Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos
3 de outubro de 2017
Um protocolo para construir um iluminador penetrante de tecido para entregar a luz sobre grandes volumes com diâmetro mínimo é apresentado.
O objetivo geral deste protocolo é criar um iluminador de tecido de grande volume que seja adequado para manipulações optogenéticas em primatas não humanos. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como as populações de neurônios nas diferentes regiões do cérebro contribuem para o comportamento e como os padrões de disparo neuronal temporalmente específicos em uma região podem afetar outra região? A principal vantagem dessa técnica é que ela usa luz e, portanto, permite a manipulação optogenética de grandes volumes cerebrais relevantes para o comportamento com danos mínimos aos tecidos.
As implicações dessa técnica se estendem à medicina translacional por causa das semelhanças entre os cérebros de primatas humanos e não humanos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é preciso alguma prática para aplicar a quantidade adequada de pressão ao puxar essas fibras. Para iniciar este procedimento, use uma tesoura afiada para cortar uma seção de fibra óptica plástica de 250 micrômetros de diâmetro que seja pelo menos 10 centímetros mais longa que o comprimento total desejado do iluminador.
Em seguida, remova 15 a 20 centímetros de revestimento de polietileno de uma extremidade da fibra óptica de plástico usando um decapador de fios de calibre 22. Em seguida, prenda os três a cinco centímetros mais distais da extremidade descascada da fibra em um grampo de torno de mesa. Segure a extremidade revestida da fibra esticada em uma mão, com um puxão constante e constante.
A fibra deve estar paralela ao chão, afastada do torno. Mantenha essa tensão constante na fibra durante o aquecimento e resfriamento, para que a fibra permaneça reta e esticada à medida que se dilui. Usando a configuração mais baixa de uma pistola de calor de temperatura dupla, aqueça a seção descascada da fibra até que ela seja diluída para um diâmetro de 60 a 100 micrômetros, ou aproximadamente o diâmetro de um fio de cabelo humano.
Mantenha a tensão constante na fibra, permitindo que ela esfrie. A falha em manter a tensão ou o superaquecimento da fibra pode fazer com que a fibra se enrole e/ou quebre. Para ajudar a manter a tensão constante na fibra enquanto você a aquece, use sua mão não dominante para não ter que soltá-la quando estiver usando a pistola de ar quente.
Além disso, você pode enrolar suavemente a fibra ao redor da palma da mão para obter uma aderência ainda melhor. Assim que a fibra esfriar totalmente e o diâmetro desejado for alcançado, aperte a fibra a três centímetros do ponto mais estreito de ambos os lados. Com um puxão rápido e acentuado ao longo do eixo da fibra, separe os lados para criar uma ponta cônica.
Em seguida, examine a ponta cônica em baixa potência sob um microscópio de dissecação. Se a ponta estiver bifurcada ou enrolada, descarte a fibra. Mesmo com muita prática, cerca de um terço das fibras terá pontas bifurcadas ou enroladas.
Nós apenas descartamos essas fibras em vez de tentar repará-las, já que é muito rápido e barato puxar outra. Prepare-se para gravar a ponta cônica colocando um pedaço de fita adesiva perto da extremidade da ponta, deixando o comprimento desejado da ponta exposto. Aqui os últimos cinco milímetros estão expostos.
A fita protege a fibra de corrosão acima do comprimento desejado de emissão de luz. Depois disso, dobre um pequeno quadrado de cinco micrômetros de carboneto de silício entre o polegar e o indicador. Coloque a ponta da fibra entre os dois lados da folha de lapidação e grave suavemente a fibra usando pequenos movimentos circulares.
Gire frequentemente a fibra para que todos os lados fiquem gravados uniformemente. Em seguida, remova cerca de cinco milímetros da camisa de polietileno da extremidade oposta do iluminador usando um descascador de fios de calibre 22. Em seguida, corte a extremidade oposta com uma faca quente para alisar a superfície.
Fixe um conector na extremidade do iluminador oposta à ponta gravada. Isso permite que o iluminador se conecte a um cabo óptico ou laser. Depois, polir a extremidade oposta com folhas de lapidação sucessivamente mais finas.
Em seguida, insira a extremidade oposta plana em uma ponteira de aço inoxidável de 260 micrômetros de diâmetro interno até que esteja nivelada com a extremidade da ponteira. Confirme visualmente se a extremidade oposta é polida de maneira suave e uniforme com um microscópio de fibra. Cole a ponteira verticalmente na borda da mesa com a abertura menor da ponteira apontando para baixo.
Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com epóxi plástico e prenda uma agulha romba de calibre 18 na seringa. Em seguida, use a agulha para aplicar epóxi na ponteira. Encha a ponteira completamente com epóxi.
Insira a fibra na ponteira de forma que fique nivelada com o fundo da ponteira. Se necessário, limpe o excesso de epóxi da superfície polida da fibra com um pano úmido sem fiapos antes de secar. Nesta etapa, prepare um microdrive de torre antes de cada sessão de teste.
Em seguida, fixe um tubo guia de calibre 25 com uma ponta chanfrada no grampo inferior do inversor. Prenda o iluminador de grande volume no grampo superior na mesma unidade. Esta braçadeira é fixada ao motor de acionamento.
Em seguida, passe o iluminador de grande volume totalmente pelo tubo guia e confirme se a ponta do iluminador se estende além da ponta do tubo guia. Como alternativa, a fita de laboratório pode ser aplicada à fibra para que a fita, em vez da própria fibra, seja presa, para proteger a fibra. Em seguida, mergulhe o tubo-guia e o iluminador em uma solução anti-séptica para esterilização.
Coloque uma grade esterilizada personalizada com espaçamento de furos de um milímetro dentro da câmara limpa e prenda-a em uma orientação pré-especificada com o parafuso na lateral da câmara. Retraia o iluminador esterilizado do tubo guia puxando o iluminador para cima usando uma pinça romba estéril. A ponta do iluminador deve estar de cinco a 10 milímetros acima da ponta do tubo guia.
Fixe o microdrive no suporte e coloque o tubo guia no orifício da grade alvo. Em seguida, abaixe o microdrive stage até que o tubo guia esteja apenas no nível da dura-máter. Ao mesmo tempo, abaixe o iluminador manualmente com uma pinça estéril.
Se houver alguma resistência, retraia o iluminador de cinco a 10 milímetros, aguarde 10 minutos e tente novamente. Se ainda houver resistência na segunda tentativa, retraia a ponta do iluminador no tubo-guia, abaixe o tubo-guia 0,25 milímetros e tente novamente. Conecte a ponteira na outra extremidade do iluminador à configuração óptica maior ou ao laser.
Esta figura mostra que as taxas de erro aumentaram significativamente com a iluminação. E os gráficos raster aqui mostram a inibição de neurônios abrangendo a espessura de 2,5 milímetros do córtex. E o potencial de campo local mostrando o artefato de luz medindo 4,5 milímetros.
Uma vez dominado, um iluminador de grande volume pode ser construído usando esta técnica em 10 a 15 minutos, mais o tempo de secagem do epóxi. A calibração adiciona mais meia hora ou mais, portanto, para maximizar a eficiência, geralmente fazemos vários iluminadores ao mesmo tempo. Ao participar deste procedimento, é importante lembrar que muitos dos iluminadores não atendem aos padrões de controle de qualidade.
Tudo bem. Se eles falharem na inspeção da ponta, nós os descartamos. Mas se eles falharem na calibração, geralmente os polimos novamente e repetimos a calibração.
Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou a pavimentar o caminho para pesquisadores no campo da neurociência usarem a optogenética para suprimir o disparo neuronal e modular o comportamento em primatas não humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um iluminador de tecido de grande volume.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a construção de um iluminador que penetra nos tecidos, projetado para manipulações optogenéticas em primatas não humanos. A técnica tem como objetivo iluminar grandes volumes cerebrais minimizando danos teciduais, facilitando pesquisas sobre comportamento e interações neuronais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Optogenética
- Neurobiologia
Antecedentes
- Compreender as populações neuronais é fundamental para a neurociência.
- A optogenética permite o controle preciso da atividade neuronal.
- Os modelos em primatas não humanos são relevantes para a medicina translacional.
- Minimizar danos ao tecido é essencial para práticas éticas de pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Crie um iluminador de grande volume para estudos de optogenética.
- Investigue como diferentes regiões cerebrais contribuem para o comportamento.
- Explore o impacto dos padrões de disparo neuronal entre regiões.
Métodos Utilizados
- Recortar um trecho de fibra óptica plástica no comprimento desejado.
- Aplicar pressão adequada ao puxar as fibras.
- Utilizar tesouras afiadas para cortes precisos.
- Montar o iluminador para uma entrega ideal de luz.
Resultados Principais
- O iluminador entrega eficazmente luz a grandes volumes cerebrais.
- Danos mínimos aos tecidos são alcançados durante o procedimento.
- Facilita a manipulação optogenética em estudos comportamentais.
- Fornece insights sobre interações neuronais e comportamentos.
Conclusões
- O protocolo aprimora as capacidades de pesquisa optogenética.
- Tem implicações significativas para a compreensão da função cerebral.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para pesquisas translacionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a manipulação optogenética de grandes volumes cerebrais relevantes para o comportamento em primatas não humanos com danos teciduais mínimos, apoiando pesquisas neurocientíficas translacionais. Ao entregar luz em volumes teciduais de aproximadamente ~10 mm³, ele conecta a validação pré-clínica de alvos e a fenotipagem comportamental em um modelo filogeneticamente relevante. A abordagem reduz o risco biológico na desmistificação de alvos ao permitir a investigação em nível de circuito com maior especificidade espacial em comparação com fibras ópticas convencionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar a contribuição de populações neuronais ao comportamento em circuitos cerebrais distribuídos.
- Valor Operacional: Apoia a validação causal de alvos por meio de modulação optogenética temporalmente precisa em contextos etologicamente relevantes.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no mecanismo alvo ao associar padrões de atividade neuronal a respostas comportamentais em um modelo preditivo translacional.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece um sistema padronizado de entrega de luz para dosagem optogenética consistente entre sessões experimentais.
- Valor Operacional: Facilita ensaios comportamentais reprodutíveis por meio de iluminação estável em grande volume, sem as limitações do acoplamento com eletrodos.
- Prontidão para Ensaios: Permite controle optogenético de alta fidelidade em animais livres para se mover, apoiando triagens comportamentais longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Aproveita as semelhanças anatômicas e fisiológicas entre os cérebros de primatas não humanos e humanos para melhorar a validade preditiva do engajamento do alvo.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: Permite a avaliação dos efeitos da modulação do alvo sobre comportamentos complexos relevantes para modelos de doenças neuropsiquiátricas.
- Avanço com Base no Nível de Risco: Apoia decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento ao demonstrar a eficácia da modulação do alvo em uma espécie girocéfala com comportamento complexo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta ao permitir a validação de alvos em nível de circuito após a identificação inicial do alvo e antes da otimização do composto líder, especialmente para alvos do SNC que exigem confirmação do fenótipo comportamental.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a investigação baseada em hipóteses de circuitos neurais implicados em comportamentos relacionados a doenças.
- Triagem: Permite perturbação optogenética padronizada em ensaios comportamentais para validação de efeitos de compostos.
- Análises: Gera dados comportamentais e eletrofisiológicos quantificáveis (por exemplo, taxas de erro, supressão da atividade neuronal, artefatos de LFP) para avaliar o engajamento do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a modulação de alvos moleculares a resultados comportamentais em nível de sistemas, em um modelo com alta relevância translacional para a cognição humana.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma escalável para uso repetido em múltiplos alvos e paradigmas comportamentais após fabricação inicial e controle de qualidade.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir o controle específico por tipo celular em grandes populações neuronais durante o comportamento.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de fabricação, calibração de controle de qualidade e esterilização.
- Valor Estratégico: Reduz os riscos no avanço de alvos ao fornecer evidência causal de relações entre alvos e comportamento em um modelo pré-clínico.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização de alvos ajustada ao risco ao validar a relevância funcional de alvos em domínios comportamentais complexos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em técnicas microcirúrgicas, manuseio de fibras ópticas e procedimentos estéreis para implante neural.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo microdrives, tubos guia, câmaras de esterilização e sistemas de acoplamento a laser.
- Necessita padronização entre equipes distintas — neurociência, engenharia e cuidados com animais — para produção e uso consistentes dos iluminadores.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes profundidades-alvo (estruturas superficiais versus profundas) e volumes de iluminação com base nos objetivos experimentais.
- Inclui limitações práticas, como taxas de sucesso variáveis no estiramento de fibras e formação de pontas, exigindo fabricação em lotes e triagem de controle de qualidade.
