Name: Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda um método de cultura alternativo para manter células-tronco embrionárias de camundongo em estado hipometilado e pluripotente usando PD0325901 e vitamina C.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (21435008 e 21327006 de h. w) e o programa de pesquisa de prioridade estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB14030200 de H.W.).

1. preparações
<ol><li>
Preparar uma solução de 1,0 mM PD0325901 (inibidor MEK) e 3,0 mM CHIR99021 (inibidor de GSK3).
	<ol>
<li>Pesar 2 mg de PD0325901 e adicionar em um frasco de vidro âmbar 4,15 mL de DMSO.</li>
		<li>Pesar de 2 mg de CHIR99021 e adicionar 1,43 mL de DMSO em um frasco de vidro âmbar.</li>
		<li>Reconstituição de seguir, armazenar alíquotas (50 µ l/tubo em 200 tubos PCR µ l) a-20 ° C e protegido da luz. Remova um tubo contendo o estoque congelado de um freezer e descongelar à temperatura ambiente antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar 0,0176 g de Vc em 1 mL de um tubo de centrífuga e reconstitui-lo com 1 mL de água estéril para uma concentração final de prévia de 100 mM para usar.</li>
	<li>Inactivar FBS: incube 500ml de FBS num banho de água a 56 ° C durante 30 min.</li>
	<li>
Prepare-se para cultivo de células de rato ES 600 mL do meio de base.
	<ol>
<li>Utilize um frasco de meio de glicose DMEM/alto (500 mL) e remover 40 mL.</li>
		<li>Suplemento 460 mL de DMEM/alto médio de glicose com 20% inactivadas FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µ l de 107 U/mL de solução), 0.1 mM não aminoácidos essenciais (timina) (6 mL de solução-mãe de 10mm), piruvato de sódio 1 mM (6 mL de solução estoque de 100 mM) , 2 mM L-glutamina (6 mL de solução-mãe de 200 mM), 0.1 mM β-mercaptoetanol (600 µ l da solução estoque de 100 mM) e 33 UI/mL penicilina e estreptomicina 33 de µ g/mL (2 mL de penicilina-estreptomicina mistura solução (10.000 UI/mL penicilina e estreptomicina 10.000 de µ g/mL)) . Defina o meio básico como meio de soro.</li>
		<li>Pipete 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e Vc (100 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: 1,0 µM PD0325901 e Vc de 100 µM) e definir o meio como Vc/PD0325901 médio. Nota: Prepare o fresco médio Vc/PD0325901 antes de usar devido à instabilidade de Vc.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta, transfira 50 µ l de solução-mãe de PD0325901 (1,0 mM) e CHIR99021 (3,0 mM), respectivamente, em 50 mL do meio de soro (concentração final: PD0325901 1.0 µM e CHIR99021 3.0 µM) e definir o meio como meio de 2i.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os pratos de gelatina-revestido.
	<ol>
<li>Preparar a solução de gelatina de 0,1%: dissolver 0,3 g de gelatina em 300 mL de água ultrapura em um frasco de reagente de vidro com uma tampa e esterilizar em autoclave a 121 ° C por 20 min. loja a solução estéril à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar os pratos de cultura celular (6 cm de diâmetro) com 2 mL de solução de gelatina 0,1% por 15 min à temperatura ambiente e em seguida aspirar a gelatina. Secar os pratos no ar e usá-los no prazo de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de células de rato ES congelamento médio em um tubo de centrífuga de 15 mL: 90% FBS (9 mL) e 10% DMSO (1 mL). Utilize o meio dentro de 1 dia.</li>
	<li>Prepare um recipiente de congelação: Adicionar álcool isopropílico 100% para a linha de enchimento do recipiente de congelação e descartar o velho álcool isopropílico. Adicione novo álcool isopropílico diretamente após cada utilização de quinta.</li>
	<li>Fazer o tampão de digestão enzimática: pesar 1,2114 g de Tris pó em 100 mL de água ultrapura para preparar 100 mM Tris solução e adicionar concentrado solução de HCl (cerca de 12 metros) para a solução de Tris para ajustar o pH para 7,6 (cerca de 0,6 mL de solução concentrada de HCl).</li>
	<li>Prepare-se 50 mL de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio (amortecedor de RIPA): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM de NaCl, glicerol 20%, 0,5% NP40, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA. Suplemento com 1 mM DTT, 1 X coquetel de inibidor de protease e 1 mM antes PMSF de usar. Se adicionarmos a PMSF, use o tampão dentro de 30 min.</li>
</ol>2. crescer pilhas do ES do Mouse em pratos de gelatina-revestido
<ol><li>Cultura de células pre-quente do ES (tipo selvagem, SvEv 129) médio, tripsina e solução de tampão fosfato (PBS) em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>
Passagem das células. Aspire a médio e a louça para lavar as células completamente do prato e pipeta 2 mL de PBS.
	<ol>
<li>Remover a PBS com uma pipeta e lavar as células novamente com 2 mL de PBS.</li>
		<li>Remover a PBS e adicionar 0,3 mL de tripsina-EDTA (0,25%) para cada prato.</li>
		<li>Cubra todo o prato com a tripsina rapidamente e depois removê-lo imediatamente.</li>
		<li>Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 1 min separar as células do prato. Retire os pratos da incubadora e adicione 2 mL do meio de soro pré-aquecido para encerrar a ação da tripsina.</li>
		<li>Dissocia as colônias de células em suspensão uma única célula por resuspending com uma pipeta (ponta da pipeta de 5 mL) 10 vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência de 150 µ l de 2 mL da solução de célula (cerca de 190.000 células contando com um hemocytometer) para uma nova placa de gelatina-revestido e complementar com 3 mL de meio de Vc/PD0325901 feito recentemente por placa de cultura de 6 cm. Cultura de células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Todos os 24 h durante a incubação, remover o meio de cultura antigo e adicionar 3 mL de meio-Vc/PD0325901 fresco para o prato de cultura devido à instabilidade da confluência Vc. Expect 70 – 80% após 2-3 dias.</li>
	<li>Depois de alcançar a confluência de 70-80%, passagem das células e continuar a cultura-los conforme descrito nas etapas 2.2 – 2.4.</li>
</ol>3. congelar e descongelar as células ES do Mouse
<ol><li>
Congele as células de rato ES.
	<ol>
<li>Separe as células desde os pratos com tripsina a seguir passo 2.2.</li>
		<li>Transferi as células em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 800 x g e temperatura de quarto por 3 min.</li>
		<li>Despejar o sobrenadante cuidadosamente para um copo e resuspenda o pellet de células com 1 mL de acabadas congelamento médio. Prepare o congelamento médio 30 min antes desta etapa para garantir que é a temperatura ambiente antes do uso.</li>
		<li>Transfira as células no meio de um tubo de microcentrifugadora de 1,8 mL com uma pipeta de 1ml de congelação e o tubo de microcentrifugadora em um recipiente de congelação. Adicionar álcool isopropílico para a linha de enchimento do recipiente congelação e mantê-lo em temperatura ambiente antes de usar.</li>
		<li>Deixe os recipientes de congelação durante a noite em um freezer-80 ° C.</li>
		<li>Transferi os tubos microcentrifuga para um recipiente de nitrogênio líquido para até 2 – 3 anos. Nota: Não manter as células no meio de congelação por um longo tempo e transferir rapidamente as células para um freezer-80 ° C, devido à toxicidade de DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pilhas do rato ES de descongelar.
	<ol>
<li>Pré-aqueça 50 mL de meio de soro em banho maria a 37 ° C.</li>
		<li>Pegue um frasco que contém a célula do contêiner de nitrogênio líquido e mergulhe o frasco tampado em banho maria a 37 ° C. Agitá-lo rapidamente em banho-maria para derreter. Transferi as células em um tubo de 15 mL com uma pipeta de 1 mL. Adicione 2 mL de meio de cultura de soro previamente aquecido dentro do tubo para diluir o meio de congelação e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender delicadamente as pelotas de célula com 3 mL de meio fresco Vc/PD0325901, usando uma pipeta de 5 mL.</li>
		<li>Transferir as células do tubo de 15 mL para um prato de gelatina-revestido e cultura as células por 24 h. cultura de células novamente como descrito na etapa 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. extrair proteína Total de células
<ol><li>Enxagúe as células coletadas com 1 mL de PBS e então centrifugar a x 800 g e a temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o celular completamente com o amortecedor de RIPA suplementado com TDT, coquetel de inibidor de protease e PMSF pipetando suavemente. O volume de tampão RIPA é cerca de 5 x que da célula de Pelotas. Nota: Efectue a ressuspensão de célula no gelo.</li>
	<li>Manter as células no buffer RIPA por 30 min no gelo e centrifugar a 13.000 x g e 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um tubo novo e armazenar alíquotas a-80 ° C.</li>
	<li>Determine a concentração da proteína com um kit de ensaio de proteína de Bradford.</li>
</ol>5. extrair DNA de células e DNA Digest em único nucleosídeo usando enzimas
<ol><li>Colete as células com tripsina conforme descrito nas etapas 3.1.1 e 3.1.2.</li>
	<li>Realize a extração de DNA com um kit de purificação de DNA genômico seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Guarde o DNA extraído em tubos de centrifugação de 1 mL. Adicionar 100 µ l de água ultrapura no tubo de centrífuga e dissolver o DNA pipetando aproximadamente 15 vezes. Determinar a concentração e avaliar a qualidade do DNA por medição da absorvância em 260 nm e 280 nm15. A concentração de DNA é de cerca de 500 ng / µ l.</li>
	<li>Digest 5 µ g de DNA em um sistema de 50 µ l de solução: Adicione 5 µ l de solução de Tris-HCl, pH 7,6 a 100 mM (concentração final: 10 mM), 2 fosfatase intestinal de U bezerro, 1 U DNase I, 0.005 U cobra veneno fosfodiesterase, eu e 5 µ g de DNA (calcular o volume adicionado de acordo com a medição concentração de DNA vermelha, ~ 10 µ l) em um tubo de centrífuga e aumento do volume de solução a 50 µ l com água ultrapura. Incube a mistura a 37 ° C durante a noite. Centrifugue a solução de DNA digerida em 1.000 g e temperatura ambiente durante 1 min coletar a solução para o fundo do tubo.</li>
	<li>Transferir a solução de DNA digerida dos tubos de centrífuga para tubos de ultrafiltração (um peso de molécula corte: 3 kDa) e centrifugar a 13.000 g e 4 ° C, por 30 min remover as enzimas de digestão.</li>
	<li>
Prepare as amostras para análise de 5mC e 5hmC.
	<ol>
<li>Para análise de 5hmC: Pipetar 36 µ l da solução de filtro para uma centrífuga de Nova tubo (1ml) e adicione 4 µ l de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) com a concentração final de 3 nM.</li>
		<li>Para a análise de 5mC: Adicionar 196 µ l de água ultrapura para um novo tubo de centrifugação e pipetar 4 µ l da solução de filtro para o tubo (50-fold diluição), devido à alta densidade de 5mC no DNA genômico. 36 µ l da solução diluída de transferência para um novo tubo de centrífuga e adicione 4 µ l de (-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine de 5' ([D3]-5mC) com a concentração final de 50 nM. Uso [D3]-5hmC e [D3]-5mC como padrão interno para calibrar 5hmC e 5mC, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a solução de amostra para tubos de medição e armazenar a 4 ° C. Analise 5mC e 5hmC com ultraelevado-desempenho líquido cromatografia-triplo quadrupolo espectrometria de massa com Múltiplo-reação monitoramento (UHPLC-MS/MS (MRM)), conforme descrito no relatório anterior15.</li>
</ol>6. analisar 5mC e 5hmC usando UHPLC-MS/MS15
<ol><li>
Configurar vários parâmetros para analisar 5mC e 5hmC usando o software de UHPLC-MS.
	<ol>
<li>Estabelece um novo método. Abra o software e clique em "arquivo | Novo | Método". Exibir a caixa de mensagem "Do Editor de método" com o conteúdo "Você quer salvar as alterações para o método atual" e clique em "Não".</li>
		<li>Construa os parâmetros do sampler. Clique em "Sampler | Instalação | Injeção". Selecione "Injeção padrão" e "5 µ l volume de injeção" de entrada.</li>
		<li>Construa os parâmetros da bomba em UHPLC.<ol>
<li>Clique em "BinPump2 | -Setup"para construir os parâmetros da bomba. Configure o "Fluxo" em "0,25 mL/min" e "Parar o tempo" a "15 min".</li>
			<li>Configurar o "Solvente B em 5%" e "Limites de pressão", no "bar Max 600".</li>
			<li>Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir a isocrática parâmetros de eluição para análise de 5mC. Clique em "Append" para adicionar uma linha. Entrada "0,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B".</li>
			<li>Clique em "BinPump2 | Calendário"para construir os parâmetros de gradiente de eluição para análise de 5hmC. Clique em "Append para adicionar uma linha. Entrada 0,00 no tempo e 5.0 em "% B". Clique em "Acrescentar" mais uma vez para adicionar uma nova linha. Entrada "3,00" no "Tempo" e "5.0" em "% B". Clique em "Append" para outro 6 vezes adicionar 6 linhas. Entrada "3.01" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6,00" no "Tempo" e "15,0" em "% B", "6.01" no "Tempo" e "100" em "% B", "10,00", no "Tempo" e "100,0" em "% B", "10.01" no "Tempo" e "5.0" em "% B", "15.00" no "Tempo" e "5.0" em "% B" em sequência. Nota: Efectuar a análise de 5mC e 5hmC individualmente devido às condições de separação diferente de UHPLC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Construa os parâmetros da temperatura do compartimento da coluna (TCC) em UHPLC. Clique em "TCC | Instalação | temperatura (à esquerda) "e"30 ° C"de entrada.</li>
		<li>Estabelece os parâmetros do Queiroz-MS/MS.<ol>
<li>Clique em "MS Queiroz | Parar o tempo | Não limite/como bomba"," fonte de íon | ESI"," tempo de filtragem | Largura: 0,07 min ". Configurar "segmentos de tempo: hora de início: 0"; "Tipo de digitalização: MRM"; "Valor Div: A MS"; "Delta EMV (+): 200" e "Delta EMV (-): 0".</li>
			<li>Construir os parâmetros de monitoramento das transições de 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC e D3-5hmC<ol>
<li>Clique em "MS Queiroz | Aquisição | Varredura de segmentos: habitar: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia de colisão: 5"; "Acelerador tensão da pilha: 4" e "polaridade: positivo".</li>
				<li>Entrada "5mC" no "Composto nome", "242", no "Precursor Ion", "126" no "Produto íon" para análise de 5mC. Clique com o botão direito e selecione "Adicionar a linha" para adicionar uma nova linha. Entrada "D3-5mC" no "Composto nome", "245" em "Precursor Ion", "129" de"produto" para D3-análise de 5mC.</li>
				<li>Outro suplemento três linhas usando o mesmo modo. "DC" no "Composto nome", "228" em "Precursor Ion", "112", de"produto" para análise de dC de entrada. Entrada "5hmC" no "Composto nome", "258" em "Precursor Ion", "142" de"produto" para análise de 5hmC. Entrada D3-5hmC no nome composto, "261" em "Precursor Ion", "145" de"produto" para D3-análise de 5hmC.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Construa os parâmetros da fonte de gás. Clique em "MS Queiroz | Fonte | Parâmetros de origem: gás Temp: 300 ° C "; "Fluxo de gás: 11 L/min"; "Nebulizador: 15 libras por polegada quadrada"; "Positivo-capilar: 3500 V".</li>
			<li>Salve o método proposto. Clique em "MS Queiroz | Instrumento | Método como Save". Selecione um caminho para o método proposto pelo "Diretório" e dê um nome para o método inserindo o conteúdo no "Método", por exemplo: análise de 5mC e 5hmC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separação de UHPLC e MS/MS análise de mononucleosides
	<ol>
<li>Preparar a fase móvel para 5mC e citosina (C) análise: formam a fase móvel da solução A e B. solução a: 500 mL de água ultrapura com 500 µ l de ácido fórmico (concentração final: 0,1%) e a solução b: 500 mL de metanol 100%. Misturar a solução A e B no 95:5 (v: v) como fase móvel a eluir 5mC e C (definido na etapa 6.1.3.3). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).</li>
		<li>Prepare a fase móvel por solvente A e B, para análise de 5hmC. A solvente é 2.0 mM NH4HCO3 aquoso (pH 9,0) (500 mL), e o solvente B é 100% de metanol (500 mL). 5hmC separadas por uma eluição gradiente otimizada: 0-3 min, 5,0% B e 95% por (v: v); 3-6 min, 15,0% B e 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15min, 5,0% B e 95% A (definida na etapa 6.1.3.4). Defina a taxa de fluxo em 0,25 mL/min (definido na etapa 6.1.3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilize electrospray MS/MS com modo de MRM (definido na etapa 6.1.5.1) para analisar a eluição da coluna e adotar o modo de íon positivo (definido na etapa 6.1.5.2.1).
	<ol>
<li>Monitorar as transições: 5mC, 242→126 m/z (energia de colisão, eV 5); [D3]-5mC, 245→129 m/z (eV 5); dC, 228→112 m/z (eV 5); 5hmC, 258→142 m/z (eV 5); [D3]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (definido no passo 6.1.5.2.2).</li>
		<li>Definir as tensões capilares e fragmento em +3,500 V (definido na etapa 6.1.5.3) e 90 V (definido na etapa 6.1.5.2.1), respectivamente.</li>
		<li>Definir o volume de injeção em 5 µ l e analisar cada amostra 3 vezes (definidos na etapa 6.1.2). Emprega as correspondentes curvas de padrão para avaliar a quantidade de 5mC e 5hmC.<ol>
<li>Estabelecer a curva padrão de 5mC: transferir 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentração final) solução-padrão de 5mC em centrifugar tubos e adicionar 50 nM [D3]-5mC para tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5mC, seguindo as instruções para a amostra de 5mC (etapa 6).</li>
			<li>Construir a curva padrão de 5hmC: transferir 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentração final) solução-padrão de 5hmC tubos de centrifuga e adicionar 3 nM [D3]-5hmC para os tubos. Suplemento do volume total de 50 µ l. efectuar a análise do padrão 5hmC, seguindo as instruções para a amostra de 5hmC (etapa 6).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analisar a significância estatística
<ol><li>
Realizar a análise estatística utilizando o software.
	<ol>
<li>Abra o software e selecione "Coluna" na "nova tabela & gráfico". Defina os parâmetros da seguinte maneira: "dados de exemplo | Iniciar com uma tabela de dados vazio"; "Escolher um modo gráfico, o primeiro"; "Representação gráfica de repetições ou barras de erro | Sinopse | Quer dizer com SEM".</li>
		<li>Clique em "Criar" para entrada as três repetições do grupo controle e Vc/PD0325901-tratados na linha "A" e "B", respectivamente. Selecione os seis dados e clique em "Analisar" na "Análise".</li>
		<li>Selecione "testes det (e testes não-paramétricos)" em "Análises de coluna" e clique em "Okey" para entrar na interface de próxima.</li>
		<li>Defina os parâmetros da seguinte maneira: "escolha teste | Nome de teste | Unpaired t teste; Opções | Two-tailed"; "Intervalos de confiança: 95%"; "Dígitos significativos | Mostre 4 dígitos significativos". Clique em "Okey" para adquirir o valor de p entre o tratamento controle e Vc/PD0325901.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avaliar a significância estatística entre o controle e os grupos experimentais empregando o Student bicaudal e unpaired t-teste16. Nota: p < 0.05 denota a diferença possuindo significância estatística. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li>
<li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+modulates+NF%CE%BAB+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%3A+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li>
<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
<li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li>
<li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li>
<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22855723">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li>
</ol>

Os autores não divulgar nenhuma potenciais conflitos de interesse.

No trabalho, temos demonstrado um novo método de combinar Vc e PD0325901 para sustentar as células de rato ES em um estado indiferenciado e hypomethylated, que foi alcançado por uma ação sinérgica de promover demetilação do ADN por Vc e suprimindo de novo DNA metilação de PD0325901. Além disso, as células ES do rato mostraram grande morfologia sob o sistema de cultura Vc/PD0325901.
Para melhor sustentar o estado das pilhas do rato ES no sistema de cultura Vc/PD0325901, existem algumas...

Pilhas do ES são originadas do ICM de um blastocisto1. As células estão em um estado de pluripotência e podem formar todas as linhagens somáticas e de células da linha germinal2. Estabelecimento de células ES fornece a oportunidade de investigar o desenvolvimento processa-se em vitro e pode gerar células de relevância médica para medicina regenerativa, com base na sua pluripotência3.
Dois grupos seminally estabeleceram as linhas de células de rato ES em 1981 e em células derivadas do embrião de rato foram cultivadas em soro fetal bovino (FBS)-contendo meio com fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como o alimentador camada1,4 . MEFs foram inactivados mitotically e pre-foram cultivadas em pratos antes de cultivo de células ES. MEFs fornecem suporte para fixação de células de rato ES e produzir fatores de crescimento para promover a propagação e reprimir a diferenciação5, enquanto FBS oferece essenciais fatores tróficos e hormônios para proliferação celular. Estudos posteriores indicaram que LIF produzido pelas células do alimentador foi o cytokine chave para autorenovação e manutenção da pluripotência em células de rato ES, pode substituir a adição de LIF no meio de alimentador células6. Atualmente, a sustentação do rato de pilhas do ES no meio de FBS/LIF em alimentadores ainda é o método padrão adotado por muitos pesquisadores. No entanto, alguns problemas surgem com esta abordagem da cultura clássica. Em primeiro lugar, alimentador células secretam fatores excessiva e descontroladas... e podem causar contaminação patogénica7. Para evitar esta interferência, revestir a superfície dos pratos com gelatina e a adição de LIF em soro contendo médio são métodos alternativos para a manutenção de células de rato ES sem células alimentador-camada. Além disso, células de rato ES cultivadas sob condições de soro/LIF apresentam heterogeneidade morfológica em populações de células e mesmo no nível de expressão de fatores relacionados a pluripotência8. Estudos recentes sugerem que, em condições de soro/LIF, os fatores de transcrição do núcleo pluripotência relacionados (incluindo OCT4, SOX2 e Nanog) podem sustentar a pluripotência através de LIF e WNT sinalização; no entanto, nomeadamente, eles também ativar um sinal de (FGF) do fator de crescimento fibroblástico para desencadear a diferenciação8. Devido à ação dupla ambivalente os núcleo de factores de transcrição, o rato ES células cultivadas no soro apresentam heterogeneidade, consistindo de duas populações intercambiáveis, um semelhante ao ICM e outro parecido com o epiblasto aprontada estado8. Além disso, as células de rato ES no soro muitas vezes apresentam hypermethylation global9, Considerando que ICM e PGCs estão em um estado de hypomethylated global, que está intimamente ligado com sua pluripotência9,10.
Há uma demanda considerável para desenvolver novos métodos de cultivo de células de rato ES. Foram estabelecidos vários protocolos melhorados desde 200311 mas continua a haver algumas limitações e deficiências7. Desde 2008, a utilização combinada de dois inibidores da quinase da pequeno-molécula, PD0325901 (inibidor de quinase da proteína mitogen-ativado (MAPK) / extracelular-sinal-regulada quinase (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (inibidor de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3)), em N2B27 médio com LIF e sem soro, abriu novas perspectivas para células de rato cultivo ES12. Este novo meio definido é caracterizado pelo uso de dois inibidores (2i). ES de mouse células cultivadas em meio de 2i/LIF são mais homogêneas em populações de células e a expressão de fatores de pluripotência. Além disso, pilhas do rato 2i/LIF-cultivadas ES apresentam DNA hypomethylation globalmente, que está mais perto de células ICM9,13. Mesmo assim, a cultura de 2i tem suas desvantagens. PD0325901 e CHIR99021 são insolúveis em água e geralmente dissolvem-se em dimetilsulfóxido (DMSO)-com base em solução para adicioná-los em meio de cultura. Estudos mostram que a longo prazo e baixa dose de exposição das células ao DMSO pode levar a citotoxicidade14.
Aqui, utilizamos dois compostos da pequeno-molécula e desenvolveu um novo método de cultura de células de rato ES. O método de cultura novela combina Vc e MEK inibidor PD0325901 para promover o DNA hypomethylation rapidamente e eficazmente a um nível comparável de PGC, nomeado como o protocolo de cultivo Vc/PD0325901. Pilhas do mouse ES em Vc/PD0325901-adicionado meio contendo soro apresentam homogeneidade na morfologia e são sustentadas em um estado fundamental. Comparado a cultura 2i, cultivadas sob condições de Vc/PD0325901 de pilhas do rato ES exibem cinética mais rápida da demetilação do ADN e podem atingir o nível de hypomethylation comparável do PGC. Além disso, o uso de um único inibidor (PD0325901) diminui a entrada quantidade de DMSO em média em comparação com que usado em 2i (PD0325901/CHIR99021) e reduz os danos às células.

<table><tbody><tr><td>soro fetal bovino Austrália fonte</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Componente do meio de células ES de camundongo</td></tr><tr><td>DMEM / glicose alta</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>Componente do meio de células ES de camundongo</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Componente do meio de células ES</td></tr><tr><td>de camundongo aminoácidos não essenciais (NEAA)</td> <td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Componente do meio</td></tr> <tr>de células ES de camundongo<td>piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Componente do meio de célula ES de camundongo</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Componente do meio de célula ES de camundongo</td></tr><tr><td>solução de estreptomicina de penicilina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Componente do meio de célula ES de camundongo</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Células enxaguam</td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Hyclone</td><td>SH30042</td><td>Dissociação celular</td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>de pratos PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>small-molecule chemical para cultura de células</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>small-molecule chemical para cultura de células</td></tr><tr><td>vitamina C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&nbsp;</td><td>XW00508171</td><td>produto químico de moléculas pequenas para cultura</td></tr><tr><td>de células Sistema de purificação de água Ultra Bioscience</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra água</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Centrífugo de meio de congelamento de células</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td> Coquetel de inibidores de protease <td>de extração de DNA e proteína</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Componente do tampão</td></tr> <tr>RIPA<td>Inibidor de Protease PMSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>Componente do tampão RIPA</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Componente do tampão RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Componente do tampão RIPA</td></tr><tr><td>Kit de Purificação de DNA Genômico&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>Extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Determinação da concentração de DNA</td></tr><tr><td>fosfatase intestinal de bezerro</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>Digestão</td></tr><tr><td>de DNA DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>Digestão de DNA</td></tr><tr><td>veneno de cobra fosfodiesterase I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>Digestão de DNA</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>filtração do sistema UHPLC de DNA digerido</td></tr><tr><td>1290</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC separação</td></tr><tr><td>G6410B espectrômetro de massa triplo quadrupolo Agilent</td><td>&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>Análise MS/MS</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 coluna</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>colume para separação UHPLC</td></tr><tr><td>5-metilcitosina</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>padrão 5mC</td></tr><tr><td>5-hidroximetilcitosina (padrão)</td> <td>Toronto Research Chemicals</td><td>M295900</td><td>padrão 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 anticorpo</td><td>bioworld</td><td>BS7634</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td></tr><tr><td>Dnmt3a anticorpo</td><td>bioworld</td><td>BS6587</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td></tr><tr><td>Dnmt3b abcam</td><td>ab13604</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td><td></td></tr><tr><td>Dnmt3l anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td></tr><tr><td>Dnmt1 anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td></tr> <tr><td>e beta; - anticorpo de tubulina</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Análise de Western blot - anticorpo primário</td></tr><tr><td>de cabra anti-coelho IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>Análise de Western blot - anticorpo secundário</td></tr><tr><td>anticorpo</td><td>secundário de análise de Western blot de</td>cabra <td>IgG abcam</td><td>ab6789</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transcrição reversa</td> de extração de RNA <td>Promega</td><td>A3500</td><td>Transcrição reversa de RNA</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG kit de coloração e ensaio de atividade de fosfatase alcalina</td><td>Células Biolabs, Inc.</td><td>CBA-302</td><td> análise de coloração de fosfatase alcalina</td></tr> células <tr><td>ES de camundongo: WT, 129 SvEv</td><td>Fornecido pelo Professor Guoliang Xu (Institutos de Ciências Biológicas de Xangai, Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China)</td><td></td> <td>cepa de células de camundongo microscópio de células ES</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>observação</td></tr><tr><td>de células GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>Análise estatística</td></tr></tbody></table>

um método alternativo de cultura para manter hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias mouse usando mek inibidor pd0325901 e vitamina c

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Células-tronco embrionárias (ES) têm o potencial de se diferenciar em qualquer uma das três camadas germinativas (ectoderma, mesoderma ou endoderme) e podem gerar muitas linhagens para medicina regenerativa. ES célula cultura em vitro tem sido objecto de preocupação generalizada. Classicamente, pilhas do rato ES são mantidas no fator inibitório de soro e leucemia (LIF)-contendo meio. No entanto, sob condições de soro/LIF, células mostram heterogeneidade na morfologia e o perfil de expressão de genes relacionados ao pluripotência e estão principalmente em um estado metaestável. Além disso, células cultivadas de ES exibem hypermethylation global, mas células de ES ingênua da massa celular interna (ICM) e as células germinativas primordiais (PGCs) estão em um estado de hypomethylation global. O estado de hypomethylated do ICM e PGCs está intimamente associado com sua pluripotência. Para melhorar os métodos de cultura de células de rato ES, recentemente foi desenvolvido um novo método baseado na utilização seletivamente combinada de dois compostos da pequeno-molécula para manter o estado de hypomethylated e pluripotentes de DNA. Aqui, apresentamos que co tratamento da vitamina C (Vc), e a PD0325901 podem apagar cerca de 90% de 5-metilcitosina (5mC) em 5 dias em pilhas do ES do rato. O conteúdo gerado 5mC é comparável em PGCs. A investigação mecanicista mostra que PD0325901 acima-regula a expressão Prdm14 para suprimir Dnmt3b (de novo DNA metiltransferase) e Dnmt3l (o cofator de Dnmt3b), reduzindo a síntese de novo de 5mC. Vc facilita a conversão de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) catalisada principalmente por Tet1 e Tet2, indicando o envolvimento de demethylations de DNA passivas e ativas. Além disso, em condições de Vc/PD0325901, pilhas do ES do rato mostram morfologia homogênea e estado pluripotentes. Coletivamente, propomos um método de cultura química-sinergia para alcançar o DNA hypomethylation e manutenção da pluripotência em células de rato ES e romance. O pequeno-molécula dependente químico método supera as principais deficiências da cultura de soro e a promessa de porões para gerar células homogêneas de ES para novas aplicações clínicas e pesquisas.

Vc/PD0325901 induzida em sinergia global de eliminação de pilhas do ES do rato. Pilhas do mouse ES no soro apresentam hypermethylation de DNA, enquanto células ICM pluripotentes e PGCs mostram apagamento global de metilação do DNA e o estado de hypomethylated é estreitamente associado com sua pluripotência9,10.
Anteriormente, nós e os outros encontraram que Vc pode melho...

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

O objetivo geral deste protocolo é usar os compostos de moléculas pequenas PD0325901 e vitamina C para manter um estado hipometilado e pluripotente em células-tronco embrionárias de camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco embrionárias de camundongos cultivadas com FBS, como heterogeneridade na morfologia e deshipermetilação. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que as células-tronco embrionárias de camundongos são capazes de sustentar uma excelente morfologia e o estado hipometilado e indiferenciado.Depois de preparar placas e tampões, de acordo com o protocolo de texto, pré-aqueça as células ES do camundongo, meio de cultura, tripsina e PBS em banho-maria a 37 graus Celsius. Para passar as células, aspire o meio do prato e use dois mililitros de PBS para enxaguar as células duas vezes. Em seguida, remova o PBS e adicione 0,3 mililitros de tripsona EDTA às células e incline rapidamente o prato para cobrir as células na solução.Remova imediatamente a tripsina e incube a placa a 37 graus Celsius por um minuto para separar as células. Adicione dois mililitros de meio de soro pré-aquecido para inativar a tripsina e use uma

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) - e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.

Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Nós descrevemos um método melhorado dramaticamente para clonagem de rato usando tricostatina A, vitamina C e desionizada albumina de soro bovino. Mostramos um protocolo simplificado, reprodutível, que suporta o desenvolvimento eficiente de embriões clonados. Assim, este método pode tornar-se um procedimento padronizado para clonagem de rato.

Combinacional tratamento de tricostatina A e a vitamina C melhora a eficiência da clonagem de ratos por transferência Nuclear de células somáticas

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Aqui, nós descrevemos um protocolo para gerar um modelo murino fêmea viável com inactivation não-aleatório do cromossoma de x, isto é, o cromossoma de x maternally-herdado é inativo em 100% das pilhas. Nós igualmente descrevemos um protocolo para testar a viabilidade, a tolerabilidade, e a segurança da reactivação farmacológica do cromossoma de X inativo in vivo.

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Aprenda um método de cultura alternativo para manter células-tronco embrionárias de camundongo em estado hipometilado e pluripotente usando PD0325901 e vitamina C.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C (Vídeo) | JoVE Journal

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Explorar mais vídeos