Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

O objetivo geral deste procedimento é investigar quantitativamente o metabolismo de várias fontes de nutrientes usando substratos marcados. Esse fluxo de trabalho permite determinar o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica dos compostos sintetizados pelas leveduras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do metabolismo microbiano, como todo o metabolismo funciona dependendo das condições ambientais.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite a elucidação e quantificação da distribuição de proteínas de nutrientes de múltiplas fontes. Este método foi usado para investigar o metabolismo do nitrogênio da levedura, mas também pode ser aplicado a outros metabolismos e microrganismos. A chave para o sucesso deste experimento está na reprodutibilidade das fermentações.

Os usuários devem prestar atenção especial para coletar as células no mesmo estágio fisiológico definido. Demonstrando o procedimento estarão Christian Picou, de nossa equipe técnica, Pauline Seguinot, aluna de doutorado do laboratório, e Stephanie Rollero, pós-doutoranda. Em autoclave, pasteurizar cada meio sintético preparado para cada fonte de nitrogênio em um frasco de um litro contendo uma barra de agitação magnética.

Dissolva a quantidade apropriada de molécula marcada para atingir a concentração final desejada no meio. Esterilize o meio usando um sistema de filtragem a vácuo descartável. Usando um cilindro medidor estéril, divida o meio entre dois fermentadores pré-esterilizados que contêm uma barra de agitação magnética e são equipados com travas de fermentação para evitar a entrada de oxigênio, mas permitir a liberação de dióxido de carbono.

Depois de cultivar uma cepa de cerevisiae em meio YPD, colete uma alíquota de pré-cultura sob fluxo laminar e quantifique a população de células usando um contador eletrônico de partículas equipado com uma abertura de 100 micrômetros. Após centrifugar a pré-cultura, suspender o pellet em um volume apropriado de água estéril para obter uma concentração final de 2,5 vezes 10 elevado a 9 células por mililitro. Em seguida, inocule cada fermentador com um mililitro da suspensão celular.

Em seguida, prepare uma plataforma de fermentação instalando os fermentadores nas guias de suporte que estão devidamente colocadas nas placas de agitação de 21 posições e ajuste a taxa de agitação em 270 RPM. Para iniciar o monitoramento online de cada fermentação, inicie o aplicativo de controle do robô, clique no botão Iniciar ensaio e selecione o volume de fermentação a ser realizado. Para garantir que a interface exibida permita a indicação do número e da posição dos fermentadores na plataforma, clique com o botão direito do mouse na localização do slot e escolha Desativar para desativar o monitoramento das posições vazias.

Para inicializar o software de cálculo, clique no botão Inicializador e valide com OK. Em seguida, clique no botão Iniciar do aplicativo de controle do robô para iniciar as aquisições de peso. Em seguida, centrifugue duas amostras de seis mililitros retiradas dos fermentadores a 2.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Quando terminar, transfira cada sobrenadante congelado para dois tubos e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Lave cada pellet duas vezes com cinco mililitros de água destilada e armazene a 80 graus Celsius negativos para a medição do enriquecimento isotópico. Adicione 200 microlitros de uma solução de ácido sulfossalicílico a 25% que contenha 2,5 milimolares de norleucina como padrão interno a 800 microlitros de amostra para remover moléculas com altos pesos moleculares. Após incubação e centrifugação, filtre a mistura através de uma membrana de nitrocelulose do tamanho de um poro de 0,22 micrômetro e coloque a amostra em um sistema de análise de aminoácidos.

No programa ou software do sistema de análise, clique no botão Corre para iniciar as análises de cromatografia líquida com o analisador equipado com uma coluna de troca catiônica. Em seguida, prepare um extrato oxidado suspendendo um pellet celular marcado previamente preparado em 200 microlitros de ácido perfórmico. Depois de incubar por quatro horas a quatro graus Celsius, interrompa a reação adicionando 33,6 miligramas de sulfato de sódio.

Adicione 800 microlitros de seis ácidos clorídricos normais ao extrato oxidado e incube a amostra em um tubo de vidro hermaticamente fechado por 16 horas a 110 graus Celsius em um forno de calor seco. Depois de permitir que a amostra esfrie até a temperatura ambiente, adicione 200 microlitros de neuroleucina 2,5 milimolares e remova o gás cloreto de hidrogênio com um fluxo de nitrogênio. Lave o extrato seco duas vezes com 800 microlitros de água destilada e depois 800 microlitros de etanol.

Em seguida, adicione 800 microlitros de tampão acetato de lítio 200 milimolar ao extrato. Determinar as concentrações relativas de aminoácidos nas proteínas da amostra utilizando o método cromatográfico anteriormente descrito. Hidrolise um pellet de célula marcada adicionando 1,2 mililitros de ácido clorídrico de seis molares e incubando a amostra por 16 horas a 105 graus Celsius em um tubo de vidro bem fechado em um forno de calor seco.

Depois de permitir que a amostra esfrie até a temperatura ambiente, adicione 1,2 mililitros de água destilada. Após a centrifugação para remover os detritos celulares, distribuir o sobrenadante em seis frações de 400 microlitros em tubos de vidro abertos. Seque as frações no forno de calor seco a 105 graus Celsius por quatro a cinco horas até atingirem a consistência de calda.

Durante a hidrólise da biomassa, secar a fracção até à consistência de um xarope, controlando frequentemente o ácido de funcionamento. Para a derivatização do ECF, dissolva o hidrolisado seco resfriado em 200 microlitros de ácido clorídrico 20 milimolar e 133 microlitros de uma mistura de um a quatro de piridina e etanol. Adicione 50 microlitros de cloroformiato de etila para derivatizar os aminoácidos.

Após a liberação do dióxido de carbono, transfira a mistura para tubos de centrífuga que contenham 500 microlitros de diclorometano para extrair os compostos derivatizados. Vortex as amostras por 10 segundos. Após centrifugação durante quatro minutos a 10 000 vezes G, recolher a fase orgânica inferior de cada amostra com uma pipeta Pasteur e transferir para um frasco para injetáveis de amostrador automático de GC que contenha uma inserção de vidro cónica, de modo a que cada amostra possa ser injectada directamente no instrumento GCMS.

Os reagentes de derivatização por HPLC são usados para o procedimento ECF. Troque frequentemente os reagentes ECF. Para derivatização de DMF-DMA, dissolva o hidrolisado seco em 50 microlitros de metanol e 200 microlitros de acetonitrila.

Adicione 300 microlitros de DMF-DMA e vortex a amostra. Em seguida, transfira a amostra para um frasco de amostrador automático de GC que contenha uma inserção de vidro cônica. Para derivatização de BSTFA, suspender o hidrolisado em 200 microlitros de acetonitrila.

Adicione 200 microlitros de BSTFA à amostra e feche hermaticamente o tubo de vidro. Após incubação por quatro horas a 135 graus Celsius, transfira o extrato resfriado diretamente para um frasco de amostrador automático de GC que contém uma inserção de vidro cônica. Agora, analise as amostras com um cromatógrafo gasoso equipado com um injetor de amostrador automático e acoplado a um espectrômetro de massa.

Clique em Instrumento no menu do software do computador. Na guia Sequência, clique em Editar Tabela de Log de Exemplo para criar uma lista de exemplo e clique em Executar e Executar Sequência para iniciar as injeções. Após a conclusão das análises, registar um conjunto de intensidades para cada aminoácido que corresponde aos seus diferentes isótopos mássicos.

Adicione 10 microlitros dos padrões internos deuterados apropriados a cinco mililitros de sobrenadante em um tubo de vidro de 15 mililitros. Adicionar um mililitro de diclorometano, fechar bem o tubo e agitar a amostra sobre uma plataforma de baloiço durante 20 minutos. Após centrifugação, recolher a fase orgânica inferior num tubo de vidro de 15 mililitros.

Depois de repetir a extracção com diclorometano, secar o extracto orgânico sobre 500 miligramas de sulfato de sódio anidro e recolher a fase líquida com uma pipeta de Pasteur. Concentrar o extracto por um factor de quatro sob fluxo de azoto. Em seguida, transfira a amostra concentrada para um frasco de amostrador automático de GC.

Para quantificação do GCMS, injete dois microlitros de amostra com uma proporção de divisão de 10 para um e separe as moléculas voláteis extraídas usando o perfil de temperatura do forno apropriado. Usando as planilhas no protocolo de texto, insira os valores brutos de dados que correspondem à concentração de aminoácidos extracelulares, peso seco celular, teor de proteína das células, concentração de moléculas voláteis e enriquecimento isotópico de aminoácidos proteinogênicos e moléculas voláteis. Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho para investigar o manejo por levedura das múltiplas fontes de nitrogênio encontradas durante a fermentação do vinho é mostrado aqui.

Para diferentes pontos de amostragem, os parâmetros biológicos mostram uma alta reprodutibilidade entre as fermenações. Uma visão geral da redistribuição de nitrogênio das fontes do suco de uva para todos os aminoácidos proteinogênicos é mostrada aqui. Aliada à determinação dos balanços de massa, a medição do enriquecimento isotópico de aminoácidos proteinogênicos proporcionou a primeira quantificação da contribuição de arginina, glutamina, amônio e outras fontes originárias de nitrogênio para os grupos aminas de cada um desses compostos.

Uma comparação entre a quantidade de aminoácido consumido que é diretamente recuperada na biomassa é representada aqui. A partição dos aminoácidos alifáticos consumidos, leucina e valina na rede metabólica da levedura é mostrada aqui. Mais de 96% da valina e leucina consumidas são recuperadas em seus produtos de conversão.

Surpreendentemente, uma fração substancial de valina e leucina é catabolizada, apesar de um desequilíbrio considerável entre a disponibilidade desses compostos no meio e seu conteúdo na biomassa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar cuidadosamente a parte de rotulagem do substrato de acordo com as questões científicas.

Para garantir uma boa reprodutibilidade biológica, realizar a fermentação e a análise cromatográfica em duplicado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de microbiologia explorarem como o metabolismo e a fisiologia dos microrganismos mudam dependendo das condições ambientais. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes de derivatização e solvente de arginina pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como usar luvas e trabalhar sob uma capela de exaustão devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.