Name: O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a reconstituir organoides intestinais a partir de células-tronco Lgr5+ e células de nicho de Paneth para análise funcional. Este método permite modificações genéticas e bioquímicas específicas por tipo celular.

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Este estudo foi viabilizado pelo financiamento da sociedade holandesa de câncer (KWF; EMCR 2012-5473) e a World câncer pesquisa fundos International (WCRF; projeto n º 2014-1181)

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e leis de bem-estar animal local.
1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos
<ol><li>Conjunto de autoclave 1 de intestinal tesoura, tesoura normal e fórceps em recipiente estéril.</li>
	<li>Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na tabela de materiais.</li>
	<li>Incube o meio completo a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Degelo reconstituído a membrana basal, colocando-o em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C.</li>
	<li>Encha 4 placas de Petri com frio tampão fosfato-salino ou abreviado PBS (4 ° C).</li>
</ol>2. isolamento de pequenas criptas intestinais
<ol><li>Sacrifica-se por inalação de CO2 - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5mouse sobre um fundo C57BL6/J. Disse o peritônio longitudinalmente com uma tesoura.</li>
	<li>Segure o estômago com a pinça e cortar transversalmente no meio.</li>
	<li>Usando a tesoura intestinal de agora em diante, puxe para fora o intestino e colocá-lo em uma placa de Petri contendo PBS. Nota: Tesoura Intestinal tem uma acentuada e uma ponta romba. Destina-se a ponta romba dessas tesouras para não danificar a arquitetura da cripta-vilosidades durante a abertura do intestino.</li>
	<li>Comece colocando a ponta romba para o estômago e empurre suavemente através do piloro. Continue cortando com a tesoura e puxar com a pinça.</li>
	<li>Uma vez que o intestino delgado inteiro é aberto longitudinalmente, lavá-lo em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguá-lo suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.</li>
	<li>Uma vez que todos os restos de fezes são limpas, proceda a achatar o intestino em uma placa de corte, luminal para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e por sua aparência pálida em comparação com a parte externa.</li>
	<li>Com uma lâmina de vidro, retire com cuidado as vilosidades raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido.</li>
	<li>Corte o intestino com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 mm.</li>
	<li>Coloque os pequenos fragmentos intestinais em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS frio gelo.</li>
	<li>Limpe os fragmentos de tecido, removendo as impurezas restantes pipetando-los acima e para baixo na PBS. Descartar o sobrenadante e repita este passo até o PBS é completamente claro.</li>
	<li>Adicione 15 mL PBS frio, para trazer o volume total final de PBS para 25 mL. Adicionar 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 45 min em um rolo em 4 ° C.</li>
	<li>Descarte o PBS/EDTA.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de PBS e separe as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido acima e para baixo (pelo menos três vezes). Recolha o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 2.13 quatro vezes. Adicione o meio de cultura para alcançar um volume final de 50 mL.</li>
	<li>Granule as células por centrifugação (300 x g por 5 min).</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura e as criptas de pelotas por centrifugação (80 x g durante 3 minutos).</li>
</ol>3. única célula preparação
<ol><li>Descartar o sobrenadante de criptas peletizadas e Resuspenda-los em 1ml tripsina como-enzimas juntamente com 50 µ l DNAse (50 µ g/mL).</li>
	<li>Incube as células em um banho de água a 32 ° C por 2 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio de cultura. Dissocia as criptas em única células pipetando severamente acima e para baixo pelo menos 5 vezes.</li>
	<li>Filtrar a solução através de um filtro de 40 µm (para eliminar grumos e outras impurezas) e as células única a 300 x g por 5 min de Pelotas.</li>
</ol>4. chapeamento e citometria de fluxo
<ol><li>Prepare-se 50 mL de solução salina tamponada de 1 x Hank ou HBSS/2% solução de soro (FCS) de vaca fetal e resuspenda o pellet em 1 mL para cada 106 células</li>
	<li>Adicione à suspensão de células Lin BV421– (CD31, CD45, TER119) na concentração de 1: 100 e CD24-APC e CD117-PE os dois em uma concentração de 1: 250 anticorpos durante 30 min.</li>
	<li>Tipo Lgr5+ células-tronco e células de Paneth em baixa separada ligam os tubos. Para obter detalhes sobre a classificação de protocolos para Lgr5+ e células de Paneth, consulte Roth et al . 7 e. Schewe et al 6<ol>
<li>Centrifugar as células classificadas a 300 x g durante 5 min. Ressuspender as células em meio de 100 µ l com os componentes descritos como em 1.3 (consulte a Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Por exemplo, por modificação genética ou química) tratar as células de Paneth (n = 2000) ou as células-tronco Lgr5+ (n = 2000).<ol>
<li>Para tratar as células, usar 5 µ l de reagente de transfeccao lipossoma-mediada em um volume total de 100 µ l meio de cultura e RNA de interferência pequeno (siRNA) na concentração de 100 nM. Incube durante 30 min a 37 ° C para siRNA ou durante o tempo necessário para a modificação escolhida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as células duas vezes em meio de cultura 500 µ l.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e ressuspender as células em meio de cultura 10 µ l.</li>
	<li>Os dois componentes celulares da piscina (Paneth ou Lgr5+ células) em um 20 µ l volume total e centrifugar 300 x g por 5 min à RT</li>
	<li>Co Incubar o Paneth e células de Lgr5+ por 10 min a RT</li>
	<li>Remover 10 µ l do sobrenadante e deixar um menisco do líquido para ter certeza de não aspirar o centrifugado.</li>
	<li>Adicionar 30 µ l de leite reconstituído da membrana basal das células para um volume total de 40 µ l, Ressuspender as células e a placa em uma placa bem 96 previamente aquecido. Depois de 10 min, adicionar 200 µ l de meio completo (veja a Tabela de materiais). Médio de mudança cada 48 h.</li>
	<li>Multiplicidade de organoides contagem no dia 5.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Os autores têm nenhum interesse financeiro concorrente ou outros conflitos de interesses

O ORA permite a análise funcional refinada dos dois componentes essenciais de nicho de células-tronco intestinal, ou seja, Lgr5+ e células de Paneth. Esta abordagem tem sido empregada anteriormente por nós e outros, com pequenas modificações,6,10,11. Aqui, apresentamos o procedimento ORA como um protocolo do laboratório reproduzíveis e padronizada. Além disso, relatamos sobre os efeitos da Apc downre...

O epitélio intestinal é o tecido mais rapidamente auto renovadora no corpo dos mamíferos e, como tal, tem sido objeto de uma infinidade de estudos vista a identificação e caracterização funcional das células-tronco adultas que residem no fundo da cripta de Lieberkühn, afectada pela expressão do gene Lgr5 e dependente de sinais de Wnt canônico1. Nomeadamente, Lgr5+ células-tronco são flanqueadas e suportadas por células especializadas de nicho, ou seja, células de Paneth, que também dependem de sinalização de Wnt para sua maturação2. Juntos, esses tipos de duas células subjacentes a auto-renovação do revestimento epitelial intestinal e preservar o equilíbrio homeostático diário: Lgr5+ células-tronco rapidamente dividir e dar origem a progenitora e mais especializada intestinal epitelial células; Células de Paneth fornecem factores essenciais de nicho (por exemplo, Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ tronco células2. A capacidade das criptas intestinais quando chapeado ex vivo para formar estruturas organizadas e auto renovadora chamado organoids, ou "minicoragem", tem sido explorada como uma ferramenta experimental para fornecer informações sobre processos de auto-renovação e diferenciação em condições normais e patológicas, incluindo câncer4. Organoides culturas se estabeleceram de vários tecidos, incluindo o intestino, pâncreas, fígado e rim, de rato e humanos amostras4. O método de extração e os fatores de crescimento, empregados para desenvolver essas culturas organoides são tecido-específica e projetadas para dirigir a diferenciação da linhagem multi e imitar tão perto quanto possível do original nicho de células-tronco in vivo. Organoids pode ter aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças genéticas, a avaliação da eficácia terapêutica em câncer, a análise de toxicidade da droga ou o estudo da organogênese em vitro5.
Em geral, a principal limitação das culturas organoides quando estabelecido a partir de amostras de tecido é uma falta de especificidade celular. Por exemplo, organoids intestinais estabelecidas de criptas toda intestinais não permitem a análise de componentes celulares individuais englobadas dentro da fonte de tecido (por exemplo, toda criptas contêm Lgr5+, Paneth, e células progenitoras).
Aqui, descrevemos um método novo, referido como ORA, que combina as vantagens das culturas de organoides intestinal com a análise funcional dos seus componentes mais fundamentais, ou seja, tronco (Lgr5+) e células de nicho (Paneth). Isto é conseguido através da capacidade única de Paneth e células de Lgr5+ para associar fisicamente uns com os outros quando co incubados e dar origem a organoids2,6,10. Nós aproveitou-se desse recurso e pre-tratados os tipos de duas células individualmente antes de permitir-lhes reconstituir o organoids. Ao fazer isso, cada componente da célula pode ser exposto a determinada droga, fator de crescimento, inibidor de bioquímica, modificação genética ou tratamento químico antes da reconstituição e formação de organoides. Portanto, usando o ensaio ORA permitirá a determinação de se um tratamento medicamentoso específico ou modificação genética tem um efeito específico sobre as células-tronco ou sua contraparte de nicho.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Concentração final: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Concentração final: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Concentração final: 10 mM</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Concentração final: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Noggin murino recombinante *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentração final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Concentração final: 10 &micro; M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Concentração final: 1 &micro; M</td></tr><tr><td>R-espondina murina recombinante *</td><td>R& D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentração final: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Concentração final: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* A combinação desses reagentes constitui o meio</td><td></td><td></td><td></td> de cultura completo</tr></tbody></table>

o ensaio de reconstituição de organoides (ora) para a análise funcional do tronco intestinal e nicho de células

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

O epitélio intestinal é caracterizado por uma taxa extremamente rápida de volume de negócios. Nos mamíferos, o forro epithelial todo se renova dentro de 4-5 dias. Células-tronco adultas intestinais residem no fundo das criptas de Lieberkühn, são afectadas pela expressão do gene Lgr5 e preservar a homeostase através de sua característica alta taxa proliferativa1. Ao longo do intestino delgado, Lgr5+ células-tronco são entremeadas com células secretoras especializadas, chamadas células de Paneth. Células de Paneth secretam compostos antibacterianos (i.e., lisozima e cryptdins/defensinas) e exercem um papel de controlo sobre a flora intestinal. Mais recentemente, foi descoberta uma nova função para as células de Paneth, ou seja, sua capacidade para fornecer suporte de nicho de células-tronco Lgr5+ através de vários ligantes chaves como Wnt3, EGF e Dll12.
Quando isolada ex vivo e cultivados na presença de fatores de crescimento específicos e componentes da matriz extracelular, criptas intestinais todo dão origem a long-lived e auto renovar estruturas 3D chamado organoids que muito se assemelham a cripta-vilosidades arquitetura epitelial do intestino delgado adulto3. Organoides culturas, quando estabelecida de toda criptas, permitem o estudo de auto-renovação e diferenciação de nicho de células-tronco intestinal, embora sem abordar a contribuição dos seus componentes individuais, ou seja a Lgr5+ e Células de Paneth.
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o ensaio de organoides que aproveita a capacidade de Paneth e células de Lgr5+ para associar e formar organoids quando cultivadas co. Esta abordagem, aqui referida como "ensaio de reconstituição de organoides" (ORA), permite a modificação genética e bioquímica de Paneth ou Lgr5+ células-tronco, seguidas por reconstituição em organoids. Como tal, permite a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinal.

O ensaio de reconstituição de organoides permite a análise funcional separada dos componentes essenciais da ameia e células-tronco do epitélio intestinal, aqui demonstrado pelo RNA de interferência pequeno (siRNA) do gene Apc .
Para atingir este objectivo, primeiro utilizamos o fluorescente ativado celular classificação (FACS) para separar puras camundongos C57BL6/J 8000 Lgr5+ de células e 6000 célul...

Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5+) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

O objetivo geral do ensaio de reconstituição organoide é a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinais Lgr5 positivo nas células de Paneth por meio de sua modificação genética ou bioquímica seguida de reconstituição em organoides auto-renovadores. Este método permite abordar questões-chave específicas no campo das células-tronco intestinais, como modificação genética ou bioquímica em células-tronco e de nicho. A principal vantagem dessa técnica é que, ao contrário de outros ensaios que usam criptas inteiras, ela emprega células-tronco e nicho classificadas, permitindo assim a análise específica do tipo de célula.A demonstração em vídeo desse método é crítica, especialmente quando se trata das etapas de dissociação do tecido e manuseio celular. Se não forem executadas corretamente, essas etapas levarão a uma baixa viabilidade celular, especialmente após a classificação dos fatos. Comece este procedimento com a preparação de materiais e sacrifício de um camundongo Lgr5 em um fundo C57BL / 6J, conforme descrito no protocolo de texto.Disseque o peritônio longitudinalmente com uma tesoura. Segure o estômago com a pinça e corte-o transversalme

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

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Bioengenharia

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Aprenda a reconstituir organoides intestinais a partir de células-tronco Lgr5+ e células de nicho de Paneth para análise funcional. Este método permite modificações genéticas e bioquímicas específicas por tipo celular.

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

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