Pesquisa básica em Plasma medicina - uma abordagem de taxa de transferência de líquidos para células

O objetivo geral desses ensaios de sequência baseados em vários poços é entender melhor os efeitos do plasma físico frio sobre os oxidantes, às respostas biológicas in vitro, usando espectroscopia de emissões ópticas, análise líquida e atividade celular, microscopia e ensaios de citometria de fluxo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina de plasma, especialmente no que diz respeito às espécies diretivas derivadas do plasma, importantes para a indução da morte de células cancerígenas imunogênicas. A principal vantagem desta técnica é sua abordagem semi-automatizada.

Utiliza placas de 96 poços, para aumentar a velocidade e a produtividade da pesquisa. As implicações dessa técnica se estendem a futuras terapias de plasma, como em dermatologia ou oncologia. E, como eles fornecem os meios para identificar as espécies diretivas derivadas do plasma, que são relevantes para as respostas biológicas.

Demonstrando o procedimento estará Felix Niessner, um técnico do nosso laboratório. Para monitoramento de espécies de plasma, posicione um jato de plasma atmosférico na frente de um espectrofotômetro de emissões ópticas, perpendicular ao eixo da pluma, e use o software dedicado para registrar a fotoemissão e o comprimento de onda de cada condição de gás, em dois litros padrão por minuto de fluxo de gás de alimentação. Para análise de superóxido tratada com plasma, estabeleça um protocolo final para a tabela XYZ, com os respectivos tempos de tratamento e posições de poço apropriados.

Em seguida, adicione 100 microlitros de master mix recém-preparado aos poços de uma placa clara de fundo plano de 96 poços em triplicata e use um leitor de microplacas para medir a absorbância em 550 nanômetros. Para analisar os efeitos do tratamento com plasma nas respostas metabólicas celulares, em uma capela de fluxo laminar, semear uma vez 10 para as quatro células de interesse em 100 microlitros de meio de cultura celular totalmente suplementado, por poço, em uma placa de fundo plano de 96 poços, e incubar durante a noite. Após o cultivo noturno em uma incubadora de cultura de células, use a tabela XYZ para tratar os poços apenas com plasma ou gás, de acordo com a análise experimental, e retorne as células à incubadora por mais 20 horas.

No final da segunda incubação, adicione 25 microlitros de meio de cultura de células frescas, suplementado com 500 micromolares de Resazurina às células, bem como aos três poços de controle de fundo somente com Resazurina. Retorne as células à incubadora, para uma incubação de três horas. Em seguida, meça a fluorescência em um leitor de microplacas.

Para a imagem das células tratadas com plasma, após a leitura da fluorescência, substituir os sobrenadantes por 100 microlitros de meio de cultura de células frescas, complementado com um micrograma por mililitro de iodeto de propídio. Coloque a placa em um microscópio motorizado e selecione a objetiva de 20x para obter imagens das células. Em seguida, use o software de análise de imagem quantitativa apropriado para determinar a área citosólica total em imagens de contraste de fase digital, de todos os campos de visão fotografados em cada poço.

Para análise por citometria de fluxo das células plasmáticas tratadas, após a imagem, lavar as células em cada poço duas vezes com 200 microlitros de PBS, suplementado com cálcio e magnésio por lavagem, seguido de marcação, com 15 anagramas por mililitro de anticorpo monoclonal de calreticulina de camundongo, em 50 microlitros de PBS, mais cálcio e magnésio por poço. Após 15 minutos na incubadora de cultura de células, lave as células duas vezes com 200 microlitros de meio de cultura celular completo e adicione 100 microlitros de solução de descolamento de células a cada poço por 20 minutos, a 37 graus Celsius. Quando as células se desprenderem, carregue a placa no citômetro de fluxo e adquira um mínimo de 1.000 eventos na população de dispersão direta e lateral, geralmente associada a células viáveis.

Em seguida, use o software de análise de citometria de fluxo apropriado para bloquear a população de interesse e determinar a intensidade média de fluorescência da expressão da calreticulina. A espectroscopia de emissões ópticas pode ser usada para seguir os picos distintos ligados aos componentes reativos do plasma em diferentes condições de gás de alimentação. Para o tratamento de líquidos com plasma, a evaporação causada pelo gás argônio e pelo plasma de argônio é determinada primeiro, com as condições produzindo diferentes resultados de evaporação, pois o plasma também exerce efeitos sobre a temperatura.

Semelhante aos resultados da espectroscopia de emissões ópticas para radicais hidroxila, a deposição de peróxido de hidrogênio diminui significativamente com a mistura de oxigênio ou nitrogênio, mas aumenta com o gás de alimentação umidificado. Além disso, a adição de nitrogênio ao gás de alimentação leva a concentrações de nitrato significativamente mais altas, em comparação com os líquidos tratados com plasma de argônio. A maior parte do superóxido é produzida sob condições secas de gás argônio, com aditivos de oxigênio e/ou nitrogênio extinguindo significativamente a geração de superóxido, exceto na presença de plasma de argônio oxigênio umidificado.

As intensidades de fluorescência da resazurina e das células tratadas com plasma são semelhantes às alterações físicas observadas visualmente nos sobrenadantes das culturas de células, confirmando os efeitos citotóxicos do tratamento prolongado com plasma. Uma diminuição na área total da célula também é observada nos poços de amostra de tratamento com plasma, particularmente sob as condições de gás de alimentação umidificado, com uma regulação geral da coloração de calreticulina em células de melanoma de miren, em resposta a exposições mais curtas ao tratamento com plasma. Se realizados corretamente, os ensaios celulares mytoplex e a leitura podem ser concluídos em apenas algumas horas.

Após este procedimento, outros métodos também podem ser realizados, como a co-cultura com células imunes ou a análise de sobrenadantes de cultura de células. Isso ajuda a responder a perguntas adicionais, sobre a liberação de barragens, clientes citológicos ou proteínas redux, bem como o reconhecimento imunológico de células de melanoma tratadas com plasma. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para novas pesquisas sobre ciclos de melanoma, por exemplo, com esferóides tumorais 3D.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar pesquisas básicas em medicina de plasma, desde a fase gasosa de plasma, passando por moléculas e líquidos reativos, até respostas biológicas em células de melanoma.