Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

O geral deste protocolo é utilizar o knockdown condicional da expressão gênica em células cancerígenas para estudar o recrutamento de monócitos e macrófagos para o microambiente tumoral in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microambiente tumoral sobre a natureza do estoque cruzado entre as células cancerígenas e as células do sistema imunológico. A principal vantagem dessa técnica é que o sistema usado aqui requer clonagem de vetor único, permite a geração rápida de vários clones e exibe níveis muito baixos de espessura.

Também foi demonstrado um método de purificação de monócitos humanos sem contato direto com anticorpos que evita a ativação acidental, resultando em mais de 95% de população pura de monócitos humanos. Para produzir partículas virais, transfecte placas de 150 milímetros confluentes a 70% de células HEK-293 com 25 microgramas de shRNA pLKO-tet-on, 25 microgramas do plasmídeo de embalagem psPAX e cinco microgramas do plasmídeo pMD2 que expressa o envelope. G usando reagente de transfecção de acordo com os protocolos padrão.

Adicione a mistura aos pratos de 150 milímetros. No dia seguinte, induzir a produção de lentivirais nas células mudando o meio para DMEM suplementado com butirato de sódio 10 milimolares e HEPES 20 milimolares. Cultura por oito horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após oito horas, lave as células com PBS e adicione 25 mililitros de meio DMEM fresco com HEPES 20 milimolares e sem butirato de sódio. Após incubação por 48 horas, colete cuidadosamente o meio contendo vírus com uma pipeta. Para gerar linhagens celulares estáveis, comece semeando células de câncer de cólon HCT-116 e células de câncer de mama MDA-MB-231 em uma placa de 12 poços e 50.000 células por poço.

Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células estiverem 60-70% confluentes, lave as células com PBS e adicione um mililitro de meio contendo vírus a cada poço. No dia seguinte, remova cuidadosamente o meio contendo vírus por aspiração.

Em seguida, depois de lavar as células com PBS, adicione meio contendo FBS livre de tetraciclina. Após 72 horas, lave as células como antes e adicione meio suplementado com um micrograma por mililitro de puromicina para a seleção de células transfectadas pelo vírus. Selecione células transduzidas por vírus cultivando células na presença de puromicina por três a 14 dias.

Observe a morte parcial dos poços pela puromicina nas células com células transduzidas pelo vírus. As células não transduzidas não crescerão na presença de puromicina. Quando essas células de controle morrerem, continue a cultura das linhagens celulares reguladas condicionalmente por duas semanas na presença de antibióticos para criar as linhagens celulares reguladas condicionalmente.

Verifique a eficiência do knockdown condicional nas células de câncer de cólon HCT-116 resistente à puromicina e câncer de mama MDA-MB-231 adicionando meio com diferentes concentrações de doxiciclina e cultivando as células por 72 horas. Depois de preparar o lisado celular, verifique o nível de knockdown por análise de western blot. Os níveis de PAI-1 são mostrados aqui.

Para isolar os monócitos do sangue periférico, primeiro prepare três tubos de 50 mililitros contendo 15 mililitros de solução de gradiente de densidade. Em seguida, use um controlador de pipeta ajustado no fluxo gravitacional para colocar lentamente 30 mililitros de sangue diluído sobre a solução de gradiente de densidade. Centrifugar num rotor oscilante a 400 g à temperatura ambiente sem pausas durante 25 minutos.

Após a centrifugação, descarte a camada superior e transfira a camada intermediária contendo células mononucleares do sangue periférico para um novo tubo de 50 mililitros e adicione PBS suplementado com FBS até 50 mililitros. Centrifugue a 120 g à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante contendo plaquetas.

Após a centrifugação e coleta final, ressuspender o pellet em 50 mililitros de PBS suplementado com FBS e contar as células mononucleares do sangue periférico usando um hemocitômetro. Depois de centrifugar as células a 120 g's, ressuspenda o pellet em PBS suplementado com FBS contendo um EDTA milimolar até uma concentração final de 50 milhões de células por mililitro. Em seguida, comece a enriquecer os monócitos adicionando 50 microlitros de coquetel de anticorpos de seleção negativa para cada mililitro de suspensão celular e misture.

Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 50 microlitros de esferas magnéticas por mililitro, misture e incube por mais 10 minutos. Em seguida, adicione PBS com FBS e EDTA até 25 mililitros e coloque a mistura mononuclear do sangue periférico em um ímã que pode acomodar um tubo de 50 mililitros.

Após incubação por 10 minutos em temperatura ambiente, as esferas magnéticas aderirão às paredes do tubo e sequestrarão as células não monocíticas da solução. Use uma pipeta de 25 mililitros para remover a solução contendo monócitos do tubo, tomando cuidado para não tocar nas laterais do tubo com a pipeta. Depois de centrifugar e remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet contendo monócitos em meio RPMI contendo 10% de FBS livre de TET e 1% de estreptococos.

Comece o ensaio semeando 40.000 células HCT-116 ou MDA-MB-231 em um volume de 0,5 mililitro nos poços de uma placa de 24 poços em triplicata. No dia seguinte, adicione um filtro ao poço. Em seguida, coloque 8.000 monócitos em um volume de 0,3 mililitro em uma inserção de membrana porosa tratada com BSA colocada no topo das células cancerígenas e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Colete as inserções após 48 horas. Sacuda o excesso de meio e passe com precisão a superfície interna com um aplicador com ponta de algodão para remover as células que não migraram. Pinte o lado externo do inserto usando o método Wright-Giemsa.

Depois de montar os filtros com os macrófagos migrados voltados para cima, faça a imagem das lâminas usando um microscópio de luz com uma objetiva de 20 potências. Tire fotos de nove campos por filtro e conte os macrófagos migrados em todos os campos. O Ensaio de Câmara de Boyden foi usado para quantificar a migração de monócitos para células cancerígenas.

Na presença de células de câncer de mama MDA-MB-231, a migração de monócitos foi inibida em 33% após a adição de doxiciclina à co-cultura para regular negativamente o PAI-1. Essa inibição da migração de monócitos foi mais pronunciada na presença de células cancerígenas do cólon HCT-116, onde o knockdown de PAI-1 pela administração de doxiciclina reduziu a migração de monócitos em 74% Resultados semelhantes foram observados quando as condições médias para células cancerígenas tratadas com doxiciclina foram colocadas no fundo dos poços como fonte de quimioatraentes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como usar um sistema tet-on funcional para knockdown da expressão gênica em linhagens de células cancerígenas humanas para estudar o efeito quimioatraente da proteína secretada derivada do câncer PAI-1 nos monócitos humanos.