Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

O objetivo geral deste procedimento é medir a fagocitose in vivo em Drosophila para avaliar o envolvimento de genes específicos de interesse no engolfamento celular apoptótico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e da biologia do desenvolvimento sobre os mecanismos envolvidos no engolfamento celular apoptótico. A principal vantagem desta técnica é que as células podem ser usadas com facilidade e precisão medidos in vivo níveis de fagocitose.

A implicação desta técnica se estende para a terapia de distúrbios inflamatórios e doenças autoimunes, pois a célula apoptótica por fagocitose é necessária para remover células perigosas que causam inflamação. Comece adicionando 200 moscas-das-frutas fêmeas adultas e 200 machos adultos e um prato de ágar suco de uva fresco com fermento em um tubo cônico de 50 mililitros. Feche o tubo com uma tampa de esponja e incube as moscas na luz a 16 graus Celsius por dois a três dias.

No final da incubação, mova as moscas para 25 graus Celsius no escuro por uma hora e substitua a placa antiga por uma nova sem fermento. Deixe as moscas botarem ovos por duas horas. Em seguida, incube a placa a 16 graus Celsius por 26 horas.

No dia seguinte, use um pincel para transferir os embriões para um mililitro de PBS suplementado com 0,2% de Triton X-100. Após duas lavagens, adicione 1,2 mililitros de solução de hipoclorito de sódio aos embriões para remover o córion. Após três minutos, lave os embriões quatro vezes em PBS fresco mais Triton X-100.

Transfira os embriões lavados para uma placa de agarose de seis centímetros e coloque a placa sob um microscópio de dissecação. Identifique os embriões do estágio 16 usando uma micro ponta. Use uma micropipeta para transferir aproximadamente 50 dos embriões do estágio 16 para um microtubo de ensaio de 1,5 mililitro.

Para isolar as células embrionárias, primeiro lave os embriões duas vezes com 150 microlitros de PBS. Transfira os embriões para um novo microtubo de ensaio de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de colagenase e homogeneize os embriões 30 vezes com um misturador de pellets.

No final da homogeneização, triturar as células embrionárias 10 vezes e transferir a suspensão celular para um novo tubo de 1,5 mililitro. Incube as células a 37 graus Celsius por um minuto. Em seguida, triture as células mais 10 vezes e devolva-as à incubadora de 37 graus Celsius por mais um minuto.

No final da segunda incubação, adicione 800 microlitros de PBS às células e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tripsina antes de filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons. Pare a atividade enzimática com 40 microlitros de soro fetal bovino inativado pelo calor em 800 microlitros de PBS e colete as células por centrifugação.

Ressuspender as células precipitadas em 200 microlitros de PBS fresco e recolher as células com outra centrifugação. Ressuspenda o pellet em 30 microlitros de PBS e monte as células em uma lâmina de vidro revestida com aminopropiltrietoxissilano. Quando as células estiverem conectadas, use uma pipeta para remover o excesso de PBS da lâmina e fixe as células com 60 a 70 microlitros de paraformaldeído a 4%.

Após 10 a 15 minutos, remova o fixador e lave as células em PBS por um minuto. Para imunocorar as células com anticorpo anti-Croquemort, primeiro mergulhe a lâmina em metanol e, em seguida, PBS suplementado com 0,2% de Triton X-100 seguido de PBS sozinho. Em seguida, bloqueie a ligação inespecífica com 20 microlitros de soro suíno 5% inteiro em PBS mais 0,2% Triton X-100 por 20 minutos em temperatura ambiente.

Remova o excesso de solução de bloqueio e rotule as células com 20 microlitros de anti-soro anti-Croquemort a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave a lâmina em PBS mais Triton X-100 por cinco incubações de 10 minutos. Após a última lavagem, enxágue a lâmina em PBS por 10 minutos.

Em seguida, rotule as células com 20 microlitros de IgG anti-rato marcada com fosfatase alcalina em temperatura ambiente por uma hora. No final da incubação, lave a lâmina cinco vezes em PBS mais Triton X-100, conforme demonstrado, seguido de uma imersão de 10 minutos em solução tampão. Em seguida, rotule as células com solução de substrato de fosfatase e observe as células sob um microscópio óptico.

Quando fortes sinais roxos aparecerem nos grânulos de hemócitos, remova o excesso de substrato e mergulhe a lâmina em tampão suplementado com EDTA por cinco a 10 minutos. No final da incubação, enxágue as células com duas lavagens de PBS de cinco minutos e trate-as com tampão de equilíbrio por 10 minutos. Depois de remover a solução, rotule as células com 20 microlitros de solução terminal de desoxinucleotidil transferase a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, remova a solução da lâmina e mergulhe as células em 0,5 mililitros de tampão de lavagem em 17 mililitros de água por 10 minutos. Em seguida, enxágue as células com três lavagens de PBS de cinco minutos e rotule-as com 20 microlitros de anti-digoxigenina peroxidase por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células quatro vezes em PBS, conforme demonstrado, e mergulhe a lâmina em substrato de peroxidase por incrementos de 30 segundos até que as células apoptóticas fiquem marrons.

Quando uma coloração ideal for alcançada, mergulhe a lâmina em água para interromper a reação da peroxidase. Nessas imagens, macrófagos de Drosophila chamados hemócitos foram corados para o marcador de hemócitos Croquemort e para a presença de células apoptóticas fagocitadas por TUNEL em células embrionárias dispersas, como acabamos de demonstrar. As células positivas para Croquemort exibem sinais roxos nos pequenos grânulos de suas células, enquanto as células positivas para TUNEL demonstraram sinal marrom em todos os seus corpos.

Alternativamente, os hemócitos podem ser corados com um anticorpo anti-GFP que cora todo o hemócito em vez de apenas os grânulos. Neste experimento, foi analisada a proporção de hemócitos fagocitantes para hemócitos totais em embriões selvagens ou mutantes únicos, demonstrando que o índice fagocítico foi menor em ambas as cepas mutantes únicas do que em moscas selvagens, enquanto o número total de hemócitos e células apoptóticas foi semelhante, indicando a necessidade dos genes mutados para o engolfamento celular apoptótico. O knockdown de RNAi de genes únicos também reduz o índice fagocítico, enquanto o número total de hemócitos e células apoptóticas permaneceu comparável, ressaltando ainda mais o envolvimento dos receptores de fagocitose investigados na fagocitose mediada por células apoptóticas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de 15 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar o excesso de marcador de hemócitos e coloração TUNEL para uma avaliação ideal da capacidade fagocitótica das células. Após este procedimento, o ensaio de fagocitose in situ de todos os embriões de Drosophila pode ser realizado para responder a perguntas adicionais sobre o local de engolfamento ou a distribuição dos hemócitos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem os mecanismos de engolfamento celular apoptótico em Drosophila. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a fagocitose in vivo em embriões de Drosophila.