Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

O objetivo geral desta técnica é detectar mutações de baixa frequência no tumor circulante ou ctDNA para fornecer aos médicos clínicos uma ferramenta poderosa para diagnosticar tumores e monitorar a dinâmica do tumor em resposta à terapia. O método de teste do ctDNA pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre quais tipos de mutações um paciente carrega, como variação do tipo nuclear único, deleção de inserção, variação do número de cópias e variação estrutural. A principal vantagem desta técnica é a alta sensibilidade e especificidade que detectam com precisão as mutações de baixa frequência no ctDNA.

Demonstrando os procedimentos estará Yuliang Yang, um técnico do meu laboratório. Para começar, retire 10 mililitros de sangue periférico em um tubo de coleta e inverta suavemente o tubo para cima e para baixo de seis a oito vezes para misturar o conteúdo. Armazene amostras de sangue nos tubos de coleta de seis a 37 graus Celsius por até 72 horas.

Centrifugar o tubo de recolha a 1 600 vezes g à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta de descarte para transferir o sobrenadante ou plasma do tubo para quatro tubos de centrífuga limpos de dois mililitros devidamente rotulados sem perturbar o pellet. Use uma pipeta de descarte limpa para transferir um mililitro das células para um tubo de centrífuga de dois mililitros devidamente rotulado.

Armazene as células a menos 20 graus Celsius ou mais frio antes do isolamento genômico ou gDNA. Em seguida, centrifugue o plasma a 1.600 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, transfira o plasma para tubos de centrífuga limpos devidamente rotulados como plasma, deixando aproximadamente 0,1 mililitro de volume residual no fundo para evitar contaminação.

O buffy coat deve ser evitado do plasma durante o processo de separação. Caso contrário, grandes fragmentos de DNA extraídos das células podem diluir o ctDNA e afetar a sensibilidade do teste. Usando um kit disponível comercialmente, isole o cfDNA de três mililitros do plasma coletado seguindo as instruções do fabricante.

Em seguida, também com um kit, isole o gDNA de 200 microlitros de glóbulos brancos seguindo as instruções do fabricante. Para fragmentar a amostra de controle de gDNA por sonicação, prepare um micrograma de amostra de gDNA em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA em um tubo de sonicação limpo. Defina o programa de sonicação para 30 segundos ligado e 30 segundos desligado por 12 ciclos por um total de 12 minutos.

Depois de confirmar que o produto contém 200 a 250 fragmentos de pares de bases, transfira todos os produtos de fragmentação para um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 150 microlitros de esferas magnéticas e incube a amostra por cinco minutos para selecionar os fragmentos corretos. Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético por 30 segundos e remova o sobrenadante. Em seguida, mantendo o tubo no rack, adicione 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado para lavar as contas.

Incube as esferas por 30 segundos antes de remover o sobrenadante e repita a lavagem. Mantenha o tubo no rack com a tampa aberta para secar as contas ao ar. Em seguida, eluir os fragmentos de DNA adicionando 32 microlitros de Tris-HCL 10 milimolares às contas.

Para realizar a reação de preparação final seguindo as instruções do fabricante, adicionar a um tubo estéril sem nuclease sete microlitros de tampão de reação, três microlitros da mistura enzimática, 30 nanogramas de cfDNA e água duplamente destilada para um volume total de 60 microlitros. Em um tubo separado, adicione os mesmos componentes, mas com um micrograma de gDNA em vez de cfDNA. Incube a mistura em um termociclador a 20 graus Celsius por 30 minutos, seguido de 65 graus Celsius por 30 minutos sem a tampa aquecida.

Imediatamente após a incubação, adicione 30 microlitros da mistura master de ligação, um microlitro do intensificador de ligadura e quatro microlitros do adaptador de sequenciamento exclusivo ao tubo. Incube a reação no termociclador a 20 graus Celsius por 15 minutos sem a tampa aquecida. Vortex para ressuspender as esferas magnéticas e deixá-las em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.

Em seguida, adicione 87 microlitros dos grânulos magnéticos ressuspensos à reação de ligação. Misture bem pipetando para cima e para baixo e, em seguida, incube a amostra em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de lavar e secar ao ar as contas, eluir o alvo de DNA das esferas adicionando 20 microlitros de Tris-HCL 10 milimolares.

Adicione 20 microlitros de fragmentos de DNA ligados ao adaptador, cinco microlitros de primer índice i7, 25 microlitros de master mix de amplificação de biblioteca e água duplamente destilada até um volume total de 50 microlitros. A PCR amplifica o cfDNA ou gDNA ligado ao adaptador. Em seguida, adicione 45 microlitros de esferas magnéticas suspensas ao DNA enriquecido com PCR.

Misture a amostra pipetando para cima e para baixo e incube-a por cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante e lavar as contas, use 30 microlitros de Tris-HCL 10 milimolares para eluir os fragmentos de DNA com adaptadores. Para realizar a captura de DNA direcionada, em um tubo estéril, bloqueie a amostra adicionando 1,5 microgramas de bibliotecas de pooling, oito microlitros de cada bloco P5 100P e P7 bloco 100P e cinco microlitros de um micrograma por microlitro de um DNA.

Seque o conteúdo do tubo usando um concentrador de vácuo ajustado a 60 graus Celsius. Hibridize as sondas de captura de DNA com a biblioteca adicionando 8,5 microlitros de tampão de hibridização 2X, 2,7 microlitros de intensificador de hibridização e 1,8 microlitros de água duplamente destilada sem nuclease. Misture pipetando para cima e para baixo e incube no misturador térmico a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, adicione imediatamente quatro microlitros da sonda personalizada. Incube as amostras em um misturador térmico a 65 graus Celsius com a tampa aquecida a 75 graus Celsius por quatro horas. Incube o DNA alvo hibridizado com grânulos de estreptavidina e lave os grânulos para remover o DNA não ligado.

Use o kit comercial de acordo com as instruções do fabricante para obter 20 microlitros finais de esferas ressuspensas com fragmentos de DNA capturados. A etapa de lavagem do DNA não ligado das esferas de estreptavidina deve ser rápida. Caso contrário, a eficiência de captura do DNA alvo pode ser afetada.

Amplifique os fragmentos de DNA capturados realizando PCR usando um kit comercial com dois oligonucleotídeos de estrutura micromolar de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, adicione 45 microlitros de grânulos suspensos diretamente ao produto de PCR e enriqueça os fragmentos de DNA alvo amplificados ligados aos grânulos por eluição com 30 microlitros de Tris-HCL 10 milimolares. Quantificar os fragmentos e realizar sequenciamento e análise de dados de acordo com o protocolo de texto.

Esta tabela descreve como o ER-seq melhora a profundidade de cobertura em 23% em comparação com o método tradicional. Isso se deve à sua recuperação eficiente de moléculas de cfDNA, melhorando muito a análise de mutações raras. Também está claro que os adaptadores de sequenciamento exclusivos usados no ER-seq permitem fácil diferenciação de duplicações naturais e induzidas por PCR.

Conforme detalhado nesta tabela sobre os resultados da chamada, a análise baseada em ER-seq foi 100% consistente para a detecção de EGFR pL858R e a frequência de detecção foi um pouco maior quando comparada com uma análise tradicional. É importante ressaltar que a análise ER-seq permitiu a detecção de outras mutações de frequência relativamente baixa, incluindo EGFR pT790M, que não foi reconhecido pela análise tradicional devido ao alto ruído de fundo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 48 horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a perda de uma quantidade muito baixa de cfDNA durante a extração, preparação da biblioteca e lavagem do grânulo após a hibridização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o ctDNA do paciente foi coletado, preparado e direcionado com base no único identificado para sequenciamento. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores da área de biópsia líquida explorassem as melhores práticas na tomada de decisões clínicas.