Protocolo de uma etapa para a avaliação do modo de morte celular induzida por radiação de Clonogenic por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste ensaio é avaliar os principais modos de morte celular clonogênica induzida por radiação ionizante com base nas morfologias características dos núcleos corados com DAPI. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia da radiação. A principal vantagem desta técnica rápida e econômica é que os principais modos de morte celular clonogênica induzida por radiação ionizante podem ser avaliados simultaneamente.

Geralmente, indivíduos novos na biologia da radiação terão dificuldade em avaliar a morte celular clonogênica induzida por radiação porque diferentes ensaios são necessários para avaliar cada modo de morte celular. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando realizamos uma triagem em larga escala da morte celular clonogênica induzida por radiação usando várias linhagens celulares e doses de radiação. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia da radiação, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a quimioterapia para o câncer.

Demonstrando o procedimento estará nosso colaborador, Atsushi Shibata. Comece esterilizando um bisturi com papel toalha umedecido com etanol 70%. Em seguida, use o bisturi para colocar uma lamínula em uma placa de cultura de células de 35 milímetros.

Ao prato de cultura com a lamínula, adicione um mililitro de meio de cultura. Agora segure suavemente o centro da lamínula com uma pinça estéril e aspire completamente o meio de cultura do prato. Em seguida, preparar uma suspensão de células de três mililitros em meio de cultura num tubo de 15 ml.

Adicione a suspensão celular à placa de cultura. E incube-o durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Certifique-se de que as células estejam presas à lamínula e vivas, examinando-as sob um microscópio de contraste de fase invertido.

Agora irradie o prato com seis cinzas de radiação de raios-X. Após a irradiação, incubar as células em uma incubadora por 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Agora pegue as células da incubadora e aspire o meio de cultura da placa de cultura.

Corte a ponta de uma micropipeta de 1.000 microlitros a cerca de cinco milímetros da extremidade usando uma tesoura. E use-o para adicionar um mililitro de solução de fixação ao prato de cultura. Aplique a solução de fixação ao longo das paredes da placa de cultura para minimizar os danos às células.

Em seguida, transfira esta placa de cultura para uma placa de cultura quadrada e agite-a suavemente para distribuir uniformemente a solução de fixação sobre a lamínula. Depois disso, incube o prato por 10 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução de fixação do prato.

Agora adicione dois mililitros de PBS ao longo das paredes do prato. E então aspire o PBS. Para se preparar para a coloração DAPI, adicione cinco microlitros de reagente de coloração DAPI em uma lâmina de vidro.

Em seguida, remova a lamínula do prato usando um bisturi. E escorra o excesso de PBS na lamínula tocando a borda da lamínula com uma toalha de papel. Agora monte a lamínula de cabeça para baixo na gota do reagente de coloração DAPI na lâmina de vidro para que as células sejam expostas ao reagente de coloração DAPI.

Finalmente, examine as células coradas sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro DAPI. As morfologias nucleares em cada um dos três modos de morte celular são mostradas. As células apoptóticas são vistas com núcleos condensados.

Múltiplos lobos são observados em núcleos de células submetidas a catástrofe mitótica. As células submetidas à senescência exibem focos característicos de heterocromatina associados à senescência. Uma observação comparativa de núcleos irradiados simulados e núcleos irradiados com raios-X de seis cinzas é mostrada.

Os círculos indicam núcleos em apoptose e as setas indicam núcleos em catástrofe mitótica. A avaliação de cerca de 300 núcleos submetidos à irradiação em comparação com o simulado é mostrada. A irradiação de raios-X de seis cinzas é vista como causadora de catástrofe mitótica com mais frequência em cerca de 25%, seguida de apoptose em cerca de 5% e eventos de senescência muito raros.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não danificar as células aplicando soluções diretamente nas lamínulas. Após este procedimento, outros métodos, como análise de citometria de fluxo ou proteínas marcadoras de morte celular, bem como coloração de beta-galactosidase associada à senescência para avaliar a senescência podem ser realizados para entender melhor cada modo de morte celular clonogênica.