Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o uso da microscopia de segunda geração harmônica para visualizar e medir o efeito de reticulação do colágeno no tecido escleral, induzido pela injeção subtenon de agente liberador de formaldeído e confirmado com calorimetria exploratória diferencial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da reticulação terapêutica de tecidos, fornecendo um método não invasivo para avaliar os efeitos de reticulação induzidos. A principal vantagem dessa técnica é que os sinais gerados pelo segundo harmônico são altamente específicos para fibrilas de colagem e, como tal, nenhuma preparação especial de tecido, como coloração de anticorpos, é necessária.

Tivemos essa ideia para esse método pela primeira vez quando lemos sobre o procedimento que está sendo aplicado à reticulação terapêutica do tecido da córnea. A demonstração visual desse método é crítica, pois a microscopia de segunda geração harmônica bem-sucedida requer a colocação cuidadosa do tecido e a configuração das condições de imagem corretas para evitar danos ao tecido e artefatos na medição do sinal. Comece o tratamento com injeção de subtenon nos globos oculares do coelho, conforme descrito no protocolo de texto.

Mostre aqui uma representação esquemática do local de injeção do subtenon. Selecione um espéculo de tamanho ideal de acordo com o tamanho do olho. Após três horas e meia de incubação, retraia as pálpebras usando o espéculo palpebral para otimizar o acesso ao globo.

Separe a conjuntiva ao redor do limbo e corte os músculos oculares extras em seus locais de inserção escleral. Corte a parte superior da esclera usando uma tesoura ou uma lâmina para criar uma área de um por um centímetro com o local da injeção localizado centralmente. Raspe as camadas retinianas e coróides restantes e lave duas vezes com PBS fresco, cada vez deixando as peças em solução por aproximadamente 10 segundos.

Coloque o tecido em tubos de um mililitro preenchidos com solução de PBS para transporte para a instalação de imagem. Para maximizar o sinal e a resolução ao realizar a microscopia SHG, use uma lente objetiva otimizada para transmitir luz infravermelha e com alta abertura numérica. Ajuste o colar de correção da lente para corresponder à profundidade da amostra.

Neste caso, 0,17 milímetros. Monte a lente objetiva 25 vezes no microscópio e adicione uma quantidade generosa de gel de imersão à base de água para cobrir a superfície da lente. É importante realizar a imagem do tecido dentro de 30 minutos após a montagem da amostra no microscópio para manter o tecido hidratado e evitar o ressecamento do gel de imersão entre a objetiva da lente e a lâmina, pois isso resultaria em alterações no sinal SHG.

Monte a câmara da célula colocando uma lamínula redonda de 25 milímetros na parte inferior da câmara. Coloque o pedaço de tecido da esclera na lamínula e adicione 50 a 100 microlitros de tampão. Cubra o tecido com uma segunda lamínula redonda e aparafuse a parte superior da câmara sem pressionar ou achatar o tecido.

Em seguida, monte a câmara celular com a amostra de tecido no estágio do microscópio. Posicione o stage e ajuste a altura da objetiva de forma que a superfície inferior da amostra fique em foco, conforme determinado pela inspeção de campo claro através da ocular. Desligue todas as luzes, exceto o monitor do computador, e bloqueie o máximo de luz possível do monitor com folhas de papel alumínio colocadas no microscópio stage.

No software, desligue o modo Eye Port. No painel TI Pad, verifique se a definição da lente está correta. No painel A1 Compact Graphical User Interface, escolha o laser infravermelho para geração de imagens, selecione os Detectores não digitalizados e escolha o canal DAPI equipado com um filtro passa-banda de 400 a 450 nanômetros.

No painel A1 Multi Photon Graphical User Interface, defina o comprimento de onda do laser infravermelho para 860 nanômetros e abra o obturador. Aguarde até que o comprimento de onda de emissão seja alterado conforme indicado pela luz verde constante. Para definir as condições de escaneamento a laser no painel Interface gráfica compacta do usuário A1, selecione Scanner Galvano, escaneamento direcional de unidade, tamanho de quadro de 1024 por 1024 pixels, tempo de permanência de pixel de 6,2 microssegundos e média de linha de 2X.

Em seguida, ative a imaginação ao vivo com o modo de localização e defina as condições de imagem no painel AI Compact Graphical User Interface, ajustando a potência do laser e o ganho do detector. Defina a potência do laser entre 50 miliwatts e 150 miliwatts, ou seja, entre dois por cento e seis por cento para um laser a 860 nanômetros. Acima dessa faixa, podem ocorrer danos aos tecidos.

Abra o painel Tabela de pesquisa que exibe um histograma de valores de intensidade de pixel na imagem atual e ajuste ainda mais o ganho do detector na barra rotulada de HV para maximizar o intervalo de valores de pixel e evitar a saturação. Use a amostra com o sinal SHG mais alto para encontrar as configurações ideais de laser e ganho. Mantenha configurações idênticas para todas as amostras a serem comparadas em um experimento.

Essa prática garante que nenhuma amostra no experimento sature o detector. Para digitalizar se o tecido está no modo de visualização, abra a ferramenta de visão geral XYZ. Defina a imagem para resolução mais baixa para acelerar a aquisição de imagens neste modo.

No painel de visão geral XYZ, clique com o botão direito do mouse na posição atual e selecione digitalizar cinco por cinco, três por três ou captura de exibição única. Após a conclusão da digitalização, vá para um novo local clicando duas vezes em uma área fora da área visualizada atual. Ative o modo Live Scan e coloque o tecido em foco, pois diferentes regiões do tecido podem ter posições ligeiramente diferentes na direção axial.

Capture um novo campo de visão cinco por cinco, três por três ou único. Repita esse processo até que uma grande área do tecido tenha sido visualizada. Na ferramenta de visão geral XYZ, clique duas vezes em uma posição em que as fibras de colágeno sejam vistas em todo o campo de visão para mover o palco para esse local específico.

Defina a imagem para alta resolução, 1024 por 1024 pixels e média de linha 2X. Ative o modo Live Find, ajuste a posição da objetiva de forma que a planície inferior fique em foco e, no TI Pad, use o Z Drive para mover o plano óptico 10 micrômetros acima dessa camada inferior. Adquira uma imagem usando o botão de captura, salve o local com o botão de adição na ferramenta de revisão XYZ.

Clique duas vezes em um novo local e repita o processo de ajuste de profundidade e captura de imagem. Para cada pedaço de tecido, capture 10 imagens. Os campos de visão não devem se sobrepor, conforme mostrado pelos locais salvos na ferramenta de visão geral XYZ.

Finalmente, coloque as peças esclerais em um tubo de um mililitro com PBS imediatamente após a conclusão da microscopia em preparação para a análise de calorimetria exploratória diferencial subsequente. Para começar, corte a parte central do controle e trate a esclera com uma tesoura. Seque cada quadrado escleral com um lenço absorvente e coloque-o no fundo de uma panela DSC usando uma pinça dentada.

Com o tecido no interior e o lábio frisado e coberto, pese o prato para obter o peso húmido do tecido. Em seguida, coloque a amostra pesada em seu local designado na bandeja do amostrador automático DSC. Crie um método usando o software de gerenciamento de instrumentos, especificando o peso do tecido e execute a análise térmica usando os perímetros listados no protocolo de texto.

Depois de concluído, analise os dados de cada amostra extraindo o pico da temperatura de transição no qual ocorre a desnaturação térmica usando o software de imagem do instrumento. Imagens SHG da esclera foram analisadas em Fiji quanto ao brilho médio dos pixels. Quando uma imagem é aberta e o menu de análise é selecionado seguido de medida, uma tabela com resultados é aberta contendo o brilho médio do sinal.

Como alternativa, no menu Analisar, Histograma é selecionado para criar um histograma de valores de intensidade de pixel que contém informações sobre o brilho médio e a variação do sinal na imagem. Essa medição foi repetida para todas as imagens das amostras de controle e reticuladas. Imagens SHG representativas da esclera com análise de histograma que a acompanha, incluem brilho médio, são demonstradas aqui.

A amostra controle é caracterizada por um arranjo ondulado de fibrilas. Aqui é mostrada uma amostra reticulada com SMG 400 milimolar com intensidade de pixel aumentada, revelando fibras de colágeno que parecem mais retas. Os resultados da análise térmica mostram o pico mais alto da temperatura de desnaturação e confirmam o efeito de reticulação.

A amostra de controle e uma curva de desnaturação da amostra reticulada de 400 milimolares são mostradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma amostra reticulada e como realizar a microscopia SHG em amostras esclerais. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam com a injeção precisa no espaço subtenon, extraindo cirurgicamente o quadrado ao redor do local da injeção e definindo as condições das imagens para escanear o tecido no modo de visualização.

Após este procedimento, outros métodos, como a autoluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a análise da elastina, incluindo quantificação e morfologia. As implicações dessa técnica de entrega de agente de reticulação se estendem à terapia de alta miopia e estafiloma posterior, pois fornece acesso mais fácil ao polo posterior para fins de estabilização escleral. As implicações dessa técnica de microscopia se estendem para diagnósticos de alta miopia e complicações causadas pelo enfraquecimento do colágeno, medindo o estado de reticulação do colágeno na esclera doente ou medindo o resultado após a conclusão do procedimento de reticulação desejado.

Assim, este método de reticulação e microscopia de geração de segundo harmônico pode fornecer informações sobre a reticulação escleral, também pode ser aplicado a outros tecidos, como córnea, pele, cartilagem, tendão, válvula cardíaca e vasos sanguíneos.