Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

Comece este procedimento com a preparação de fibroblastos de tendão de camundongo, conforme descrito no protocolo de texto. Colha as células de uma placa de 10 centímetros aspirando primeiro o meio. Em seguida, adicione um mililitro de 0,05% de tripsina EDTA e incube por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius.

Após a incubação, tempere a tripsina com nove mililitros de DMEM-10 e colete as células ressuspensas em um tubo cônico de 15 mililitros. Diluir as células com DMEM-10 até uma concentração final de uma célula por 100 microlitros. Em seguida, transfira as células para placas de 96 poços pipetando 100 microlitros da suspensão em cada poço.

Incube as células a 37 graus Celsius até que os poços estejam confluentes, o que pode levar de duas a três semanas. Substitua a mídia por DMEM-10 novo a cada três a cinco dias. Quando confluentes, mobilize as células com 20 microlitros de EDTA de tripsina a 0,05% por poço e divida-as em dois conjuntos duplicados de placas de 96 poços.

Ensaio para atividade de luciferase em um conjunto de placas. Use um ensaio homogêneo de luciferase Firefly que não exija remoção de meio, seguindo o protocolo incluído no kit de ensaio de luciferase. Use os resultados do ensaio para selecionar clones sem atividade de luciferase detectável do conjunto restante de placas.

Expanda esses clones primeiro para uma placa de 24 poços e depois para uma placa de seis poços. Faça o mesmo para um clone com a maior atividade de luciferase. Isso será usado como um controle positivo para fins de validação.

Após a expansão na placa de seis poços, colha uma alíquota de cada poço para uma mancha ocidental. Mobilize as células com 200 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA. Incube as células por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius.

Resfrie as células com dois mililitros de DMEM-10 e transfira metade das células para outra placa de seis poços. Aguarde até que as células se prendam ao fundo da placa. Em seguida, lave as células uma vez com PBS antes da lisagem para o Western blot.

Placa de vários clones negativos a 0,2 milhão de células por poço em uma placa de seis poços. Trate as células uma vez com 10 micromolares de 5-azacitidina. Em seguida, incube por 72 horas sem alterar o meio antes de testar a atividade da luciferase, como antes.

Em seguida, escolha um clone negativo que ganhou atividade de luciferase com 5-azacitidina para a tela e comece a expandi-lo para várias placas de 10 centímetros. Congele os clones negativos restantes em nitrogênio líquido como backup. O clone positivo pode ser mantido na cultura de tecidos ou congelado até uso posterior.

De manhã, coloque um milhão de células X inativas em placas de cultura de tecidos de 10 centímetros. À tarde, infecte as placas substituindo o meio por DMEM-10 fresco contendo uma quantidade predeterminada de sobrenadante viral e cinco a 10 microgramas por mililitro de polibreno. Após 18 a 24 horas, aspirar o meio e adicionar 10 mililitros de DMEM-10 fresco a cada placa.

Placas de cultura por mais 48 horas. De manhã, mobilize as células usando um mililitro de 0,05% de tripsina EDTA por placa e tempere as células com 9 mililitros de DMEM-10 por placa. Passe a suspensão por um filtro de malha de 100 mícrons.

Junte as suspensões filtradas e semeie dois conjuntos de placas de 10 centímetros a um milhão de células por placa. À tarde, substitua o meio em um conjunto de placas por DMEM-10 contendo 15 microgramas por mililitro de higromicina B.In o outro conjunto, substitua o meio apenas por DMEM-10 novo. Após 48 horas, mobilize as células das placas não tratadas com higromicina B usando um mililitro de 0,05% de tripsina EDTA.

Incube por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, tempere as células com 9 mililitros de DMEM-10. Puxe as amostras individuais e prossiga imediatamente com a extração de DNA.

Continue cultivando o conjunto de seleção de higromicina B por mais seis dias, reabastecendo o meio de seleção com DMEM-10 novo contendo higromicina B a cada dois dias. No sexto dia, substitua o meio de seleção apenas por DMEM-10 novo. Aguarde quatro dias para a recuperação e, em seguida, colha o DNA da amostra pós-seleção como antes.

Prossiga para identificar grampos enriquecidos nas amostras de pós-seleção, conforme descrito no protocolo de texto. Para validar os acertos, primeiro semeie oito milhões de células de 293 pés por placa em placas de 10 centímetros. No dia seguinte, substitua o meio por nove mililitros de DMEM-10 sem antibióticos por placa 30 minutos antes da transecção.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de transfecção, misture um a cada alíquota de transfecção, misture dois e misture delicadamente pipetando. Em seguida, incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos. Aplique a mistura em cada prato em gota a gota e gire o prato suavemente para misturar.

No dia seguinte, substitua o meio por cinco mililitros de DMEM-10,48 horas após a transfecção inicial, colete o sobrenadante lentiviral e passe-o por um filtro de 0,22 mícron que foi pré-umedecido com DMEM-10 para maximizar a recuperação. Na manhã seguinte, coloque 0,1 milhão de células X inativas por poço em seis placas de poço. À tarde, infecte as placas substituindo o meio por dois mililitros de DMEM-10 fresco contendo sobrenadante lentiviral e cinco a 10 microgramas por mililitro de polibreno.

Infecte um poço de controle com sobrenadante viral produzido a partir de um vetor lentiviral vazio. No dia seguinte, substitua o meio por dois mililitros de DMEM-10 contendo um miligrama por mililitro de puromicina. Use a seleção por quatro dias.

Após quatro dias, substitua o meio por dois mililitros de DMEM-10 fresco e aguarde de 48 a 72 horas para recuperação. Depois de mobilizar as células com 150 microlitros de EDTA de tripsina a 0,05%, incube-as por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius. Tempere as células com 1,5 mililitros de DMEM-10 antes de transferir para tubos cônicos e centrifugar as células à temperatura ambiente a 500 vezes G por 10 minutos.

Remova o meio e ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de lise fornecido no kit de ensaio de luciferase. Incubar a suspensão à temperatura ambiente durante cinco minutos. Após cinco minutos, transfira a suspensão para uma placa branca de 96 poços.

Realize o ensaio na câmara escura, seguindo o protocolo incluído no kit. Use células X ativas como controle positivo e células X negativas infectadas com um vetor lentiviral vazio como controle negativo. Clones de fibroblastos de tendão de camundongo imortalizados mostram atividade positiva ou negativa da luciferase do vaga-lume, consistente com a colocação do repórter no cromossomo X ativo ou inativo, respectivamente.

A expressão de MeCP2, conforme determinado pelo Western blot, exibe o padrão recíproco. Observe que a atividade da luciferase do vaga-lume pode ser induzida em clones negativos com a administração de 5-azacitidina. Se presente no cromossomo X ativo, o gene de resistência à higromicina confere uma vantagem de sobrevivência na seleção da higromicina, quando comparado às células com o gene no cromossomo X inativo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e executar uma tela para reguladores da inativação do cromossomo X usando repórteres inseridos seletivamente no cromossomo X inativo. Meu laboratório já realizou triagens de base relatadas para reguladores de cromatina em leveduras, e nosso sucesso com essa abordagem me inspirou a projetar esta tela para reguladores da inativação do cromossomo X em células de mamíferos. Após este procedimento, outros métodos, como o uso de pequenos RNAs interferentes, CRISPR, pequenas moléculas podem ser realizados para ajudar a responder a perguntas adicionais sobre a inativação do cromossomo X em células de mamíferos.