Name: Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a usar microscopia de segunda harmônica para visualizar colágeno em tecido escleral de coelho após injeção sub-tenoniana de agente liberador de formaldeído. Este método não invasivo avalia o cross-linking terapêutico para miopia.

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Os autores agradecer Tongalp Tezel, MD, para consulta a respeito da injeção de sT; Theresa Swayne, PhD, para consulta sobre microscopia SHG; e Jimmy Duong desde o projeto e recurso de Bioestatística e a facilidade do núcleo Biostatistical do Instituto Irving na Columbia University Medical Center.
Suportado em parte pela pesquisa para evitar cegueira e pelos institutos nacionais de saúde subsídios NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possui propriedade intelectual relacionada: U.S. emitida patentes n: 8.466.203 e não: 9.125.856. Patente pendente internacional: PCT/US2015/020276.
Imagens foram coletadas no Confocal e especializada microscopia recurso compartilhado do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, na Universidade de Columbia, suportado pelo NIH conceder #P30 CA013696 (National Cancer Institute). O microscópio confocal foi comprado com NIH conceder #S10 RR025686.

Todos os procedimentos foram realizados usando olhos de coelho cadavérico dentro de cabeças de coelho outbred intacta. Seguiam-se todos e institucional Nacional orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. preparação de soluções
<ol><li>Preparação de SMG para TXL:<ol>
<li>Prepare-se 1 mL da concentração de 0,2 M de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) de solução usando 0,0165 g de NaHCO3 em pó dissolvido em 1 mL de água destilada.</li>
		<li>Dissolva 0,1016 mg de hidroximetilglicinato de sódio em pó (SMG) em 1 mL de água destilada para obter uma concentração final de 800 mM SMG. Ajuste a solução de bicarbonato de sódio a uma concentração final de 0,1 M NaHCO3 e 400 mM SMG. Concentrações de SMG dependendo do efeito do cross-linking desejado. O protocolo descrito aqui usamos 40, 100 e 400 mM SMG.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. injeção de subTenon para TXL usando SMG
<ol><li>Encha duas seringas de insulina 1 mL (agulhas de 25G) com 400 µ l controlo e solução SMG, respectivamente.</li>
	<li>Coloque a cabeça de coelho em um avião de perfil com a ajuda de uma almofada. Isopor ou uma pilha de papel pode ser usada para corrigir a cabeça em uma posição ideal.</li>
	<li>Retrai as pálpebras com um espéculo olho pediátrica.</li>
	<li>Medir a inicial da pressão intra-ocular (Pio) usando um dispositivo de tonometria de aplanação.</li>
	<li>Marca o local da injeção pretendido na parte central superior do limbo com um marcador de tecido.</li>
	<li>Retrair a conjuntiva em torno do local da injeção com um fórceps da conjuntiva (ou qualquer pinça com ponta redonda serrilhada) e inserir a agulha através da conjuntiva, inserir a cápsula de Tenon um pouco além do local de estroma marcado (ou seja, 2-3 mm do limbo). Uma pequena incisão na conjuntiva também pode ser feita com uma tesoura de íris para facilitar a passagem da agulha através da cápsula de Tenon.</li>
	<li>Uma vez dentro da cápsula de Tenon, certifique-se que a agulha é livremente móvel, movendo-o de lado. Durante este tempo, o globo não deve mover. Isto confirma a correcta colocação da agulha acima a esclera na submarino da-espiga (sT) espaço.</li>
	<li>Injetar a solução da seringa e descarte a agulha. Imediatamente após a injeção, o fluido irá acumular no espaço sT criando uma protuberância anterior vista através da conjuntiva (ou seja, quemose).</li>
	<li>Repita a medição IOP para confirmar que ele não mudou devido a uma perfuração inadvertida do globo.</li>
	<li>Remover o espéculo tampa e realizar a massagem digital através das pálpebras fechadas por cerca de 2-3 min.</li>
	<li>Deixe a cabeça por um período de incubação de 3,5 h (temperatura ambiente = 18 ° C), antes de se mudar para a próxima etapa.</li>
</ol>3. tecido preparação
<ol><li>Retrai as pálpebras usando o espéculo pálpebra para otimizar o acesso ao globo. Selecione o espéculo otimamente feito sob medido de acordo com o tamanho do olho.</li>
	<li>Separe a conjuntiva circundante ao limbo. Se ele já tem sido feito perto do local da injeção, circunferencialmente expanda as fronteiras para iria conter um tamanho do inóculo de aproximadamente 1 x 1 cm.</li>
	<li>Corte os músculos extra-oculares em seus locais de inserção escleral.</li>
	<li>Eleve o globo ocular com fórceps, empurrando-o do lado posterior. Isto fornece acesso ao globo posterior e facilitará o corte do nervo óptico com a artéria oftálmica e veia localizado perto do polo posterior do globo.</li>
	<li>Corte o corneoscleral complexo, com a borda externa, incluindo o local de injeção marcado. A mancha ainda deve ser visível na parte restante da esclera.</li>
	<li>Remova o corpus vitreus e todas as camadas anexadas para o lado interno da esclera, aplicando-se tração com pinça de tecido. Nota: Outras medidas dependem os procedimentos a seguir sendo executados: 4. - análise de DSC, 5. - microscopia SHG.</li>
</ol>4. para análise de DSC Regional
<ol><li>
Para o olho Tratado: cortar quatro sectores scleral da Taça scleral restante com a tesoura para que o local da injeção é localizado no setor superior e alinhado centralmente. Corte os restantes 3 setores de ambos os lados laterais (ou seja, nasal e temporal) e a parte inferior. Nota: a numeração dos sectores (1-4) que estão divididos em quadrados (1-16) é demonstrada na figura 1A.</li>
	<li>Os setores scleral (1-4) corte quadrados menores (1-16) de aproximadamente 4 x 4 mm cada. Setor 1 deveria ser dividida em 9 quadrados (fazer o local exato da injeção um quadrado individual [quadrado 2]). Divida os setores 2 e 3 em 2 quadrados cada (quadrados 10-11 e 12-13) e setor 4 em 3 quadrados (praças 14-16).</li>
	<li>Atribua um número a cada quadrado, como mostrado na figura 1A, para localizar a distância do tecido analisado do local da área injetada.</li>
	<li>
Para o olho de controle: depois dividindo o tecido em quatro sectores scleral (semelhantes do tecido Tratado) corta pedaços de tecido quadrado nos seguintes locais: 3 quadrados do setor superior (setor 1), 1 de cada lado (setores 2 e 3) e 1 a partir da setor de fundo (setor 4).</li>
	<li>Raspar as restantes camadas da retina e da coroide e lavar duas vezes com PBS fresco cada vez, deixando as peças submergidas na solução por aproximadamente 10 s de cada vez.</li>
</ol>5. para a imagem latente SHG
<ol><li>Corte a parte superior da esclera usando uma tesoura para criar uma área de 1 x 1 cm com o local da injeção, alinhado de forma centralizada.</li>
	<li>Raspar as camadas da retina e coroide restantes e lavar duas vezes com PBS fresco cada vez deixando as peças em solução para cerca de 10 s.</li>
	<li>Coloque o tecido em 1 mL tubos preenchidos com solução de PBS para o transporte para as instalações de geração de imagens. Todos os procedimentos, após o tempo de incubação e começando com a dissecação do globo ocular devem ser realizados em uma hora.</li>
</ol>6. microscopia protocolo
Nota: Este protocolo para imagem sinal SHG espalhados por volta de colágeno do tecido da esclera é adaptado para o microscópio de varredura a laser.
<ol><li>
Microscopia de configurar
	<ol>
<li>Para maximizar o sinal e resolução quando realizando microscopia SHG usa uma lente objetiva otimizam para transmitir infravermelho, luz e com uma grande abertura numérica (NA). O nosso objectivo é Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 água de imersão.</li>
		<li>Ajuste a coleira de correção de lente para coincidir com a profundidade da amostra, neste caso é a espessura da lamela, 0,17 milímetros.</li>
		<li>Montagem da lente da objetiva 25 x e adicione uma generosa quantidade de gel à base de água para cobrir a superfície de imagem antes de montar a amostra de lubrificante. O gel à base de água não se evapore durante o experimento e, consequentemente, manterá a qualidade de imagem.</li>
		<li>Coloque o tecido scleral de um tubo de 1 mL com PBS sem secagem entre duas lamelas redondo de 25 mm (episcleral lado para baixo) fornecendo máximo contato a episclera e a superfície da lamela. Nota: O tecido pode também ser colocado descoberto na lamela. Uma boa quantidade de PBS deve manter o tecido hidratado durante a imagem latente. Neste caso, adicione o pedaço de tecido e a PBS depois de montar o cellchamber.</li>
		<li>Montar a câmara do telemóvel, colocando uma lamela redonda 25 mm, única ou em uma técnica de sanduíche, na parte inferior da câmara e de rosca na parte superior a fim de criar uma selada assembleia. Não aperte para baixo firmemente quando uma lamela superior é utilizada, a fim de evitar artificialmente achatamento e danificar o tecido.</li>
		<li>Montagem da câmara de celular com a amostra de tecido no palco microscópio.</li>
		<li>Ateou o microscópio para visão com luz transmitida.</li>
		<li>Posicione o palco e ajustar a altura do objectivo, tal que a superfície inferior da amostra está em foco, conforme determinado pela inspeção de campo brilhante através da peça de olho.</li>
		<li>Desligue todas as luzes, exceto o monitor do computador e bloquear a luminosidade do monitor quanto possível com folhas de alumínio da folha drapejadas no palco microscópio. Minimizar qualquer luz atingindo os detectores garantirá aquisição de baixo ruído, como detectores de GaAsP NDD tem alta sensibilidade.</li>
		<li>No painel de Ti Pad do software, verifique se a definição de lente é correta.</li>
		<li>No painel de GUI compacto A1, escolher o laser IR para a imagem latente, selecione os detectores NDD e escolher o canal DAPI que está equipado com um filtro de passa-banda 400-450 nm.</li>
		<li>No painel A1 MP GUI, defina o comprimento de onda do laser infravermelho para 860 nm e abrir o obturador.</li>
		<li>Definir as seguintes condições no painel A1 compacto GUI de exploração do laser. Selecione: (a) Galvano scanner, digitalização (b) unidirecional, (c) Pixel Habitai tempo 6.2 µs, (d) quadro tamanho 1.024 x 1.024 pixels, (e) linha em média 2 x Nota: O scanner de Galvano e varredura unidirecional assegura alinhamento preciso ponto por ponto. Um tamanho de 1.024 x 1.024 para o completo campo de visão se traduz em um tamanho de pixel de 0,5 μm /pixel. Linha média irá reduzir o barulho de tiro na imagem.</li>
		<li>Conjunto de imagens condições no painel A1 compacto GUI ajustando o ganho de potência e detector de laser. Abra o painel de olhar acima tabela (LUTs) que exibe um histograma de valores de intensidade do pixel na imagem atual. Ligue a imagem ao vivo no modo "Encontrar" e maximizar detectados valores no intervalo de pixel, ajustando o ganho de potência e detector de laser. Evite a saturação. Valores típicos são o poder do laser de 2,5%, de um total de 2,35 W em 860 nm e 100 HV (ganho de detector).</li>
		<li>Nota: Para esta configuração, a potência do laser, medida com um medidor de energia interna é 5.2 mW. Cada vez que um experimento é realizado, re-ajustar a porcentagem de laser tal que a medição de energia interna é constante em 5.2 mW entre as sessões de imagem. Tenha cuidado ao definir a potência do laser. O camaleão II laser é um laser W 3 a 800 nm e um 10% ou um poder superior poderia potencialmente induzir dano tecidual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aquisição de imagem
	<ol>
<li>No modo de visualização, a área de tecido usando a ferramenta XYZ visão de digitalização.</li>
		<li>Defina a imagem de baixa resolução (256 x 256 pixels e nenhuma linha média) para acelerar a aquisição de imagens neste modo.</li>
		<li>Captura de 5 x 5, 3 x 3 ou simples campos de visão para cobrir toda a superfície do tecido. Em cada local, antes da captura de visão geral, ligue o modo "Scan" ao vivo e colocar o tecido em foco. Note que diferentes regiões do tecido terão posições ligeiramente diferentes na direção axial.</li>
		<li>Encontre uma área plana onde as fibras de colágeno são vistas em todo campo de visão e clique duas vezes nessa posição na ferramenta para mover o palco para esse determinado local de visão geral.</li>
		<li>Ativar o modo de "Scan" ao vivo, ajustar a posição de Z do objectivo, tal que o plano de fundo está em foco e, no painel de Ti, usar a unidade Z para mover o plano ótico de 10 a 15 μm acima desta camada de fundo.</li>
		<li>Adquira uma imagem em alta resolução com 1.024 x 1.024 pixels e 2 linha de x, em média, usando o botão "Capture".</li>
		<li>Salve a localização na visão geral XYZ usando o botão "+". Isso garante que a mesma área de tecido não é recapturada.</li>
		<li>Para cada pedaço de tecido capture 10 imagens de disjunto campos de visão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. DSC protocolo
Nota: Efectuar este passo como preparação do tecido é completa, para análise de DSC regional, ou depois de tecido de imagem quando SHGM é executada.
<ol><li>Prepare bandejas de DSC, pesava e rotulado. Nota: Este passo deve ser feito antes de dissecção de tecidos para minimizar a dessecação do tecido.</li>
	<li>Secar cada quadrado scleral com um tecido absorvente e coloque-o sobre o fundo de uma panela de DSC usando fórceps dentado.</li>
	<li>Pesar na panela com o tecido no interior e a tampa frisado e coberto obter o tecido molhado peso (a massa das amostras deve ser na faixa de 5 a 11 mg). Nota: O selo cada pan usando o frisador antes de prosseguir para a próxima amostra de tecido. As panelas são hermeticamente fechadas, evitando qualquer perda de água antes da análise térmica.</li>
	<li>Uma vez que a amostra é frisada, coloque-o na sua localização designada na bandeja do DSC. Deve haver pelo menos 6 amostras para o controle e 16 para o olho Tratado.</li>
	<li>Criar um método usando o instrumento gestão software, especificando o peso do tecido, e executar a análise térmica usando os seguintes parâmetros: temperatura na faixa de 40 a 80 ° C, taxa de aquecimento: 1 ° C/min, fluxo de calor: 17,37 mW, fluxo de gás (N2): 19,8 mL/min, Pressão de gás: 2,2 bar.</li>
	<li>Depois de concluído, analise os dados para cada amostra, extraindo o pico de temperatura de transição no qual desnaturação térmica ocorre usando o instrumento de gerenciamento de software.</li>
</ol>8. análise de imagens
<ol><li>
Sinal SHG
	<ol>
<li>Selecione pelo menos 5-10 das imagens mais representativas de cada tratamento e seu controle, tal que a área da imagem é ocupada por principalmente fibras de colágeno.</li>
		<li>Upload de cada imagem no software ImageJ e medir a intensidade do pixel média selecionando Analyze > medida para a imagem ativa.</li>
		<li>Os valores extraídos são relatados como a intensidade média de pixel e também podem ser mostrados plotando o histograma das intensidades, selecionando no menu Analyze > histograma.</li>
		<li>Usando uma folha de Excel, criar uma tabela para documentar todos os dados medidos em conformidade para a identificação de amostra.</li>
		<li>Calcule a média e o desvio padrão de intensidade de pixel para cada condição de tratamento e controle.</li>
		<li>Usando o student t-teste, comparar as diferenças para todas as comparações emparelhadas das concentrações (isto é, 40 mM SMG vs 0 a 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ondulação
	<ol>
<li>Selecione uma imagem que exibe fibras de colágeno. Pelo menos 10 imagens por amostra devem ser analisadas (incluindo uma amostra de controle para cada concentração - pelo menos 40 no total).</li>
		<li>Aberto ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ requer a instalação prévia.</li>
		<li>Upload de todos os imagesby arrastar uma janela aberta de NeuronJ .</li>
		<li>Criar linhas de rastreamento ao longo das fibras, ao longo do contorno da fibrila com o mouse (caneta comprimidos de desenho pode ser usada), clique em M para medir a distância do comprimento total da fibra.</li>
		<li>Selecione a "Opção" para desenhar uma linha reta tangente e conectar o começo e o fim do contorno fibra anteriormente desenhado. Agora clique em M para medir o comprimento de ponta a ponta.</li>
		<li>Repita o mesmo procedimento pelo menos 10 fibrilas por imagem.</li>
		<li>Coletar essas duas medições de cada um dos 10 fibrilas e os dados de entrada em uma planilha do excel, expressando o comprimento total da fibra (contorno) e comprimento de ponta a ponta (linha de conexão em linha reta) como comprimento [curva] e [linear], respectivamente.</li>
		<li>Calcular o índice de ondulação (W) usando a fórmula: W = comprimento [curva] / [linear] de comprimento.</li>
		<li>Calcular a % de ondulação comparando dados de imagens de samples(SMG) tratados com as imagens das amostras de controle, usando a fórmula: (W [SMG] - 1) / (W [control] - 1)</li>
		<li>Realize um teste-t emparelhado para índice de ondulação (W) para determinar diferenças estatísticas (p-valores) da morfologia das fibras de colágeno entre condições diferentes de tratamento e controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Experimentos realizados mostraram evidências que sustentam o uso da microscopia de sinal SHG como um método para avaliação de efeitos na esclera, levantando a possibilidade futura de utilizar esta técnica como uma ferramenta de monitoramento para cross-linking tratamentos do cross-linking de colágeno que destino proteínas de colágeno. De nota, um instrumento já está em uso clínico que potencialmente pode capturar este sinal SHG. Embora este instrumento foi projetado principalmente para imagiologia derme humana de pele, e...

Miopia progressiva é postulada para ser tratável através de não enzimáticos scleral cross-linking (fotoquímicos e/ou química), que faz sentido, dado que o bloqueio do cross-linking enzimática colágeno pode aumentar a privação de forma experimental (FD)-induzido miopia,1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discutido a viabilidade e o potencial do uso padrão irradiação ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica do cross-linking (também conhecido como o protocolo de Dresden), abreviado aqui como (riboflavina CXL) para estabilização posterior scleral travar o alongamento axial na miopia. Esse método fotoquímico utilizou com sucesso no tratamento de desestabilização da superfície do globo anterior (ou seja, a córnea abaulamento) vista em keratectasia do keratoconus e do borne-LASIK. No entanto, aplicação do presente protocolo CXL para a esclera é dificultada por questões relacionadas com dificuldades em acessar a esclera posterior com uma fonte de luz ultravioleta (UV), bem como a necessidade de modificar uma muito maior tecido área de superfície. Que sendo dito, a abordagem CXL tem sido usada para travar o alongamento axial na forma visualmente privado coelhos (por tarsorrhaphy), apesar de várias regiões da esclera posterior necessário várias zonas distintas de irradiação em que estudo3. Por outro lado, a injeção de um agente estabilizador químico (ou seja, agente do cross-linking) através do espaço de sT poderia representar uma forma mais simples para modificar a esclera posterior, evitando a necessidade de introdução de uma fonte de luz UV. Esta técnica de injeção é conhecida como uma maneira útil de induzir anestesia ocular durante procedimentos oftalmológicos, como cirurgia de catarata a4,5,6. Wollensak7 tem descrito anteriormente, o uso de uma injeção de sT usando gliceraldeído (cross-linking agente químico similar em conceito para o formaldeído liberando agentes (FARs) descritos neste estudo) endurecer a esclera coelho e Genipina tem foram mostrados para limitar o comprimento axial em FD cobaias8,9. Estes investigadores demonstraram uma clara vantagem de usar um agente químico solúvel sobre a técnica CXL fotoquímica. Assim, scleral cross-linking usando um agente químico injetável de algum tipo, incluindo FARs (i.e., TXL)10, poderia fornecer um método de tratamento viável para deter a progressão do alongamento scleral visto na miopia.
Os protocolos aqui apresentados, usamos uma solução química do cross-linking de hidroximetilglicinato de sódio (SMG), entregada através da injeção de sT para a esclera dos olhos de coelho cadavérico. Temos implementado protocolos semelhantes anteriormente para reticulação química tópica na córnea. Nomeadamente os estudos anteriormente relatados, concentração dependente do cross-linking efeitos pode ser obtida usando SMG, com uma gama de efeito bem acima de abrangência realizáveis com fotoquímico CXL, conforme determinado pela análise de desnaturação térmica11 .
Aqui descrevemos os protocolos para avaliar o efeito do cross-linking de SMG entregada via sT injeções ao tecido scleral, desnaturação térmica utilizando Calorimetria Diferencial de varredura (DSC) e a segunda harmônica geração microscopia (SHGM).
Utilizando Calorimetria exploratória diferencial (DSC), também conhecido como análise térmica, uma transição de desnaturação térmica é medida, que para tecido scleral é predominantemente guiado pelas propriedades dos colagénios fibrillar, desde que eles constituem a maioria em massa da proteína. Este método avalia a estabilidade da estrutura molecular do colágeno e os laços reticulados que estabilizar as fibrilhas de colagénio, a estrutura principal proteína terciária. Durante o aquecimento no DSC, uma temperatura crítica de transição é alcançada que resulta na desnaturação da molécula de colágeno, resultando no desenrolar da tripla hélice, um processo que forma o que é comumente conhecido como gelatina. Esta desnaturação térmica rompe ligações de hidrogênio ao longo da molécula de colágeno e pode ser deslocada para temperaturas mais altas através de métodos do cross-linking induzido12,13. Este método tem sido usado por muitas décadas, particularmente na indústria de biomateriais e para processos que incluem a fabricação de couro. No entanto, este método requer a extração do tecido esclera e, portanto, só pode ser útil como uma técnica ex vivo .
Microscopia de harmônica de segunda geração (SHGM) baseia-se as propriedades ópticas não-lineares de materiais específicos, com ambientes molecular não-centrossimétricas. Em tais materiais, luz intensa, por exemplo luz produzida por lasers, gera sinais SHG, no qual a luz incidente é duplicada em frequência. Materiais biológicos que são conhecidos para criar sinais SHG são microtúbulos, colágeno e miosina do músculo. Por exemplo, colágeno animado com uma luz infravermelha do comprimento de onda de 860 nm irá emitir um sinal SHG na faixa visível com comprimento de onda de 430 nm. Segunda geração de harmônica (SHG) imagem de sinal é um método promissor para avaliar terapêutico colágeno cross-linking. Tem sido conhecido há mais de 30 anos que fibrilhas de colagénio nos tecidos emitem SHG sinais14. No entanto, só recentemente podem imagens de alta resolução ser obtidas15 em uma variedade de tecidos, incluindo o tendão16, pele, cartilagem17, vasos sanguíneos,18e em gel de colágeno19.
Baseado neste conhecimento, este estudo avalia as alterações de sinal SHG induzidas na esclera através de SMG quimicamente induzida do cross-linking de colágeno. Os resultados indicam que a modificação de SMG da esclera aumenta os sinais SHG produzidos a partir de feixes de fibras de colágeno tecido (a maior ordem quaternária estrutura composta de fibrilas de colágeno) e também produz uma mudança estrutural morfológica em colágeno rede de fibra, refletida na fibra bundle "endireitar".

<table><tbody><tr><td>MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, EUA</td><td></td><td>Água destilada duplamente, deionizada. - passo do protocolo 1.1.1</td></tr><tr><td>Hidroximetilglicinato de sódio&nbsp;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, EUA</td><td></td><td>Reagente de reticulação - passo de protocolo 1.1.2</td></tr><tr><td>Agulha de injeção com seringa luer-lock</td><td>BD Eclipse, NJ, EUA</td><td></td><td>Seringa para injeção de sub-tenon. - passo de protocolo 2.1</td></tr><tr><td>Cabeça de coelho</td><td>Aves de capoeira La Granja</td><td>Cabeça de coelho de raça cruzada</td><td>separada e entregue dentro de 1 hora após a morte. - passo de protocolo 2.2</td></tr><tr><td>Tono-pen&nbsp;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>Medições IOP - passo de protocolo 2.4</td></tr><tr><td>DSC 6000 Autosampler</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, EUA</td><td></td><td>Analisador de desnaturação térmica - passo de protocolo 7.4</td></tr><tr><td>Software Pyris&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA</td><td>Ver 11.0</td><td>&nbsp; etapa de protocolo 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 Apocromático LWD 25X/1.10 W MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, EUA</td><td></td><td>Uma objetiva de imersão em água com alta transmitância de IR com uma distância de trabalho de 2.0 mm - etapa de protocolo 8.1.1.</td></tr><tr><td>GenTeal&nbsp;</td><td>Alcon, Fort Worth, TX&nbsp;</td><td>B000URVDQ8</td><td>Gel à base de água usado como meio de imersão objetiva em vez de água para evitar a evaporação - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&nbsp;</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Ti:Laser pulsado de safira com uma largura de pulso de 140 fs a 80 MHz e uma faixa sintonizável de 680 nm a 1080 nm. - etapa do protocolo 8.1.11</td></tr><tr><td>Câmara celular AttoFluor</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>Fixação da lamínula - etapa do protocolo 8.1.3</td></tr><tr><td>lamínulas redondas de 25 mm, #1.5</td><td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, EUA</td><td>GG-25-1.5</td><td>passo 8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, EUA</td><td></td><td>passo 8.1.4 protocolo.</td></tr><tr><td>Detector GaAsP não digitalizado (NDD)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, EUA</td><td></td><td>Equipado com um filtro passa-banda de 400-450 nm - etapa do protocolo 8.1.7</td></tr><tr><td>Sistema de varredura a laser A1R-MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, EUA</td><td></td><td>Compatível com excitação multifóton infravermelha (IR). - etapa do protocolo 8.1.8</td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, EUA</td><td>Ver 4.3</td><td>referido como "software" no texto - etapa do protocolo 8.1.9</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>&nbsp; etapa de protocolo 9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Roterdã, Holanda</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, para a etapa de protocolo 9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA</td><td>Etapa 9.2.8 do protocolo</td> <td>Ver 14</td></tr></tbody></table>

segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (txl) para miopia

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Métodos para fortalecer o tecido com a introdução de ligações químicas (não enzimáticos do cross-linking) nas proteínas estruturais (colagénios fibrillar) para terapia incluem Cross-linking fotoquímicos e tecido do cross-linking métodos (TXL). Tais métodos para induzir alterações de propriedade mecânica do tecido estão sendo empregados para a córnea em afinamento corneano (mecanicamente enfraquecido) doenças como ceratocone, bem como a esclera em miopia progressiva, onde afinamento e enfraquecimento da posterior esclera ocorre e provavelmente contribui para o alongamento axial. As proteínas alvo primário para tal reforço de tecido são fibrillar colágenos, que constituem a grande maioria das proteínas de peso seco na córnea e esclera. Fortuitamente, fibrillar colágenos são a principal fonte de segunda geração harmônica sinais no espaço extracelular de tecido. Portanto, modificações das proteínas de colágeno, tais como aqueles induzida através do cross-linking terapias, potencialmente poderiam ser detectadas e quantificadas através da utilização de microscopia de segunda geração harmônica (SHGM). Acompanhamento SHGM sinaliza através do uso de um laser acoplado com uma luz infravermelha da excitação do sistema de microscopia de varredura fonte é um método de imagem moderno emocionante que está desfrutando de uma utilização generalizada em ciências biomédicas. Assim, o presente estudo foi realizado para avaliar o uso da microscopia SHGM, como um meio para medir induzida do cross-linking efeitos em ex vivo esclera de coelho, após uma injeção de uma substância química do cross-linking agente no espaço do subespiga (sT), uma injeção ou seja abordagem prática padrão para causando anestesia ocular durante os procedimentos de clínicos oftalmológicos. O produto químico agente do cross-linking, hidroximetilglicinato de sódio (SMG), é de uma classe de cosméticos conservantes conhecidos como formaldeído, liberando agentes (FARs). Scleral alterações após reação com SMG resultaram em aumentos no SHG sinais e correlacionadas com mudanças na temperatura de desnaturação térmica, um método padrão para avaliar induzido tecido efeitos do cross-linking.

Temperatura de desnaturação térmica (Tm) como um método de ensaio para avaliar TXL cross-linking efeito: Um total de 16 pares de olhos de coelho foram utilizados nesses experimentos para o procedimento TXL. Como uma parte inicial deste estudo, avaliou-se a localização do efeito do cross-linking induzido por uma única injeção de agente do cross-linking de SMG através do espaço de sT na cabeça coelho cadavérico. Este tipo de experimento tem relevância para o tratamento clín...

Este protocolo descreve técnicas para a avaliação química do cross-linking de esclera coelho usando a imagem latente de geração segundo harmônico e diferencial de calorimetria de varredura.

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o uso da microscopia de segunda geração harmônica para visualizar e medir o efeito de reticulação do colágeno no tecido escleral, induzido pela injeção subtenon de agente liberador de formaldeído e confirmado com calorimetria exploratória diferencial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da reticulação terapêutica de tecidos, fornecendo um método não invasivo para avaliar os efeitos de reticulação induzidos. A principal vantagem dessa técnica é que os sinais gerados pelo segundo harmônico são altamente específicos para fibrilas de colagem e, como tal, nenhuma preparação especial de tecido, como coloração de anticorpos, é necessária.Tivemos essa ideia para esse método pela primeira vez quando lemos sobre o procedimento que está sendo aplicado à reticulação terapêutica do tecido da córnea. A demonstração visual desse método é crítica, pois a microscopia de segunda geração harmônica bem-sucedida requer a colocação cuidadosa do tecido e a configuração das condições de imagem corretas para evitar danos ao tecido e artefatos na medição do sinal. Comece o tratamento com injeção de subtenon nos globos oculares do coelho, conforme descrito no protocolo de texto.Mostre aqui uma representação esquemática do local de injeção do subtenon. Selecione um espéculo de tamanho ideal de acordo com o tamanho do olho. Após três horas e meia de incubação, retraia as pálpebras usando o espéculo palpebral para otimizar o acesso ao globo.Separe a conjuntiva ao redor do limbo e corte os músculos oculares extras em seus locais de inserção escleral. Corte a parte superior da esclera usando uma tesoura ou uma lâmina para criar uma área de um por um centímetro com o local da injeção localizado centralmente. Raspe as camadas retinianas e coróides restantes e lave duas vezes com PBS fresco, cada vez deixando as peças em solução por aproximadamente 10 segundos.Coloque o tecido em tubos de um mililitro preenchidos com solução de PBS para transporte para a instalação de imagem. Para maximizar o sinal e a resolução ao realizar a microscopia SHG, use uma lente objetiva otimizada para transmitir luz infravermelha e com alta abertura numérica. Ajuste o colar de correção da lente para corresponder à profundidade da amostra.Neste caso, 0,17 milímetros. Monte a lente objetiva 25 vezes no microscópio e adicione uma quantidade generosa de gel de imersão à base de água para cobrir a superfície da lente. É importante realizar a imagem do tecido dentro de 30 minutos após a montagem da amostra no microscópio para manter o tecido hidratado e evitar o ressecamento do gel de imersão entre a objetiva da lente e a lâmina, pois isso resultaria em alterações no sinal SHG.Monte a câmara da célula colocando uma lamínula redonda de 25 milímetros na parte inferior da câmara. Coloque o pedaço de tecido da esclera na lamínula e adicione 50 a 100 microlitros de tampão. Cubra o tecido com uma segunda lamínula redonda e aparafuse a parte superior da câmara sem pressionar ou achatar o tecido.Em seguida, monte a câmara celular com a amostra de tecido no estágio do microscópio. Posicione o stage e ajuste a altura da objetiva de forma que a superfície inferior da amostra fique em foco, conforme determinado pela inspeção de campo claro através da ocular. Desligue todas as luzes, exceto o monitor do computador, e bloqueie o máximo de luz possível do monitor com folhas de papel alumínio colocadas no microscópio stage.No software, desligue o modo Eye Port. No painel TI Pad, verifique se a definição da lente está correta. No painel A1 Compact Graphical User Interface, escolha o laser infravermelho para geração de imagens, selecione os Detectores não digitalizados e escolha o canal DAPI equipado com um filtro passa-banda de 400 a 450 nanômetros.No painel A1 Multi Photon Graphical User Interface, defina o comprimento de onda do laser infravermelho para 860 nanômetros e abra o obturador. Aguarde até que o comprimento de onda de emissão seja alterado conforme indicado pela luz verde constante. Para definir as condições de escaneamento a laser no painel Interface gráfica compacta do usuário A1, selecione Scanner Galvano, escaneamento direcional de unidade, tamanho de quadro de 1024 por 1024 pixels, tempo de permanência de pixel de 6,2 microssegundos e média de linha de 2X.Em seguida, ative a imaginação ao vivo com o modo de localização e defina as condições de imagem no painel AI Compact Graphical User Interface, ajustando a potência do laser e o ganho do detector. Defina a potência do laser entre 50 miliwatts e 150 miliwatts, ou seja, entre dois por cento e seis por cento para um laser a 860 nanômetros. Acima dessa faixa, podem ocorrer danos aos tecidos.Abra o painel Tabela de pesquisa que exibe um histograma de valores de intensidade de pixel na imagem atual e ajuste ainda mais o ganho do detector na barra rotulada de HV para maximizar o intervalo de valores de pixel e evitar a saturação. Use a amostra com o sinal SHG mais alto para encontrar as configurações ideais de laser e ganho. Mantenha configurações idênticas para todas as amostras a serem comparadas em um experimento.Essa prática garante que nenhuma amostra no experimento sature o detector. Para digitalizar se o tecido está no modo de visualização, abra a ferramenta de visão geral XYZ. Defina a imagem para resolução mais baixa para acelerar a aquisição de imagens neste modo.No painel de visão geral XYZ, clique com o botão direito do mouse na posição atual e selecione digitalizar cinco por cinco, três por três ou captura de exibição única. Após a conclusão da digitalização, vá para um novo local clicando duas vezes em uma área fora da área visualizada atual. Ative o modo Live Scan e coloque o tecido em foco, pois diferentes regiões do tecido podem ter posições ligeiramente diferentes na direção axial.Capture um novo campo de visão cinco por cinco, três por três ou único. Repita esse processo até que uma grande área do tecido tenha sido visualizada. Na ferramenta de visão geral XYZ, clique duas vezes em uma posição em que as fibras de colágeno sejam vistas em todo o campo de visão para mover o palco para esse local específico.Defina a imagem para alta resolução, 1024 por 1024 pixels e média de linha 2X. Ative o modo Live Find, ajuste a posição da objetiva de forma que a planície inferior fique em foco e, no TI Pad, use o Z Drive para mover o plano óptico 10 micrômetros acima dessa camada inferior. Adquira uma imagem usando o botão de captura, salve o local com o botão de adição na ferramenta de revisão XYZ.Clique duas vezes em um novo local e repita o processo de ajuste de profundidade e captura de imagem. Para cada pedaço de tecido, capture 10 imagens. Os campos de visão não devem se sobrepor, conforme mostrado pelos locais salvos na ferramenta de visão geral XYZ.Finalmente, coloque as peças esclerais em um tubo de um mililitro com PBS imediatamente após a conclusão da microscopia em preparação para a análise de calorimetria exploratória diferencial subsequente. Para começar, corte a parte central do controle e trate a esclera com uma tesoura. Seque cada quadrado escleral com um lenço absorvente e coloque-o no fundo de uma panela DSC usando uma pinça dentada.Com o tecido no interior e o lábio frisado e coberto, pese o prato para obter o peso húmido do tecido. Em seguida, coloque a amostra pesada em seu local designado na bandeja do amostrador automático DSC. Crie um método usando o software de gerenciamento de instrumentos, especificando o peso do tecido e execute a análise térmica usando os perímetros listados no protocolo de texto.Depois de concluído, analise os dados de cada amostra extraindo o pico da temperatura de transição no qual ocorre a desnaturação térmica usando o software de imagem do instrumento. Imagens SHG da esclera foram analisadas em Fiji quanto ao brilho médio dos pixels. Quando uma imagem é aberta e o menu de análise é selecionado seguido de medida, uma tabela com resultados é aberta contendo o brilho médio do sinal.Como alternativa, no menu Analisar, Histograma é selecionado para criar um histograma de valores de intensidade de pixel que contém informações sobre o brilho médio e a variação do sinal na imagem. Essa medição foi repetida para todas as imagens das amostras de controle e reticuladas. Imagens SHG representativas da esclera com análise de histograma que a acompanha, incluem brilho médio, são demonstradas aqui.A amostra controle é caracterizada por um arranjo ondulado de fibrilas. Aqui é mostrada uma amostra reticulada com SMG 400 milimolar com intensidade de pixel aumentada, revelando fibras de colágeno que parecem mais retas. Os resultados da análise térmica mostram o pico mais alto da temperatura de desnaturação e confirmam o efeito de reticulação.A amostra de controle e uma curva de desnaturação da amostra reticulada de 400 milimolares são mostradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma amostra reticulada e como realizar a microscopia SHG em amostras esclerais. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam com a injeção precisa no espaço subtenon, extraindo cirurgicamente o quadrado ao redor do local da injeção e definindo as condições das imagens para escanear o tecido no modo de visualização.Após este procedimento, outros métodos, como a autoluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a análise da elastina, incluindo quantificação e morfologia. As implicações dessa técnica de entrega de agente de reticulação se estendem à terapia de alta miopia e estafiloma posterior, pois fornece acesso mais fácil ao polo posterior para fins de estabilização escleral. As implicações dessa técnica de microscopia se estendem para diagnósticos de alta miopia e complicações causadas pelo enfraquecimento do colágeno, medindo o estado de reticulação do colágeno na esclera doente ou medindo o resultado após a conclusão do procedimento de reticulação desejado.Assim, este método de reticulação e microscopia de geração de segundo harmônico pode fornecer informações sobre a reticulação escleral, também pode ser aplicado a outros tecidos, como córnea, pele, cartilagem, tendão, válvula cardíaca e vasos sanguíneos.

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A reticulação do colágeno da córnea (CXL) é o único tratamento conservador atualmente disponível para interromper a progressão do ceratocone, melhorando a rigidez biomecânica do estroma da córnea. O objetivo deste manuscrito é destacar os métodos de três diferentes protocolos de CXL: CXL convencional (C-CXL), CXL acelerado (A-CXL) e ICXL de iontoforese (I-CXL).

Três diferentes protocolos de Corneal Collagen reticulação em Ceratocone: convencional, com aceleração e Iontoforese

Nós demonstramos o efeito de reticulação escleral com riboflavina e UVA em um olho alongamento coelho axial. alongamento axial foi induzida em coelhos 13 dias de idade Nova Zelândia (masculino e feminino) suturando as pálpebras do olho direito (tarsorrafia).

Escleral reticulação Usando ultravioleta e riboflavina-A radiação de Prevenção de Axial Miopia em um modelo de coelho

Retina epitélio pigmentar (RPE) estratégias de substituição e terapia baseada em gene são considerados para várias condições degenerativas da retina. Para a tradução clínica, o olho dos modelos animais de grande porte são obrigados a estudar técnicas cirúrgicas aplicáveis ​​em pacientes. Aqui nós apresentamos um modelo de coelho para a cirurgia sub-retiniana voltada para o transplante de EPR, que é versátil e eficiente.

A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

O objetivo deste estudo é avaliar se o enxerto de suprachoroidal de células-tronco derivadas adiposo incluídas na fração do estroma vascular e plaquetas derivadas de plasma rico em plaquetas através da técnica de restauração Limoli Retinal pode melhorar a acuidade visual e respostas de sensibilidade da retina nos olhos afetados pela seca degeneration macular age-related.

Terapia regenerativa pela célula Suprachoroidal Autograft em seco Degeneration Macular Age-related: relatório preliminar na Vivo

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Este manuscrito descreve o romance de configuração e funcionamento interno de um fotoacústico microscopia e sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada de coerência óptica para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo de animais maiores, tais como coelhos.

Novela fotoacústico microscopia e tomografia de coerência óptica Imaging Dual-modalidade choriorétiniennes nos olhos de coelho vivo

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Um protocolo reprodutível é apresentado para a preparação, enriquecimento e aplicação de um hidrogel in situ de luz azul e reticulável gelatina–riboflavina para reparo de feridas estromais corneanas em coelhos, incluindo etapas procedimentais para manuseio cirúrgico, tarsórrafia parcial e cuidados pós-operatórios.

Fabricação e Aplicação Cirúrgica de Hidrogéis Enriquecidos de Gelatina–Riboflavina com Foto-Cruzamento para Reparo de Feridas Corneanas em Coelhos

Um banco de dados de oncologia torácica foi desenvolvido para servir como um repositório completo de dados clínicos e laboratoriais para fins de investigação de translação. O banco de dados servirá pesquisadores de câncer translacional dentro do Programa de Cirurgia Torácica Oncology Research. Este banco de dados é adaptável aos modelos outro câncer, bem como outras doenças humanas.

Geração de banco de dados de Oncologia Torácica Comprehensive - Ferramenta para Pesquisa Translacional

Aprenda a usar microscopia de segunda harmônica para visualizar colágeno em tecido escleral de coelho após injeção sub-tenoniana de agente liberador de formaldeído. Este método não invasivo avalia o cross-linking terapêutico para miopia.

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia (Vídeo) | JoVE Journal

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

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