Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

O objetivo geral deste protocolo é usar os compostos de moléculas pequenas PD0325901 e vitamina C para manter um estado hipometilado e pluripotente em células-tronco embrionárias de camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco embrionárias de camundongos cultivadas com FBS, como heterogeneridade na morfologia e deshipermetilação. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que as células-tronco embrionárias de camundongos são capazes de sustentar uma excelente morfologia e o estado hipometilado e indiferenciado.

Depois de preparar placas e tampões, de acordo com o protocolo de texto, pré-aqueça as células ES do camundongo, meio de cultura, tripsina e PBS em banho-maria a 37 graus Celsius. Para passar as células, aspire o meio do prato e use dois mililitros de PBS para enxaguar as células duas vezes. Em seguida, remova o PBS e adicione 0,3 mililitros de tripsona EDTA às células e incline rapidamente o prato para cobrir as células na solução.

Remova imediatamente a tripsina e incube a placa a 37 graus Celsius por um minuto para separar as células. Adicione dois mililitros de meio de soro pré-aquecido para inativar a tripsina e use uma pipeta de cinco mililitros para ressuspender as colônias de células 10 vezes em uma única suspensão celular. Coloque 150 microlitros da solução celular em um novo prato revestido de gelatina de seis centímetros e suplemente com três mililitros de meio VCPD0325901 recém-feito.

Cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. Devido à instabilidade do Vc, a cada 24 horas durante a incubação, remova o meio de cultura antigo e adicione três mililitros de meio Vcpd0325901 fresco. Depois de atingir 70 a 80 por cento de confluência, passe as células e continue a cultivá-las como acabamos de demonstrar.

Para realizar a extração de DNA, colete as células com tripsina conforme demonstrado anteriormente e use um kit de purificação de DNA genômico seguindo as instruções do fabricante. Adicione 100 microlitros de água ultrapura ao tubo de DNA e dissolva o DNA pipetando aproximadamente 15 vezes. Em seguida, use um espectrofotômetro para medir a proporção de Od260 a 280 para determinar a concentração e a qualidade do DNA.

A concentração de DNA deve ser de cerca de 500 nonogramas por microlitro. Em seguida, digerir cinco microgramas de DNA combinando-o com cinco microlitros de cloridrato de tris 100 milimolares PH7.6, duas unidades de fosfatase intestinal de bezerro, uma unidade de Dnase um e 0,005 unidades de veneno de cobra, fosfodiesterase um. Em seguida, use água ultrapura para aumentar o volume para 50 microlitros.

Incube a reação a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, colete a amostra por centrifugação a 1.000xg em temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, transfira a solução para tubos de ultrafiltração e gire as amostras a 13.000xg e 4 graus Celsius por 30 minutos para remover as enzimas de digestão.

Para preparar as amostras para análise de 5HMC, transfira 36 microlitros do filtrado para um novo tubo de um mililitro e adicione quatro microlitros de D35HMC para uma concentração final de três nanomolares. Para análise de 5MC, pipete 196 microlitros de água ultrapura em um novo tubo de centrífuga e adicione quatro microlitros de filtrado devido à alta densidade de 5MC no DNA genômico. Transfira 36 microlitros da solução diluída de 5MC para um novo tubo de centrífuga e adicione quatro microlitros de D35MC para uma concentração final de 50 nanomolares.

Use D35HMC e D35MC como padrões internos para calibrar 5HMC e 5MC, respectivamente. Após configurar os parâmetros para analisar 5MC e 5HMC no software UHPLCMS, de acordo com o protocolo de texto, estabeleça os parâmetros para QQQMSMS clicando em MS QQQ. Para Tempo de parada, escolha Sem limite/Como bomba.

Para fonte de íons, escolha ESI. Para filtragem de tempo, marque Largura do pico e insira 0,07 minutos. Para configurar os segmentos de tempo, para hora de início, escolha zero.

Para definir o modo de varredura no MRM para analisar a alusão da coluna, em tipo de varredura, escolha MRM. Em Div Value, escolha To MS. Para Delta EMV plus, insira 200 e para Delta EMV menos, insira zero. Crie os parâmetros para monitorar as transições clicando primeiro em MSQQQ uma aquisição.

Para definir segmentos de varredura, para Espera, insira 90. Para definir as tensões do fragmento para o Fragmentor, insira 90. Para Energia de colisão, insira cinco.

Para a Tensão do acelerador de célula, insira quatro. Para definir o modo de íon positivo, para Polaridade, escolha positivo. Para realizar a separação UHPLC de mononucleosídeos, prepare as soluções a e b para a alusão de 5MC e citosina misturando 500 mililitros de água ultrapura com 500 microlitros de ácido fórmico para a solução a.

Em seguida, meça 500 mililitros de metanol a 100% e a solução b. Misture a solução a e a solução b em uma proporção de 95 a cinco volumes para volume como a fase móvel para eluir 5MC e C. Em seguida, defina a taxa de fluxo para 0,25 mililitros por minuto. Separe o 5HMC usando uma alusão de gradiente otimizada.

Em seguida, defina a vazão em 0,25 mililitros por minuto. Monitore as transições para 5MC, D35MC, DC, 5HMC e D35HMC. Defina as tensões capilares em 3.500 volts.

Em seguida, defina o volume de injeção para 5 microlitros e analise cada amostra três vezes. Empregue as curvas padrão correspondentes para avaliar a quantidade de 5MC e 5HMC de acordo com o protocolo de texto. Como visto nesta análise do DNA genômico em células ES de camundongos por UHPLC MSMS, o tratamento com VcPD0325901 resultou em um declínio mais rápido na metilação do DNA e atingiu cinco níveis estáveis de MC após cinco dias, enquanto o tratamento com Vc 2i resultou em um nível comparável no dia 11.

Este gráfico mostra que o tratamento contendo Vc aumentou drasticamente a frequência de 5HMC após um dia e, posteriormente, os níveis de 5HMC diminuíram gradualmente devido a uma redução progressiva no substrato de 5MC. A análise de Western blot mostrou que Prdm14 estava significativamente elevado, enquanto Dnmt3b e seu cofator, Dnmt3l, foram consideravelmente regulados para baixo quando as células recuaram com PD0325901, indicando a ação de PD0325901 no apagamento de 5MC. Neste ensaio de fosfatase alcalina, as células ES de camundongos foram todas coradas de roxo com uma morfologia semelhante a uma bola quando cultivadas por 26 dias em VcPD032590, indicando um estado indiferenciado.

Em contraste, as células cultivadas em FBS contendo apenas meio pareciam de cor clara com espalhamento parcial indicando diferenciação parcial. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o FBS precisa ser pré-selecionado.

Além disso, evite pipetar demais as células através da passagem e trocar o meio de cultura VcPDO325901 diariamente. Após esse desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da cultura de células ES de camundongos in vitro explorarem o desenvolvimento e os processos de embriões in vitro e as células geradas de relevância médica para a medicina regenerativa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma maior compreensão de como manter a morfologia do crescimento e o estado potente hipermetilado e plural para células ES de camundongos usando dois pequenos componentes moleculares, o inibidor de MEK, PD0325901.

Não se esqueça de que trabalhar com Trisol, DMS ou PMS e TDT pode ser extremamente perigoso e as precauções como usar luvas, máscara e óculos de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.