Name: Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Aprenda o isolamento em massa e cultivo in vitro de miracídios de Schistosoma mansoni usando modelo murino. Este protocolo avança pesquisas sobre esquistossomose e ciclo biológico do parasita.

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Financiado em parte pela concessão de NIH RO1AI015503. Ratos infectados esquistossomíase foram fornecidos pela esquistossomose NIAID Resource Center, no Instituto de pesquisas biomédicas (Rockville, MD) através de HHSN272201000005I de contrato NIAID-NIH para distribuição por meio de recursos do BEI.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Wisconsin-Madison, sob protocolo e cuidados institucionais de Animal nenhum. V005717. O seguinte protocolo envolve o trabalho em uma instituição de nível de biossegurança 2 (BSL2) para patógenos humanos, apesar de nenhum dos estágios esquistossomíase retratados no presente protocolo são infectantes aos seres humanos ou outros mamíferos. Segui as políticas institucionais para a manipulação de agentes patogénicos humanos risco grupo 2 (RG2).
Nota: Nós usamos ratos fêmeas Swiss-Webster (6 - semanas de idade) devido à sua maior susceptibilidade à infecção10, desse modo, produzindo fardos de ovo maiores. Tucker et al descrevem os protocolos de infecção mouse e caracol usados neste modelo sistema11. A Tabela de materiais lista todos os equipamentos específicos, materiais, reagentes e animais fontes necessárias para realizar este protocolo experimental.
1. processamento de fígados infectados
<ol><li>Eutanásia em ratos, pós-infecção 6-7 semanas, por asfixia de CO2 (taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto). Monitor de ratos para cessação da respiração e batimento cardíaco. Nota: Normalmente, até 20 ratos podem ser transformados em um determinado momento.</li>
	<li>Após a transferência de ratos sacrificados para uma armário de biossegurança, coloque os ratos em suas costas e pulverizar suas superfícies ventrais com etanol a 70%. Deixe de molho por 1 min.</li>
	<li>Beliscar e puxar a pele do abdômen inferior e corte em toda a base da pele comprimida mais próximo ao abdômen com uma tesoura cirúrgica estéril. Puxe a pele cortada anteriormente (ou seja, em direção a cabeça) para revelar o fígado. Observe que o fígado deve ser ampliado e salpicado devido a uma reação granulomatosa induzida por ovo (Figura 2A).</li>
	<li>Remover o fígado e coloque-o em um béquer contendo 200 mL de estéril 1,2% NaCl solução contendo caneta/estreptococos.</li>
	<li>Repita as etapas de 1.3 e 1.4 com ratos restantes. Nota: Vinte ratos geralmente são processados em uma única colheita.</li>
	<li>Coloque os fígados em uma placa de Petri estéril e remover não-fígado gordo/conjuntivo tecidos com Pinças esterilizadas.</li>
	<li>Transferi aparadas/limpa fígados para uma garrafa de centrífuga estéril de 250 mL contendo ~ 200 mL de solução de NaCl de 1,2% estéril com caneta/estreptococos.</li>
	<li>Vigorosamente agitar o frasco que contém os fígados e, usando uma pipeta descartável estéril, remover a excesso superfície espuma/flutuante de detritos. Lentamente, despeje o restante da solução salina em um recipiente ou afundar contendo 1% de cloro (desinfectante).</li>
	<li>Adicionar ~ 200 mL de solução salina fresca para os fígados e repita o passo 1.8 mais três vezes.</li>
</ol>2. fígado isolamento de extração e miracidial
<ol><li>Coloque os fígados em um copo pequeno estéril aço inoxidável liquidificador e adicionar ~ 2 mL da solução de NaCl de 1,2% (Figura 2B).</li>
	<li>Cubra o copo com papel alumínio e uma placa de Petri para evitar derramamentos e misturar por 1 min, alternando-se baixa e alta velocidade (20 s baixa velocidade/10 s alta velocidade; repetir) (Figura 2).</li>
	<li>Distribua uniformemente a suspensão de fígado misturada em frascos estéreis 250 mL centrífuga (para 20 fígados usam 4 garrafas).</li>
	<li>Adicione uma solução salina estéril com antibióticos para o volume total de ~ 200 mL/frasco. Peso/equilíbrio garrafas antes da centrifugação.</li>
	<li>Centrífuga de fígados misturados a 290 x g durante 15 min em 4 óC. delicadamente despeje sobrenadantes em um recipiente com água sanitária antes de serem eliminados.</li>
	<li>Repita os passos de 2.4-2.5 uma vez. Certifique-se de completamente Ressuspender o sedimento fígado antes da centrifugação.</li>
	<li>Após descartar a última solução salina lavar (passo 2.6), adicionar 200 mL de água estéril lagoa com caneta/estreptococo no tecido hepático peletizadas, shake para Ressuspender o sedimento e a suspensão de transferência para um balão aferido de 1L esterilizado que foi completamente coberto com alumínio folha, exceto a parte superior do pescoço (Figura 2D) de 3 cm. Nota: Use duas garrafas (= 10 fígados) por balão 1-L. Água da lagoa simula o ambiente de água doce natural necessário para estimular o miracidial para incubação de ovos.</li>
	<li>Usando a água da lagoa estéril, encha o balão para cerca de 3 cm acima da folha cobrindo no pescoço. Então, sem demora (como miracidia logo começam a eclodir), retire a espuma residual e flutuando na superfície, pipetando rapidamente até ~ 12 mL de água da lagoa contendo os restos de tecido hepático e descartá-lo em um separado descartar o tubo. Substitua por água fresca lagoa estéril.</li>
	<li>Repita a limpeza passo 2.8, mais três vezes, verificando a presença de miracidia no tubo de descarte. Cesse a repetição da etapa de limpeza se miracidia aparece na solução de lavagem.</li>
	<li>Após a última lavagem, adicione lentamente ~ 12 mL de água da lagoa estéril quente (pré aquecida a 30 oC) para criar um gradiente de temperatura com água morna limpa e esterilizada por cima. Nota: Isto é realizado melhor por descarregando lentamente a água ao longo da lateral do pescoço do frasco para evitar a mistura.</li>
	<li>Coloque uma pequeno prato de Petri de capa sobre a abertura do frasco e brilhar uma luz brilhante na parte superior do balão acima a capa da folha para iluminar a superfície superior da água. Nota: Normalmente, dentro de 5-10 min, natação miracidia, atraído pela luz, irá se concentrar em grandes números dentro o primeiros 2-3 cm de água da lagoa (Figura 3A).</li>
</ol>3. Miracidial colheita e cultivo
<ol><li>Quando miracidia reuniram-se na superfície após 10min, usando uma pipeta de transferência estéril, remova ~ 8 mL de água da lagoa e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloca o tubo contendo miracidia no gelo.</li>
	<li>Adicionar fundo 8 mL de água estéril quente ao longo do interior do balão volumétrico e esperar mais 10 minutos.</li>
	<li>Usando novos tubos de cada vez, repita as etapas de 3.1 e 3.2 mais três vezes. Após a coleta deth 4, mantenha o tubo final no gelo durante 10 minutos permitir que o miracidia resolver. Este conjunto de tubos compreende a primeira colheita.</li>
	<li>Tubos de centrífuga contendo miracidia a 290 x g por 1 min em 4 óC numa centrifugadora refrigerada pre-cooled.</li>
	<li>Imediatamente remova a maior parte do sobrenadante (~ 7 mL), tomando cuidado para não perturbar a pelota de parasita (Figura 3B).</li>
	<li>Piscina toda a miracidia desta primeira colheita em um tubo, então Lave todos os tubos originais com água da lagoa estéril ~ 1 mL e adicionar ao tubo de "pool".</li>
	<li>Permitir que os parasitas que se contentar em gelo ~ 5 min e centrifugue novamente os parasitas a 290 x g por 1 min em 4 oC.</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e adicionar que 6-8 mL estéril Chernin balanceamento de solução salina (CBSS +; ver tabela de materiais) contendo caneta/estreptococos.</li>
	<li>Suspenda suavemente o miracidia e alíquota-los em uma placa de cultura de 24 poços (1 mL por bem), seguido de lavagem do tubo em 6-8 mL CBSS + e adicionar 1 mL de lavagem a cada poço. Incube os parasitas em 26 oC sob condições normoxic. Concentrações de miracidia isolado irão variar, mas geralmente média ~ 7000/mL.</li>
	<li>Se parasitas ainda estão se concentrando na fonte luminosa, repita os passos 3.1 a 3.9 para continuar a colheita final-incubação miracidia mas aumentar o intervalo de tempo entre coleções de 15-20 min. Nota: Este novo conjunto de tubos representa a segunda colheita. No entanto, porque os números de miracidial normalmente são baixos, as larvas de todos os tubos normalmente são agrupadas em uma única cultura bem contendo 2 mL CBSS +.</li>
	<li>Em 24h pós-colheita e cultivo, Ressuspender delicadamente sporocysts em seus poços pipetando.</li>
	<li>Espere alguns minutos para permitir que os parasitas resolver no fundo dos poços. Uma vez que eles se instalaram, remova cuidadosamente o sobrenadante (~1.5 mL), que irá conter a maioria das placas ciliadas epidérmicas derramadas por miracidia durante transformação larval. Essa "transformação" sobrenadante pode ser descartada ou incorporada em estudos de seguimento de produtos secretoras larvas.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de CBSS fresco + para cada bem e delicadamente pipeta para Ressuspender sporocysts. Repita a etapa 3.12 se desejar ainda mais lavagem ou mudar para um meio diferente.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espaço BSL2, é al...

O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo1. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana2. O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.
Adulto masculino e feminino de S. mansoni verme pares vivem nas veias mesentéricas posteriores de reproduzir o anfitrião dos mamíferos, resultando na liberação de ovos embrionados (óvulos) que se alojaram nas pequenas vênulas da mucosa intestinal. Ovos, em seguida, rompe as paredes dos vasos, migram através do tecido da mucosa e acabaram por inserir o lúmen intestinal onde eles são anulados com as fezes. Quando óvulos digite escotilha de larvas de água doce e livres (miracidia), eles devem, na ordem curta, encontrar um caracol de Biomphalaria apropriado para infectar a fim de continuar seu ciclo de vida. Esse processo de infecção envolve miracidial apego à superfície do corpo exterior o caracol seguido por penetração ativa e entrada da larva no hospedeiro. Logo após a entrada, o miracidium começa a derramar suas placas epidérmicas ciliadas exteriores como forma um sincício que se tornará a nova superfície externa (tegumento) do próximo estágio larval, o sporocyst primário ou mãe. Através de reprodução assexuada, cada sporocyst primário produz e libera uma segunda geração de sporocysts, denominados secundários ou sporocysts filha, que por sua vez, geram e liberar um grande número de fase intramolluscan final, a cercaria3 . Após a fuga do host de caracol, cercárias livres são capazes de anexar a e penetrando diretamente na pele de um humano ou outro hospedeiro adequado mamífera. Com a entrada em seu novo hospedeiro, cercárias transformam-se para a fase de parasitas schistosomula e invadem o sistema vascular. Eles, por sua vez, migraram para o pulmão e depois para a veia hepática onde amadurecem aos vermes adultos, formam pares masculinos e femininos e viajar para as veias mesentéricas para completar seu ciclo de vida.
Intramolluscan de sucesso ou desenvolvimento de "fase de caracol" de schistosomes larvas é essencial para a continuação do ciclo de transmissão humana de host para host. De importância crítica é a seguinte entrada de período do miracidium livres para o host de caracol e a sua transformação precoce à fase primária sporocyst. Dependendo da compatibilidade fisiológica e imunológica entre hospedeiro e parasita, é durante esta fase de desenvolvimento larval esse sucesso inicial ou falha estabelecer infecções é determinado4,5,6 . Desenvolvimento subsequente de primários sporocysts capazes de produzir assexuadamente sporocysts secundários, o que geram humanos-infectantes cercárias, mais exigem um ambiente de host fisiológicas permissiva que fornece para todo o crescimento do parasita e precisa de reprodutiva.
Até à data, pouco é conhecido sobre a base fisiológica, bioquímica e moleculares processos controlar interações esquistossomíase-caracol, especialmente as moléculas e vias envolveram na regulação da reprodução e desenvolvimento larval, ou modulando respostas imunes de anfitrião. Pronto acesso a um grande número destes estágios larval condições em vitro cultura que permitem a manipulação experimental que iria facilitar muito a descoberta de caminhos do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes do crescimento celular, diferenciação e reprodução. Caminhos críticos parasita ou mecanismos, identificados através de experimentos em vitro , poderiam então ser usados para interromper o crescimento larval/reprodução do acolhimento de caracol, ou para identificar mecanismos imunes de anfitrião de caracol envolvidos no reconhecimento e eliminação de estágios miracidial ou sporocyst.
Neste artigo e o vídeo de apresentação, nós fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar um grande número de livres de S. mansoni miracidia para introdução em vitro de cultura que pode ser sujeito a acompanhamento experimental manipulação (ver Figura 1 para uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo). Embora os procedimentos semelhantes têm sido descritos anteriormente7,8,9, nós sentimos que um protocolo detalhado seria útil para pesquisadores que desejam empregar este modelo para abordar questões ainda sem resposta relacionadas com intramolluscan desenvolvimento larval, proliferação celular e interações imune esquistossomíase-caracol. Além disso, esta abordagem pode facilmente ser adaptada para isolamento de ovos provenientes de outras tremátodes medicamente importantes como bexiga-moradia S. haematobium, solhas de fígado ou acasos de pulmão.

<table><tbody><tr><td><forte>solução salina balanceada de Chernin (CBSS+)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Para 1L de solução</forte></td></tr><tr><td>2,8 g de cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Dissolva sais, exceto cloreto de cálcio, e&nbsp;</td></tr><tr><td>0,15 g de cloreto de potássio</td><td>Açúcares Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>em 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,07 g de fosfato de sódio, dibásico anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Dissolva o cloreto de cálcio separadamente em 200&nbsp;</td></tr><tr><td>0,45 g de sulfato de magnésio heptahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g cloreto de cálcio di-hidratado&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Adicione lentamente o soln de cálcio ao soln de sal/açúcar com&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 g de bicarbonato de sódio&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>com mistura constante</td></tr><tr><td>1 g de glicose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Ajuste para pH 7.2 e esterilize por filtro usando um&nbsp;</td></tr><tr><td>1 g de trealose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0,22 &micro; m filtro descartável de garrafa</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicilina/estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Adicione penicilina filtrada e sola de estreptomicina; uso prévio</td></tr><tr><td><forte>Incompleto Bge&nbsp; meio (Ibge)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Para solução de 900 mL</forte></td></tr><tr><td>220 mL Schneider' s Drosophila meio modificado</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Misture o meio de Schneider com 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4,5 g de hidrolisado enzimático de lactalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Adicione hidrolisado de lactalbumina e galactose</td></tr><tr><td>1,3 g de galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Ajuste para pH 7,2 e filtre esterilize usando um 0,22 &micro; m filtro descartável pré-esterilizado</td></tr><tr><td><forte>Meio Bge completo (cBge)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Para 100 mL de solução</forte></td></tr><tr><td>90 mL Meio</td><td></td><td></td> Bge incompleto <td>Para inativar o FBS por calor: Incubar o FBS descongelado em&nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL de calor inato. soro fetal bovino (FBS) (Optima)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>banho-maria a 60&deg; C por 1 hora enquanto suavemente&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL de penicilina/estreptomicina 100X</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>girando o frasco a cada 10 min Alíquota FBS inativada por calor em tubos de 15 mL&nbsp; e armazene a -20 graus Celsius. Misture o meio + FBS e esterilize com filtro usando um 0,22 &micro; m pré-esterilizado&nbsp; filtro descartável de tampa de garrafa&nbsp; Adicione penicilina e estreptomicina antes de usar</td></tr><tr><td><forte>Água da lagoa (solução estoque)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1L de solução estoque</forte></td></tr><tr><td>12,5 g de carbonato de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Misture todos os sais em 1L de ddH2O</td></tr><tr><td>1,25 g de carbonato de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Note que os sais não terão completamente&nbsp;</td></tr><tr><td>1,25 g&nbsp; cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>dissolvido.&nbsp; Agite vigorosamente para suspender&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,25 g&nbsp; de cloreto de potássio</td><td>Sais Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>antes de fazer a sola de trabalho; &nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Água da lagoa (solução de trabalho)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1,5L de solução</forte></td></tr><tr><td>0,8 mL de solução estoque água da lagoa (agite antes do uso) em&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Misture o estoque para ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL de ddH2O</td><td></td><td></td><td>Esterilize a água da lagoa por autoclave (lento&nbsp; ciclo)</td></tr> <tr><td>1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio</td></tr><tr><td><forte>solução salina (NaCl 1,2%)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1,5L de solução</forte></td></tr><tr><td>18 g de cloreto de sódio em 1500 mL de ddH2O</td> Solução salina em autoclave <td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>para esterilizar</td></tr><tr><td>1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio</td></tr><tr><td><forte>Equipamento e material adicionais:&nbsp; Câmara de</td> eutanásia de camundongo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L</td><td>Seguindo o protocolo IACUC aprovado nº V001551</td>Ratos Taconic Biosciences Swiss-Webster, fêmea, 6 semanas de idade, murina&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Tanque e regulador</td><td></td><td></td> de CO2 placa de cultura de tecidos de 24 <td>poços</td></tr><tr><td></td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td></td><td></td><td></td>volumétricos de 1 L</tr><tr><td>Fonte de luz (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Modelo F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, refrigerada, balde oscilante</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga garrafas (250 mL)</td> <td>Tubos</td> de centrífuga Nalgene <td></td><td></td></tr><tr><td>de 15 mL, tubos de transferência descartáveis estéreis</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Estéreis&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; M Filtro de Garrafa Descartável Pré-esterilizado&nbsp;</td><td>Liquidificador EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Aço inoxidável</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Copo de liquidificador, capacidade de 100 mL</td><td>Microscópio</td> composto invertido Waring Commercial <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento em massa e cultivo in vitro de intramolluscan fases do sangue fascíola schistosoma mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.

A grande maioria dos miracidia normalmente será foram coletada os dois primeiros "colheitas". Incubação de miracidia isolado na CBSS + desencadeia o processo de transformação de miracidium-para-sporocyst (Figura 4A- C). Dentro da primeira hora seguinte transferência de cultura poços contendo CBSS +, a maioria dos miracidia cessar natação (Figura 4A). Às 6 h em cultura, miracidia estão ativamente derramamento suas...

Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .

Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Neste vídeo, descrevemos um protocolo detalhado para a eclosão e isolamento em larga escala de miracídios de Schistosoma mansoni de natação livre e a subsequente introdução em cultura in vitro. Schistosoma mansoni é uma das quatro principais espécies de vermes do sangue que infectam mais de duzentos milhões de pessoas em todo o mundo, causando a doença tropical negligenciada conhecida como esquistossomose. O ciclo de vida do esquistossomo é complexo, envolvendo caracóis como hospedeiros intermediários e mamíferos, incluindo humanos, como hospedeiros definitivos.O cultivo in vitro de esquistossomos larvais e adultos representa uma ferramenta inestimável para o avanço da pesquisa para o controle e eliminação desta doença parasitária. Neste vídeo, usando um modelo de camundongo para produzir ovos de S. mansoni contendo o estágio miracidial infectado por caracóis, ilustramos um procedimento passo a passo para isolamento em massa de miracídios eclodidos de ovos recuperados de fígados e seu cultivo in vitro. Ajudando-me nesta demonstração estão Nathalie Dinguirard e Codie Heinemann.Veja a seguir um diagrama de fluxo de trabalho que ilustra as três etapas principais a serem abordadas no v

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Transformação e Cercarial In vitro Cultivo de Schistosoma mansoni Esquistossômulos

Ovos de Schistosoma mansoni são potentes estimuladores do tipo T helper 2 (Th2) resposta imunológica, característica da infecção por parasita, asma e inflamação alérgica. Este protocolo utiliza S. mansoni injecção de ovo para gerar CD4 de resposta de citocinas induzida por Th2 inflamatória no pulmão, caracterizada por formação de granuloma pulmonar em torno do ovo, eosinofilia e macrófagos activação alternativa.

Usando Ovos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como um<em&gt; Em vivo</em&gt; Modelo de Helmintos induzida por inflamação pulmonar

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Descrevemos aqui os últimos avanços no isolamento viral para a caracterização de novos genótipos de Faustovirus, uma nova linhagem de vírus gigantes relacionada ao asfarvirus. Este protocolo pode ser aplicado ao isolamento de alto rendimento de vírus, especialmente vírus gigantes que infectam ameba.

Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Aqui, fornecemos um método para alcançar a transfecção estável de parasitas de frango Eimeria por nucleofecting esporozoitas ou merozoitas de segunda geração. Parasitas eimerianos geneticamente modificados expressando genes antigênicos heterologous poderiam ser usados como veículos de entrega de vacinas.

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

Usando fresagem por feixe de íons focalizado para produzir lamelas vítreas on-grid a partir de amostras biológicas congeladas por imersão para tomografia crio-eletrônica.

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração.

Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda o isolamento em massa e cultivo in vitro de miracídios de Schistosoma mansoni usando modelo murino. Este protocolo avança pesquisas sobre esquistossomose e ciclo biológico do parasita.

Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

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