo no PBS. Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo até que o PBS esteja completamente limpo. Em seguida, adicione 15 mililitros de PBS frio para elevar o volume final total de PBS para 25 mililitros.Adicione dois EDTA milimolares e incube por 45 minutos em um rolo a quatro graus Celsius. Depois de descartar o PBS EDTA, adicione 10 mililitros de PBS e separe as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido para cima e para baixo. Em seguida, colete o sobrenadante.Repita esta etapa quatro vezes. Adicionar meio de cultura até atingir um volume final de 50 mililitros. Pellet as células por centrifugação.Finalmente, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura antes de peletizar as criptas por centrifugação. Para a preparação de uma única célula, primeiro descarte o sobrenadante das criptas peletizadas e ressuspenda-as em um mililitro de enzimas semelhantes à tripsina junto com 50 microlitros de DNase. Incube as células em banho-maria a 32 graus Celsius por dois minutos.Depois de adicionar 10 mililitros de meio de cultura, dissocie as criptas em células únicas, pipetando duramente para cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Filtre a solução através de um filtro de 40 mícrons para eliminar aglomerados e outras impurezas. Em seguida, jogue as células individuais a 300 vezes a gravidade por cinco minutos.Para citometria de fluxo, ressuspenda o pellet em um mililitro de uma solução salina tamponada de X Hank com 2% de soro fetal de vaca para cada milhão de células. À suspensão celular, adicione anticorpos marcados com Brilliant Violet 421 para marcadores de linhagem CD31, CD45 e Ter119 em uma concentração de um a 100. Além disso, adicione anti-CD24 APC e anti-CD117 PE na concentração de um a 250.Após 30 minutos, separe as células-tronco Lgr5 positivas e as células de Paneth em tubos separados de baixa ligação. Centrifugue as células classificadas a 300 vezes a gravidade por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de meio com os componentes descritos no protocolo de texto.Para tratar as células, use cinco microlitros de reagente de transfecção mediado por lipossomas em um volume total de 100 microlitros de meio de cultura e pequeno RNA interferente a uma concentração de 100 nanomolares. Incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius para pequenos RNAs interferentes ou pelo tempo necessário para a modificação escolhida. Lave as células duas vezes em 500 microlitros de meio de cultura.Depois de centrifugar as células a 300 vezes a gravidade por cinco minutos, ressuspendê-las em 10 microlitros de meio de cultura. Em seguida, agrupe os dois componentes celulares em um volume total de 20 microlitros antes de centrifugar a 300 vezes a gravidade por cinco minutos à temperatura ambiente. Co-incubar as células positivas de Paneth e Lgr5 por 10 minutos em temperatura ambiente.Retirar 10 microlitros do sobrenadante e deixá-los num líquido para evitar a aspiração do sedimento celular. Em seguida, adicione 30 microlitros de membrana basal reconstituída às células para um volume total de 40 microlitros. Ressuspenda as células e coloque-as em uma placa pré-aquecida de 96 poços.Após 10 minutos, adicione 200 microlitros de meio completo. Troque o meio a cada 48 horas. Finalmente, conte a multiplicidade organoide no quinto dia.Pequenos knockdowns mediados por RNA interferente do gene APC murino em células-tronco positivas para Lgr5 e a ativação resultante da via de sinalização canônica Wnt / beta-catenina afetam positivamente a multiplicidade de organoides quando comparados às suas contrapartes não tratadas ou ao controle de sequência embaralhada. A constituição da ativação de Wnt também resgata a necessidade de células de Paneth, conforme relatado anteriormente. Além disso, esses organoides aparecem como esferas ocas, um fenótipo bem descrito para organoides mutantes APC ou estimulados por Wnt quando comparados com a morfologia daqueles obtidos a partir de dublês de células Paneth-Lgr5.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se executada corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante seguir todas as etapas e tempos de incubação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair a cripta intestinal, preparar um resumo de célula única e reconstituir células de nicho e células-tronco para gerar organoides.Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo das células-tronco intestinais dissecarem os efeitos específicos das células-tronco ou de nicho no intestino delgado ou no intestino grosso do camundongo. Embora este método tenha sido estabelecido para a análise funcional do nicho de células-tronco intestinais, ele também pode ser aplicado a outros nichos de células-tronco somáticas, como a glândula mamária ou o folículo piloso. Após este procedimento, experimentos adicionais podem ser realizados para analisar a expressão da proteína do genoma nos organoides, como QPCR ou Western blotting.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Aprenda a reconstituir organoides intestinais a partir de células-tronco Lgr5+ e células de nicho de Paneth para análise funcional. Este método permite modificações genéticas e bioquímicas específicas por tipo celular.

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

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