Name: Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a medir fagocitose in vivo em embriões de Drosophila para avaliar genes envolvidos na eliminação de células apoptóticas. Este método auxilia pesquisadores em imunologia e biologia do desenvolvimento.

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Agradecemos a Kaz Nagaosa e Akiko Shiratsuchi pelo seu conselho.

1. Preparação <ol><li> Preparação de placas de agar de suco de uva fresca <ol><li> Adicione 100 mL de água a 4,4 g de ágar e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver o ágar. </li><li> Adicione 80 mL de suco de uva fresco, 5 mL de ácido acético e 5 mL de solução de etanol em ágar. </li><li> Despeje aproximadamente 1,5 ml da solução com uma pipeta em cada lâmina de vidro e deixe solidificar. </li></ol></li><li> Preparação de placas de agarose de prato de 6 cm <ol><li> Adicionar 50 mL de água a 0,5 g de agarose e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver a agarose. </li><li> Despeje aproximadamente 2.5 mL de solução de agarose em um prato de 6 cm com uma pipeta. </li></ol></li></ol> 2. Coleção de embriões do estágio 16 <ol><li> Recolha moscas adultas e adicione 200 fêmeas e 200 machos a um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Coloque um prato de agar de suco de uva fresco em fermento no tubo de 50 mL e feche com uma esponja caP. </li><li> Incube as moscas a 16 ° C na luz por 2 a 3 dias. Mude a placa uma vez por dia. </li><li> Mova as moscas para o escuro a 25 ° C durante 1 h. </li><li> Mude a placa velha para uma nova sem fermento. Deixe as moscas colocar ovos por 2 h. </li><li> Recolher a placa e incubar a 16 ° C por 26 h. </li><li> Coletar embriões da placa com um pincel em 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Lavar embriões duas vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Para remover o corion, adicione 1,2 ml de solução de hipoclorito de sódio (2,2 - 3,4% Cl) aos embriões durante 3 min. </li><li> Lavar embriões 4 vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Coloque os embriões em placas de agarose de prato de 6 cm. Pegue os embriões do estágio 16 sob um microscópio, conforme descrito por Roberts 20 . Recolher cerca de 50 embriões em um tubo de teste de Treff de 1,5 mL com uma micropipeta. </li></ol> 3. PrepaRação de células embrionárias <ol><li> Lavar embriões duas vezes com 150 μL de PBS. </li><li> Homogeneizar embriões 30 vezes em um tubo de teste micro e microondas de 1,5 mL na presença de 200 μL de colagenase (0,25% (p / v)) em PBS. </li><li> Disperse células embrionárias por pipetagem 10 vezes e mova a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL. Incubar células a 37 ° C durante 1 min num banho de água. Repita este passo duas vezes. </li><li> Adicione 800 μL de PBS à suspensão celular e centrifugue a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remova o sobrenadante e adicione 200 μL de tripsina (0,25% (p / v)) em PBS às células. Disperse células embrionárias por pipetagem 50 vezes. </li><li> Filtra a suspensão celular com um filtro celular de 70 μm. </li><li> Para parar a actividade da tripsina, adicionar 40 μL de soro bovino fetal inactivado por calor à suspensão celular filtrada. Adicionar 800 μL de PBS e centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remova os supernatosNt, suspender células precipitadas em 200 μL de PBS e centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender as células precipitadas em 30 μL de PBS. </li><li> Monte a suspensão celular preparada em lâminas de vidro revestidas com aminopropil trietoxissilano e aguarde 10 a 15 minutos até as células serem fixadas nas lâminas de vidro. </li><li> Remova a solução restante nas lâminas de vidro com uma pipeta. Monte 60 - 70 μL de PBS contendo 4% (p / v) de PFA (paraformaldeído) em células durante 10-15 min para fixação. </li><li> Remova a solução de fixação e coloque as lâminas de vidro em PBS por mais de 1 min. </li></ol> 4. Coloração de Hemócitos <ol><li> Imunossinção com um anticorpo anti-Croquemort <ol><li> Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 minutos, em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) durante 10 minutos e depois em PBS durante 10 min. </li><li> Monte 20 μL de soro de porco inteiro a 5% (v / v) em PBS contidaNg 0,2% (v / v) Triton X-100 em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de antisoro anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células. Incubar as lâminas a 4 ° C durante a noite. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min. </li><li> Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) e soro de porco inteiro a 5% (v / v) nas células na sala Temperatura durante 1 h. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Soak lâminas de vidro em tampão contendo Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min. </li><li> Solução de substrato de fosfatase de montagem contendo 0,23 mg / mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml de nitro azul de tetrazólio (NBT), Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células. </li><li> Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos fortes aparecem nos grânulos de hemócitos, remova a solução de substrato e remova as lâminas de vidro em tampão consistindo em Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 5 a 10 min. </li></ol></li><li> Imunossinção com anticorpo anti-GFP (outra opção para a coloração de hemócitos) <ol><li> Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 min, PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min e PBS durante 10 min. </li><li> Monte 20 μL de soro de suco inteiro de 5% (v / v) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Remova a solução em lâminas de vidro e monte 20 μL do anticorpo anti-GFP de mouse (1% (v / v)) / PBS cApresentando Triton X-100 a 0,2% (v / v) nas células. Incube as lâminas à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min. </li><li> Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 e 5% (v / v) de soro inteiro de suíno em células na sala Temperatura durante 1 h. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Soak lâminas de vidro, em tampão que consiste em Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min. </li><li> Montar a solução de substrato de fosfatase contendo 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células. </li><li> Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos aparecem em hemócitos inteiros, remova a solução do substrato e remova as lâminas em tampãoDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 10 a 15 min. </li></ol></li></ol> 5. Mancha de células apoptóticas por TUNEL <ol><li> Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min. </li><li> Repita com o novo PBS. </li><li> Mount Equilibration buffer (Ver Tabela de Materiais) em células durante 10 min. </li><li> Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de solução de TdT contendo 5 μL de desoxinucleotidil transferase terminal e 15 μL de Tampão de Reação em células a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Remova a solução das lâminas de vidro e remova as lâminas em tampão, que consiste em 0,5 mL de STOP / tampão de lavagem e 17 mL de água. </li><li> Empurre as lâminas em PBS por 5 min 3 vezes. </li><li> Monte 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidase em células à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min 4 vezes. </li><li> Embeber lâminas de vidro na solução de substrato de peroxidase consistindo em 30 mL de Tris-HCl 50 mM, contendo pH7,5E uma micro-espátula completa de tetra-hidrocloreto de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e 0,2% (v / v) de H 2 O 2 durante 30 s. </li><li> Repita o passo 5.9 até que as células apoptóticas sejam manchadas em marrom. Empurre as lâminas de vidro em água para parar a reação da peroxidase. </li><li> Anexe células com água para observação. </li></ol> 6. Medir o nível de fagocitose das células apoptóticas <ol><li> Observe amostras sob um microscópio de luz para avaliar o nível de fagocitose. Contagem de células positivas de Croquemort ou células GFP-positivas como hemócitos, células TUNEL-positivas como células apoptóticas e células positivas duplas como hemocitopes fagocitantes. </li><li> O índice fagocítico é definido como o número de células duplas positivas para o número total de células positivas para Croquemort ou células GFP positivas. Recomenda-se que mais de 300 hemócitos sejam observados. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando embriões de Drosophila . Ao usar células embrionárias dispersas para medir a fagocitose quantitativamente, os hemócitos, os fagócitos profissionais de Drosophila , são imunossincionados para o marcador de hemicíticos Croquemort ou GFP dirigido por srpHemo , e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL neste protocolo. O nível de fagocitose é expresso como um índice fagocítico contando o número total de hemócitos e hemocitos fagocitante...

Em animais metazoários, por exemplo , o nematóide Caenorhabditis elegans , a mosca da fruta Drosophila melanogaster e os camundongos e os seres humanos, um grande número de células sofre apoptose durante o desenvolvimento para moldar seus corpos e na idade adulta para manter a homeostase 1 , 2 . As células apoptóticas precisam ser rapidamente removidas porque induzem inflamação nos tecidos circundantes, liberando materiais intracelulares imunogênicos, se não forem completamente removidos 3 . A fim de facilitar a remoção rápida, as células apoptóticas apresentam os chamados sinais de comer-me que são reconhecidos pelos receptores de engulfment de fagócitos e são eliminados por fagocitose 3 , 4 , 5 , 6 . Assim, a fagocitose desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do hospedeiro e, portanto, elucidando a molécula<html> Os mecanismos subjacentes à fagocitose das células apoptóticas são importantes. Os mecanismos responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas parecem ser conservados evolutivamente entre as espécies nos nematóides, moscas e camundongos 7 . Vários ensaios de fagocitose estão atualmente disponíveis para avaliar a absorção de células apoptóticas nestes animais modelo. Em C. elegans , 131 células somáticas sofrem morte celular programada durante o desenvolvimento, e cadáveres celulares são fagocitadas por células vizinhas, que são fagócitos não profissionais 8 . Assim, contar o número de cadáveres de células restantes em C. elegans indica o nível de fagocitose in vivo . Ao procurar por mutantes de nematóides que mostram um número aumentado de células mortas, vários genes necessários para a fagocitose foram identificados e caracterizados geneticamente 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Os ensaios de fagocitose ex vivo com fagócitos de cultura primária, geralmente macrófagos, são frequentemente utilizados em camundongos. As células apoptóticas são preparadas usando linhas celulares tais como células Jurkat e são misturadas com fagócitos primários. Após uma incubação por várias horas, o número total de fagócitos e fagócitos envolventes são contados para avaliar o nível de fagocitose. Como uma modificação sofisticada deste método, o grupo de Nagata desenvolveu um teste de fagocitose ex vivo com células que expressam um ICAD resistente a caspases (inibidor da DNase ativada por caspase), em que as células apoptóticas não sofrem fragmentação do DNA apoptótico, mas o DNA ainda é escorado quando As células são fagocitadas. Quando estas células são utilizadas como alvos apoptóticos num ensaio de fagocitose, apenas o ADN de células apoptóticas engolidas é fragmentado e corado por marcação de endereçamento DUTP mediada por TdT (TUNEL). Portanto, o leveL de engolimento de células apoptóticas é medido contando sinais de TUNEL em uma mistura de fagócitos e células apoptóticas 13 . Em D. melanogaster , fagócitos profissionais denominados hemócitos, macrófagos de Drosophila , são responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas 14 , 15 . Além dos ensaios de fagocitose in vitro com linhas celulares de cultura, estão disponíveis ensaios de fagocitose in vivo com embriões de Drosophila inteiros. Os embriões de Drosophila são uma poderosa ferramenta para examinar o nível de absorção de células apoptóticas porque muitas células sofrem apoptose e são fagocitadas por hemócitos durante o desenvolvimento embrionário 14 , 15 , 16 . Um exemplo de um teste de fagocitose in vivo é o método desenvolvido pelo grupo de Franc. No seu método, os hemócitos são deProtegido pela imunocoloração da peroxidasina, um marcador hemicítico, as células apoptóticas são coradas usando o corante nuclear, a 7-amino-actinomicina D em embriões de Drosophila inteiros, e o número de células positivas duplas é contado como um sinal de fagocitose 17 . Outro exemplo de um teste de fagocitose em embriões baseia-se no conceito do método de Nagata descrito acima; No entanto, a fagocitose in vivo é avaliada utilizando os embriões de DNC ( Drosophila caspase-activada DNase) moscas mutantes 18 , 19 . Estes ensaios de fagocitose in vivo são úteis para observar diretamente a fagocitose in situ . Contudo, as dificuldades estão associadas à exclusão de qualquer possível viés na etapa de contagem de células fagocitantes porque é difícil observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros devido à sua espessura. Para superar essa limitação, desenvolvemosUm novo teste de fagocitose em embriões de Drosophila . Em nosso método, para conter facilmente os hemocitros fagocitantes, os embriões integrais são homogeneizados para preparar células embrionárias dispersas. Os fagócitos são detectados pela imunocoloração de um marcador de fagócitos e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL com estas células embrionárias dispersas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro que quantificasse precisamente o nível de fagocitose. Todos os genótipos de moscas podem ser empregados neste ensaio se desenvolverem o estágio 16 de embriões 20 , o estágio de desenvolvimento no qual a depuração celular apoptótica por fagocitose é a mais abundante. Este método tem a vantagem de avaliar quantitativamente o nível de fagocitose e, portanto, pode contribuir para a identificação de novas moléculas envolvidas na fagocitose de células apoptóticas in vivo .

<table><tbody><tr><td>soro de suínos inteiros</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>Para bloking</td></tr><tr><td>Treff micro tubo de ensaio (fácil ajuste)&nbsp; Dnase, tubo livre de Rnase, 1,5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>Para homogeneização</td></tr> de <tr><td>misturador de pellets 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>Para homogeneização</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>Para preparação de células embrionárias</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>Para preparação de células embrionárias</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>anticorpo secundário para coloração hemócitos com um anticorpo</td></tr> <tr><td>anti-Croquemort5-bromo-4-cloro- 3-indolil-fosfato</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, Para coloração de hemócitos</td></tr><tr><td>nitro azul de tetrazólio</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, Para coloração de hemócitos</td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td> anti-Croquemort <td>descrito anteriormente em Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-GFP de camundongos IgG1&kappa; (clones 7.1 e 13.1)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>Para coloração de hemócitos</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugado</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>anticorpo secundário para coloração de hemócitos com um anticorpo anti-Croquemort</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase Kit de detecção de apoptose in situ</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>Para coloração de células apoptóticas. Este kit inclui tampão de equilíbrio, tampão de reação, tampão STOP/Wash, enzima TdT e anti-digoxigenina-peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina tetrahidricloreto</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, Para coloração de células apoptóticas</td></tr><tr><td>Tabela de Linhagens de Moscas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Centro de estoque</td><td>ID do estoque</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>Moscas de controle, descritas em Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&Delta; Mutante 5</td><td></td><td></td><td>drpr, descrito em Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn2</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutante, descrito em Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>descrito em Br&uuml; ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td> 4833-UAS-Itgbn-IR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

ensaio de fagocitose para células apoptóticas em drosophila embriões

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Os mecanismos moleculares subjacentes à fagocitose das células apoptóticas precisam ser esclarecidos com mais detalhes devido ao seu papel nas doenças imunes e inflamatórias intratáveis. Aqui desenvolvemos um método experimental para investigar a fagocitose quantitativamente usando a Drosophila da mosca da fruta, na qual a rede de genes que controla as reações de engulfment é conservada evolutivamente de mamíferos. A fim de detectar com precisão e contar fagócitos envolventes e não envolventes utilizando animais inteiros, os embriões de Drosophila foram homogeneizados para obter células dispersas, incluindo fagócitos e células apoptóticas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro em que seja possível observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros e quantificar com precisão o nível de fagocitose. Confirmamos que este método reproduz os de estudos préviosQue identificou os genes necessários para a fagocitose das células apoptóticas. Este método permite analisar a absorção de células mortas e, quando combinado com a poderosa genética da Drosophila , revelará as complexas reações fagocíticas que compõem a migração, reconhecimento, engolfamento e degradação de células apoptóticas por fagócitos.

Para examinar a fagocitose das células apoptóticas, os embriões de Drosophila do estádio de desenvolvimento 16 foram coletados e preparados como células dispersas. Hemocitus, macrófagos de Drosophila , foram corados por imunocitoquímica para o marcador de hemicíticos "Croquemort" 17 , 22 usando um anticorpo específico 19 , 21 e as células apoptóticas for...

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a fagocitose in vivo em Drosophila para avaliar o envolvimento de genes específicos de interesse no engolfamento celular apoptótico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e da biologia do desenvolvimento sobre os mecanismos envolvidos no engolfamento celular apoptótico. A principal vantagem desta técnica é que as células podem ser usadas com facilidade e precisão medidos in vivo níveis de fagocitose.A implicação desta técnica se estende para a terapia de distúrbios inflamatórios e doenças autoimunes, pois a célula apoptótica por fagocitose é necessária para remover células perigosas que causam inflamação. Comece adicionando 200 moscas-das-frutas fêmeas adultas e 200 machos adultos e um prato de ágar suco de uva fresco com fermento em um tubo cônico de 50 mililitros. Feche o tubo com uma tampa de esponja e incube as moscas na luz a 16 graus Celsius por dois a três dias.No final da incubação, mova as moscas para 25 graus Celsius no escuro por uma hora e substitua a placa antiga por uma nova sem fermento. Deixe as moscas botarem ovos por duas horas. Em seguida, incube a placa a 16 graus Celsius por 26

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias homogeneizadas de Drosophila melanogaster. Este método fornece informações sobre a fisiologia celular, determinando a extensão do engolfamento celular apoptótico.

O ensaio de fagocitose: uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias de Drosophila melanogaster

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo projetado para medir a fagocitose bacteriana em moscas Drosophila adultas. Após a injeção de bactérias marcadas com fluorescência no abdômen de moscas adultas, os hemócitos associados ao vaso dorsal se envolvem em fagocitose. A introdução do corante azul de tripano serve para extinguir a fluorescência emitida por bactérias extracelulares não fagocitadas. Este processo de têmpera melhora a identificação de bactérias fagocitadas quando observadas sob um...

Um ensaio in vivo para quantificar a fagocitose bacteriana em moscas Drosophila adultas

Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células...

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Aprenda a medir fagocitose in vivo em embriões de Drosophila para avaliar genes envolvidos na eliminação de células apoptóticas. Este método auxilia pesquisadores em imunologia e biologia do desenvolvimento.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

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