Name: Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a construir um iluminador de grande volume para optogenética em primatas não-humanos. Esta técnica permite manipular volumes cerebrais relevantes ao comportamento com mínimo dano tecidual.

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LCA reconhece o financiamento de uma bolsa NDSEG, a NSF GRFP e os amigos do Instituto McGovern. EP reconhece financiamento o Harry e Eunice Nohara UROP fundo, o MIT, turma de 1995 UROP fundo e fundo UROP MIT. ESB reconhece financiamento do NIH 2R44NS070453-03A1, o prêmio Harvey de deixar e o prêmio de fundação-Robertson NY células-tronco. RD reconhece financiamento de NIH EY017292. Michael Williams ajudou a equipe a organizar e recolher suprimentos antes da filmagem.

Nota: todos os procedimentos de animais estavam em conformidade com as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Instituto Massachusetts de tecnologia Comissão no cuidado Animal.
 1. fabricação de iluminador <ol><li>usar um par de tesouras afiadas para cortar uma parte de 250 µm de diâmetro plástico fibra óptica que é maior que o comprimento desejado iluminador total pelo menos 10 cm.</li>
	<li>Remover de revestimento de polietileno de 15-20 cm de uma extremidade da fibra óptica plástica usando um descascador de fios de 22 calibre.</li>
	<li>Segura o distal mais 3-5 cm da extremidade despojada da fibra em uma pinça de torno tabela.</li>
	<li>Estique encamisada final da fibra em uma mão com uma tração constante constante. A fibra deve estar paralela ao chão, perpendicular aos narcóticos. Manter esta tensão constante sobre a fibra ao longo de aquecimento e arrefecimento (etapas 1.5 e 1.6 abaixo) para que a fibra permanece reta e tenso como ele dilui.</li>
	<li>Usando a configuração mais baixa de um soprador térmico de temperatura duplo (1.000/570 ° F), aqueça a seção despojada da fibra até que é diluída com um diâmetro de 60-100 μm, ou sobre o diâmetro de um cabelo humano.</li>
	<li>Manter a tensão constante sobre a fibra, permitindo que a fibra esfriar. Para manter a tensão pode causar a fibra encaracolar.</li>
	<li>Confirmar o diâmetro da ponta diluído sob um microscópio de dissecação. Como alternativa, pode utilizar pinças em vez disso.
	<ol><li>Se a fibra não é fina o suficiente, repita as etapas de 1.4 com 1.6 conforme necessário para atingir o diâmetro desejado dica.</li>
		<li>Opcional se re-puxar, colocar a uma pequena marca na parte mais estreita da fibra se ele será aquecido novamente para que o centro da arma calor destina-se a parte mais estreita da fibra.</li>
		<li>Se a fibra é muito fina, começar de novo.</li>
	</ol></li> <li>Uma vez que a fibra completo esfriou e o diâmetro desejado foi alcançado, belisque a fibra 3 cm do ponto mais estreito em ambos os lados. Com uma rápida, afiada puxe ao longo do eixo da fibra, separar os lados para criar uma ponta afunilada.</li>
	<li>Examinar a ponta cónica sob uma baixa potência (por exemplo, 4 X) em microscópio de dissecação. Se a ponta é bifurcada ou enrolada ( Figura 1f), descartar a fibra.</li>
	<li>Preparar-se para o etch a ponta cónica, colocando um pedaço de fita de laboratório perto do fim da ponta, deixando o último 5 mm exposto. A fita protege a fibra da gravura acima o comprimento desejado da emissão de luz. Este comprimento da ponta foi selecionado com base na espessura do córtex do primata na região de destino. Um comprimento mais longo ou mais curto pode ser exposto dependendo o comprimento desejado da iluminação. Se for desejado um etch diferentes comprimento de ponta, a borda da fita laboratório pode ser movida mais perto para ou longe a ponta cónica.</li>
	<li>Dobre um quadrado pequeno (~ 1 polegadas x 2 polegadas) de 5 μm folha de polimento de carboneto de silício entre o polegar e o indicador. Colocar a ponta da fibra entre os dois lados da folha de polimento e etch suavemente a fibra com pequenos movimentos circulares, como se um BB de rolamento entre o polegar e o indicador. Frequentemente rode a fibra para todos os lados estão gravados uniformemente. A ponta de fibra aparecerá &#8220; áspera &#8221; a olho nu em áreas que têm sido gravadas, enquanto áreas un-gravadas normalmente aparecem suaves.</li>
	<li>Repita o passo 1.11 com um óxido de alumínio de 3 μm lapidação folha.</li>
	<li>Apor um conector na extremidade do iluminador oposta à ponta entalhada. Isso permite que o iluminador para se conectar a um cabo ótico ou a laser. 
	Nota: Esse método difere do método preferencial para fixação de vidro / fibra óptica de sílica em virolas. Porque a virola de metal é mais difícil do que a fibra óptica plástica, polimento da fibra e a virola como uma unidade após colagem pode danificar a fibra óptica plástica como minúsculos fragmentos de metal produzido durante o processo de polimento pode incorporar-se em fibra apartamento fendida.
	<ol><li>Remover cerca de 5 mm do revestimento de polietileno da extremidade oposta do iluminador usando um descascador de fios de 22 calibre.</li>
		<li>Corte a extremidade oposta plana, com uma faca quente para suavizar a superfície.</li>
		<li>Polonês a extremidade oposta apartamento com lapidação sucessivamente mais finas folhas: 5 µm, 3 μm, 1 μm e 0,3 µm.</li>
		<li>Inserir o apartamento em frente ao final em uma virola de aço inoxidável de diâmetro interno de 260 µm até que ela esteja alinhada com o fim do ferrolho.</li>
		<li>Confirmar visualmente que a extremidade oposta é suave e uniformemente polida com um microscópio de fibra.</li>
		<li>Remover a fibra do ferrolho e a virola verticalmente sobre a borda de uma mesa de fita com a fibra apontando para baixo.</li>
		<li>Encher uma seringa de 1 mL com epóxi de plástico e coloque uma agulha de 18 calibre contundente a seringa.</li>
		<li>Use a agulha para aplicar epóxi para baixo para a virola. Encha o ferrolho completamente com epóxi.</li>
		<li>Inserir a fibra a virola.</li>
		<li>Limpe qualquer excesso da cola epoxy da superfície polida da fibra com uma limpeza toalhetes molhada antes da secagem, se necessário. Caso contrário, o epóxi em excesso pode ser removido após 12-24 h.</li>
		<li>Armazenar a fibra suavemente até a calibração e coloque uma capa de pó sobre o ferrolho.</li>
	</ol></li></ol> 2. Iluminador de calibração e controle de qualidade Nota: esses métodos para calibração avaliar para luz de saída não-linearidade a diferentes distâncias da ponta da fibra. Distribuição desigual de luz normalmente resulta de uma &#8220; acidentada &#8221; ou &#8220; ondulado &#8221; do atarraxamento.
Diafragma <ol><li>criar uma blindagem leve para a parte superior da integração esfera usando luz absorvente da folha ( Figura 2). 
	Nota: Use luvas sempre que a manipulação de luz absorvendo a folha para evitar pele óleos criando manchas refletindo luz.
	<ol><li>Dobra por 2 &#8221; por 4 &#8221; pedaço de luz absorvendo da folha sobre si mesmo para formar um 2 &#8221; x 2 &#8221; praça. um método alternativo é cortar um 2 &#8221; x 2 &#8221; praça com uma absorção de lado e um luz refletindo o lado (ou seja, um lado da folha de alumínio padrão); no entanto, o método dobrável é mais seguro porque fornece uma incômoda ponta para manipulação do diafragma na próxima etapa.</li> <li>Dobre a fita de laboratório ou fita isolante ao longo das bordas do quadrado para vincular as arestas não-dobrado. Isto tanto une os lados e protege contra cortes de arestas.</li>
		<li>Perfurar um buraco no centro da Praça, usando uma agulha de 26 calibre.</li>
		<li>Remover o parafuso grande na tampa da esfera integradora e cobrir a abertura com o diafragma. Coloque o orifício sobre o centro. Se o diafragma foi criado com uma luz absorvente e uma luz refletindo o lado, coloque o lado de absorção acima e a luz refletindo o lado para baixo, voltados para dentro da esfera de integração. 
		Nota: Para impedir a poeira e detritos entre a esfera de Ulbricht e para manter o furo centralizado, seguro o diafragma para fora da esfera integradora com fita de lab.</li>
	</ol></li> <li>Medida luz de saída ao longo da ponta em 500 µm incrementos usando um micromanipulador ou braço estereotáxica e uma esfera de Ulbricht. 
	Nota: Óculos de segurança, de comprimento de onda apropriado devem ser usados sempre que o laser está na.
	<ol><li>Conectar a extremidade oposta da fibra a um laser ou a luz da fonte, mas não acionam luz saída ainda.</li>
		<li>Segura o iluminador para um titular estereotáxica (preferably com fita de laboratório) com a ponta de 7-10 mm abaixo da parte inferior do suporte.</li>
		<li>Parafuso o titular estereotáxica para o braço estereotáxica</li>
		<li>Alinhe a ponta do iluminador com o buraco no centro do diafragma. Zero o micromanipulador quando a ponta é a exata mesmo nível como o diafragma.</li>
		<li>Ligar desligar as luzes da sala e zero a esfera de Ulbricht.</li>
		<li>Disparar o laser (ou outra fonte de luz) e medir a potência de luz total de saída usando a esfera de Ulbricht. 
		Nota: Usar a saída de luz mais baixa possível para calibração teste.</li>
		<li>Baixar a fibra 500 µm até integrando esfera e repita etapa 2.2.6.</li>
		<li>Continuar reduzindo a fibra na esfera integradora e medir a saída de luz total em incrementos de 500 µm até a folga de níveis de potência luminosa total 
		Atenção: Potência total de luz deve estabilizar uma vez que a ponta inteira está na esfera. Não continue a diminuir a fibra mais de 1-2 mm além do gravado ponta de comprimento. Se a ponta em contato com a parte inferior da esfera de integração, pode derreter e/ou estragar a esfera de Ulbricht.</li>
	</ol></li> <li>Confirmar uma fibra uniformemente gravada por plotagem total poder luz de saída como uma função da distância da fibra foi reduzida para a esfera de integração para confirmar a linearidade.</li></ol>
 3. iluminação na Vivo
 Nota: aqui, esses métodos são mostrados usando um modelo de plástico ao invés de um primata não humano.
<ol><li>Implante uma câmara de gravação de 25 mm de diâmetro foi implantada sobre a área do cérebro de interesse antes da experimentação.</li>
	<li>Executar anatômica ressonância magnética (MRI) antes da experimentação. Coloque uma grade de gravação personalizada na câmara e preenchê-lo com um lubrificante cirúrgico estéril para permitir a visualização de grade e determinação do nível das estruturas cerebrais dura-máter e alvo.</li>
	<li>Preparar uma torre microunidade antes de cada sessão de teste.
	<ol><li>Apor um 25 calibre tubo de guia com ponta chanfrada para o meio e inferior grampos na unidade. Dois grampos são usados para garantir que o tubo de guia permanece reta. Ambos estes grampos podem ser movidos manualmente, se desejado. 
		Nota: O tubo de guia pode ser epoxied ou soldado para as pinças.</li>
		<li>Segura o iluminador de grande volume na braçadeira superior na mesma unidade. Essa pinça é anexada para o motor.</li>
		<li>o iluminador de grande volume através do tubo de guia da linha totalmente e confirmar que a ponta do iluminador ultrapassa a ponta do tubo guia. 
		Nota: O comprimento do iluminador que estende passado a ponta do tubo guia é igual a distância entre a dura-máter para a margem inferior da região alvo do cérebro, como determinado através de MRI.</li>
		<li>Mergulhe o tubo guia e iluminador em solução anti-séptica (por exemplo, chlorohexidine) para esterilizar.</li>
	</ol></li> <li>Colocar uma grade Personalizada esterilizada dentro da câmara limpa e fixá-lo em uma orientação predeterminada com um parafuso na parte lateral da câmara. A grade mostrada aqui tem espaçamento de 1 mm; no entanto, o espaçamento pode ser personalizado conforme necessário. 
	Nota: Isto deve ser idêntico para a grade e a orientação usada no MRI anatómico.</li>
	<li>Segura o titular microunidade estereotáxico na câmara de gravação em uma orientação pré-determinada.</li>
	<li>Retrair o iluminador esterilizado do tubo guia puxando o iluminador usando pinça estéril, sem corte. A ponta do iluminador deve ser de 5-10 mm acima da ponta do tubo guia. 
	Nota: O iluminador se curvará para fora entre o tubo de guia e a pinça. Isto não danificará o iluminador flexível.</li>
	<li>Apor a microunidade para o titular e colocar o tubo de guia no orifício de grade alvo.</li>
	<li>Baixar o estágio micro-drive até o tubo de guia é apenas através do nível da dura-máter. 
	Nota: Se desejado, uma segunda unidade de micro com um eletrodo pode ser colocada no palco e abaixada no buraco grade diferente. O campo local potencial sobre este eletrodo mostrará um artefato luz dependente da distância, que pode ser usado para confirmar a colocação do iluminador.</li>
	<li>Tentativa menor o iluminador manualmente com Pinças esterilizadas.
	<ol><li>Se houver alguma resistência, retrair o iluminador 5 - 10 milímetros, esperar 10 minutos para permitir que o tecido se estabelecer e tente novamente.</li>
		<li>Se ainda houver resistência na segunda tentativa, recolher a dica do iluminador dentro do tubo guia, baixo o guia tubo de 0,25 mm e tente novamente.</li>
		<li>Repetir até os slides iluminador através do tubo de guia sem qualquer resistência.</li>
		<li>Baixar o iluminador até é tenso. 
		Atenção: Não empurre o iluminador com força contra uma resistência. Nestes casos o tubo guia normalmente não penetrou a dura-máter totalmente. A fibra a empurrar com força fará com que a dobrar-se sobre si mesmo, impedindo que a fibra de entrar no cérebro e possivelmente destruindo a ponta ( Figura 1G).</li>
	</ol></li> <li>Se conectem a virola no extremo oposto o iluminador a maior óptica configurar ou laser.</li>
	<li>, Certifique-se de que nenhuma luz é visível para os primatas não humanos.
	<ol><li>Use blindagem opacas ou folha para abranger totalmente as gravação torres de absorção de luz.</li>
		<li>Coloque todas as conexões ópticas em envelopes blindados feitos de luz, absorvendo folha.</li>
		<li>Proteger todos os cabos de remendo com qualquer luz absorvendo a folha ou fita isolante preta.</li>
		<li>Como uma precaução extra, coloque um banco do diodo emissor de luz (LED) de isca da mesma cor luz usado no experimento para trás os primatas não humanos e os LEDs pisquem continuamente a 2,5 Hz. Isto impede que os olhos totalmente ajustando à escuridão. Se houvesse Vazamento de luz inadvertido, esta luz piscando ajudaria a evitar o vazamento de servir como um gatilho comportamental.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
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<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
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<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Enquanto optogenetic ferramentas são amplamente utilizadas para estudar a doença e fisiologia em roedores, o desafio técnico de volumes de cérebro grande iluminante limitou o uso de optogenetics em primatas não-humanos. Pioneira estudos em macacos usadas densidades de grande poder de luz (~ 100 mW/mm2 a 20 W/mm2) para iluminar a volumes pequenos, talvez &#60; 1 mm3e relatados efeitos comportamentais modestos com opsins excitatórios no córtex4, <sup clas...

Ferramentas de Optogenetic, que permitem controle neuronal milissegundo de precisão, luz-driven são amplamente utilizadas para estudar a fisiologia funcional e comportamento em roedores e invertebrados. No entanto, os desafios técnicos limitaram-se a utilização de optogenetics no cérebro de primatas não humanos, que tem um volume de ~ 100 x maior do que o cérebro de roedor 1.
Para facilitar estudos de optogenetics em primatas não-humanos, um iluminador foi projetado para atender a dois objetivos concorrentes: iluminação de grande volume e dano mínimo de penetração. Tentativas anteriores de endereço dentre estas preocupações vir no cara do outro. Feixes de fibras iluminar volumes maiores, mas com diâmetro maior e, assim, danos2,3. Fibras de vidro cônico reduzem danos de penetração, mas por pouco o foco de luz emitindo áreas de superfície &#60; 100 µm2 4,5. Iluminação externa do cérebro através de uma janela na dura-máter contorna o desafio dos danos de penetração e pode permitir a iluminação de grande volume, mas ele só pode ser usado para algumas áreas de cérebro superficial6.
Para criar um iluminador de grande volume, pequeno diâmetro (Figura 1a), a ponta de um plástico óptico de fibra é calor afilado e o núcleo e o revestimento são gravadas (Figura 1bc). Ao contrário de outras fibras afiladas que focam a luz para um ponto estreito, a gravura permite que a luz uniformemente escapar para fora dos lados da ponta, assim, distribuir luz amplamente sobre uma grande área (Figura 1 de). Porque o dano de penetração é proporcional ao diâmetro de penetração, este iluminador não tem nenhum dano de penetração mais do que uma fibra convencional, ainda tem &#62; 100 x a luz emitindo luz superfície de área e oferece mais amplamente com 1/100 o poder da luz densidade em um cérebro fantasma (1,75% do agarose) (Figura 1e). Um modelo de Monte Carlo (Figura 1f) ilustra a diferença na propagação de luz entre uma fibra convencional e o iluminador de grande volume, quando eles têm densidades de energia de luz igual como sua superfícies de emissores de luz. Cada iluminador é calibrado individualmente usando uma esfera de Ulbricht (Figura 2a, b) para assegurar a distribuição de luz até ao longo da ponta (Figura 2C).
Este iluminador de grande volume foi validado com manipulação de optogenetic de comportamento e de disparo neuronal em primatas não-humanos. O comprimento da ponta de fibra pode ser personalizado para qualquer área do cérebro e mapa de campo receptivo individual de cada animal. O iluminador pode ser emparelhado com um eletrodo penetrante para gravações neuronais que abrangem o período de iluminação. Além disso, porque a fibra pode carregar qualquer cor de luz visível, pode ser emparelhado com qualquer das moléculas optogenetic disponível disponíveis.

<table><tbody><tr><td>Fibra óptica plástica</td><td>Fibra óptica industrial</td><td>SK-10</td><td>250 mícrons de diâmetro, linha Super Eska</td></tr><tr><td>Decapador de fios</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 gauge</td></tr><tr><td>Vise Clamp</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Braçadeira de torno de montagem de mesa genérica</td></tr><tr><td>Pistola de calor de temperatura dupla</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1.000 &deg; F</td></tr><tr><td>Marcador de laboratório</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Microscópio estéreo com luz incandescente dupla, ampliação de 2X/4X, disponível na VWR</td></tr><tr><td>Fita de laboratório</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>Pacote de 4 de cor violeta; no entanto, a cor da fita não importa</td></tr><tr><td>Folha de lapidação de carboneto de silício</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>grão de 5 mícrons, pacote com 10</td></tr><tr><td>Folha de lapidação de óxido de alumínio</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>Grão de 3 mícrons, pacote de 10</td></tr><tr><td>Folha de lapidação de óxido de alumínio</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>Grão de 1 mícron, pacote de 10</td></tr><tr><td>Folha de lapidação de alumina calcinada</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>Grão de 0,3 mícron, pacote de 10</td></tr><tr><td>Faca quente</td><td>Fibra óptica industrial</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, escopo</td></tr> <tr><td></td><td>de inspeção de fibra pesadaThorLabs</td><td>FS201</td><td>opcional</td></tr><tr><td>Virola de aço inoxidável</td><td>Fibra óptica de precisão</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 mícrons de diâmetro interno</td></tr> 1 <tr><td>mL seringa</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>A ponta Luer-lok é preferível para reduzir o risco de vazamento, mas não é estritamente necessária</td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>industrial epóxi plástica</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>agulha romba de calibre 18</td><td>BD</td><td>305180</td><td>Comprimento de 1,5 polegada</td></tr><tr><td>Limpeza sem fiapos (KimWipe)</td> <td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>disponível de muitos fornecedores</td></tr><tr><td>Folha absorvente de luz</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Fita isolante</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Opcional, pode substituir outras marcas / modelos</td></tr><tr><td>Agulha afiada de 26 gauge&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>Micromanipulador de 0,5 polegada de comprimento</td></tr><tr><td></td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>pode substituir outras marcas/modelos</td></tr><tr><td>Braço Steretactic</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>pode substituir outras marcas/modelos</td></tr><tr><td>Óculos de segurança a laser</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>devem ser selecionados com base na cor do laser usado, exemplo dado aqui</td></tr><tr><td>Laser ou outra fonte de luz</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>exemplo de laser azul</td></tr><tr><td>Esfera de integração</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Medidor de potência acoplado, também disponível na ThorLabs, item #PM100D</td></tr><tr><td>Câmara de gravação Ultem</td><td>Empresa de instrumentos Crist</td><td>6-ICO-J0</td><td>Personalizado com entalhe de alinhamento</td></tr><tr><td>Microdrive em torre com braçadeiras</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo guia</td><td>Personalizado</td><td>N/A</td><td>Feito de agulha espinhal de calibre 25 (BD) ou tubo rombudo</td></tr><tr><td>Sistema de driver NAN</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Design de grade personalizado</td><td></td> planos <td>personalizados</td><td>disponíveis mediante solicitação</td></tr><tr><td>Pinça sem corte</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>pinça sem corte de aço inoxidável genérico</td></tr><tr><td>Pinças digitais</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Disponível em amazon.com. Pode selecionar um paquímetro de resolução mais fina para medições mais precisas.</td></tr><tr><td>Cabo de conexão</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-personalizado</td><td>Este é um exemplo de muitos cabos de conexão possíveis. Contanto que o diâmetro da fibra seja menor ou igual ao diâmetro da fibra do iluminador de grande volume e desde que os conectores façam interface, qualquer patch cable (vidro ou plástico, comprado pelo fornecedor ou fabricado no laboratório) é adequado para esta aplicação.</td></tr><tr><td>Tampas de poeira de plástico transparente</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Pacote de 25</td></tr><tr><td>mangas de acoplamento divididas em cerâmica</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

grande volume, iluminação comportamentalmente relevantes para optogenetics em primatas não-humanos

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Este protocolo descreve um iluminador de grande volume, que foi desenvolvido para manipulações de optogenetic do cérebro de primatas não humanos. O iluminador é uma fibra óptica de plástico modificada com ponta gravada, tal que a área de superfície de emissores de luz é &#62; 100 x de uma fibra convencional. Além de descrever a construção do iluminador de grande volume, este protocolo detalha a calibração de controle de qualidade usada para assegurar a distribuição de luz mesmo. Além disso, este protocolo descreve técnicas para inserir e retirar o iluminador de grande volume. Estruturas superficiais e profundas podem ser iluminadas. Este iluminador de grande volume não precisa ser fisicamente acoplado a um eletrodo, e porque o iluminador é feito de plástico, vidro, não, ele simplesmente se curvará em circunstâncias quando destruía tradicionais fibras ópticas. Porque este iluminador oferece luz sobre volumes de tecido comportamentalmente relevantes (≈ 10 mm3) sem dano de penetração maior do que uma fibra óptica convencional, ele facilita estudos comportamentais usando optogenetics em primatas não-humanos.

A iluminação dos volumes de cérebro grande em primatas não-humanos permite manipulação optogenetic comportamentalmente relevantes. Et al . Acker (2016) usado este iluminador de grande volume com o Halorhodopsin avermelhado, Jaws 7 para estudar a contribuição temporal do campo de olho frontal (FEF) para memória guiadas sacadas em dois macacos rhesus. Especificamente, FEF neurônios foram injetados com um vetor viral contendo garras e depois iluminados com luz vermelha-usando o iluminador de...

Um protocolo para construir um iluminador penetrante de tecido para entregar a luz sobre grandes volumes com diâmetro mínimo é apresentado.

Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

O objetivo geral deste protocolo é criar um iluminador de tecido de grande volume que seja adequado para manipulações optogenéticas em primatas não humanos. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como as populações de neurônios nas diferentes regiões do cérebro contribuem para o comportamento e como os padrões de disparo neuronal temporalmente específicos em uma região podem afetar outra região? A principal vantagem dessa técnica é que ela usa luz e, portanto, permite a manipulação optogenética de grandes volumes cerebrais relevantes para o comportamento com danos mínimos aos tecidos.As implicações dessa técnica se estendem à medicina translacional por causa das semelhanças entre os cérebros de primatas humanos e não humanos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é preciso alguma prática para aplicar a quantidade adequada de pressão ao puxar essas fibras. Para iniciar este procedimento, use uma tesoura afiada para cortar uma seção de fibra óptica plástica de 250 micrômetros de diâmetro que seja pelo menos 10 centímetros mais longa que o comprimento total desejado do iluminador.Em seguida, remova 15 a 20 centímetros de revestimento de polietileno de uma extremidade da fibra óptica de plástico usando um decapador de fios de calibre 22. Em seguida, prenda os três a cinco centímetros mais distais da extremidade descascada da fibra em um grampo de torno de mesa. Segure a extremidade revestida da fibra esticada em uma mão, com um puxão constante e constante.A fibra deve estar paralela ao chão, afastada do torno. Mantenha essa tensão constante na fibra durante o aquecimento e resfriamento, para que a fibra permaneça reta e esticada à medida que se dilui. Usando a configuração mais baixa de uma pistola de calor de temperatura dupla, aqueça a seção descascada da fibra até que ela seja diluída para um diâmetro de 60 a 100 micrômetros, ou aproximadamente o diâmetro de um fio de cabelo humano.Mantenha a tensão constante na fibra, permitindo que ela esfrie. A falha em manter a tensão ou o superaquecimento da fibra pode fazer com que a fibra se enrole e/ou quebre. Para ajudar a manter a tensão constante na fibra enquanto você a aquece, use sua mão não dominante para não ter que soltá-la quando estiver usando a pistola de ar quente.Além disso, você pode enrolar suavemente a fibra ao redor da palma da mão para obter uma aderência ainda melhor. Assim que a fibra esfriar totalmente e o diâmetro desejado for alcançado, aperte a fibra a três centímetros do ponto mais estreito de ambos os lados. Com um puxão rápido e acentuado ao longo do eixo da fibra, separe os lados para criar uma ponta cônica.Em seguida, examine a ponta cônica em baixa potência sob um microscópio de dissecação. Se a ponta estiver bifurcada ou enrolada, descarte a fibra. Mesmo com muita prática, cerca de um terço das fibras terá pontas bifurcadas ou enroladas.Nós apenas descartamos essas fibras em vez de tentar repará-las, já que é muito rápido e barato puxar outra. Prepare-se para gravar a ponta cônica colocando um pedaço de fita adesiva perto da extremidade da ponta, deixando o comprimento desejado da ponta exposto. Aqui os últimos cinco milímetros estão expostos.A fita protege a fibra de corrosão acima do comprimento desejado de emissão de luz. Depois disso, dobre um pequeno quadrado de cinco micrômetros de carboneto de silício entre o polegar e o indicador. Coloque a ponta da fibra entre os dois lados da folha de lapidação e grave suavemente a fibra usando pequenos movimentos circulares.Gire frequentemente a fibra para que todos os lados fiquem gravados uniformemente. Em seguida, remova cerca de cinco milímetros da camisa de polietileno da extremidade oposta do iluminador usando um descascador de fios de calibre 22. Em seguida, corte a extremidade oposta com uma faca quente para alisar a superfície.Fixe um conector na extremidade do iluminador oposta à ponta gravada. Isso permite que o iluminador se conecte a um cabo óptico ou laser. Depois, polir a extremidade oposta com folhas de lapidação sucessivamente mais finas.Em seguida, insira a extremidade oposta plana em uma ponteira de aço inoxidável de 260 micrômetros de diâmetro interno até que esteja nivelada com a extremidade da ponteira. Confirme visualmente se a extremidade oposta é polida de maneira suave e uniforme com um microscópio de fibra. Cole a ponteira verticalmente na borda da mesa com a abertura menor da ponteira apontando para baixo.Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com epóxi plástico e prenda uma agulha romba de calibre 18 na seringa. Em seguida, use a agulha para aplicar epóxi na ponteira. Encha a ponteira completamente com epóxi.Insira a fibra na ponteira de forma que fique nivelada com o fundo da ponteira. Se necessário, limpe o excesso de epóxi da superfície polida da fibra com um pano úmido sem fiapos antes de secar. Nesta etapa, prepare um microdrive de torre antes de cada sessão de teste.Em seguida, fixe um tubo guia de calibre 25 com uma ponta chanfrada no grampo inferior do inversor. Prenda o iluminador de grande volume no grampo superior na mesma unidade. Esta braçadeira é fixada ao motor de acionamento.Em seguida, passe o iluminador de grande volume totalmente pelo tubo guia e confirme se a ponta do iluminador se estende além da ponta do tubo guia. Como alternativa, a fita de laboratório pode ser aplicada à fibra para que a fita, em vez da própria fibra, seja presa, para proteger a fibra. Em seguida, mergulhe o tubo-guia e o iluminador em uma solução anti-séptica para esterilização.Coloque uma grade esterilizada personalizada com espaçamento de furos de um milímetro dentro da câmara limpa e prenda-a em uma orientação pré-especificada com o parafuso na lateral da câmara. Retraia o iluminador esterilizado do tubo guia puxando o iluminador para cima usando uma pinça romba estéril. A ponta do iluminador deve estar de cinco a 10 milímetros acima da ponta do tubo guia.Fixe o microdrive no suporte e coloque o tubo guia no orifício da grade alvo. Em seguida, abaixe o microdrive stage até que o tubo guia esteja apenas no nível da dura-máter. Ao mesmo tempo, abaixe o iluminador manualmente com uma pinça estéril.Se houver alguma resistência, retraia o iluminador de cinco a 10 milímetros, aguarde 10 minutos e tente novamente. Se ainda houver resistência na segunda tentativa, retraia a ponta do iluminador no tubo-guia, abaixe o tubo-guia 0,25 milímetros e tente novamente. Conecte a ponteira na outra extremidade do iluminador à configuração óptica maior ou ao laser.Esta figura mostra que as taxas de erro aumentaram significativamente com a iluminação. E os gráficos raster aqui mostram a inibição de neurônios abrangendo a espessura de 2,5 milímetros do córtex. E o potencial de campo local mostrando o artefato de luz medindo 4,5 milímetros.Uma vez dominado, um iluminador de grande volume pode ser construído usando esta técnica em 10 a 15 minutos, mais o tempo de secagem do epóxi. A calibração adiciona mais meia hora ou mais, portanto, para maximizar a eficiência, geralmente fazemos vários iluminadores ao mesmo tempo. Ao participar deste procedimento, é importante lembrar que muitos dos iluminadores não atendem aos padrões de controle de qualidade.Tudo bem. Se eles falharem na inspeção da ponta, nós os descartamos. Mas se eles falharem na calibração, geralmente os polimos novamente e repetimos a calibração.Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou a pavimentar o caminho para pesquisadores no campo da neurociência usarem a optogenética para suprimir o disparo neuronal e modular o comportamento em primatas não humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um iluminador de tecido de grande volume.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

A optogenética tornou-se uma ferramenta poderosa para uso em experimentos de neurociência comportamental. Este protocolo oferece um guia passo a passo para o projeto e configuração de sistemas de laser e fornece um protocolo completo para a realização de estímulos optogenéticos in vivo múltiplos e simultâneos compatíveis com a maioria dos paradigmas de teste comportamental de roedores.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

Este protocolo descreve as etapas e a análise de dados necessárias para realizar com sucesso a ressonância magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI é uma nova técnica que combina leitura de fMRI de alto campo com estimulação optogenética, permitindo o mapeamento específico do tipo de célula de circuitos neurais funcionais e sua dinâmica em todo o cérebro vivo.

Ressonância magnética funcional optogenética

Aqui, nós Demonstramos a ressonância magnética (Sr.)-a entrega aumentada da convecção guiada (CED) de vetores virais no córtice como uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais no cérebro do macaque.

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

O método descrito abaixo visa fornecer um protocolo abrangente para a preparação de neurocirurgia de primatas não humanos (NHP) utilizando uma nova combinação de métodos de impressão tridimensionais (3D) e extração de dados de ressonância magnética.

Uma caixa de ferramentas baseada em ressonância magnética para planejamento neurocirúrgico em primatas não humanos

Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.

Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano

A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.

Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo

Este artigo descreve processos automatizados para planejamento neurocirúrgico de primatas não humanos com base em exames de ressonância magnética (RM). Essas técnicas usam etapas processuais em plataformas de programação e projeto para apoiar o projeto de implantes personalizados para NHPs. A validade de cada componente pode então ser confirmada usando modelos anatômicos tridimensionais (3D) impressos em tamanho real.

Uma caixa de ferramentas de design de implante neural para primatas não humanos

Aprenda a construir um iluminador de grande volume para optogenética em primatas não-humanos. Esta técnica permite manipular volumes cerebrais relevantes ao comportamento com mínimo dano tecidual.

Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos

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