Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição
17 de outubro de 2017
A avaliação precisa da resposta de dor em um modelo animal neuropática é crítica para investigar a fisiopatologia das doenças dor e desenvolver novos analgésicos. Apresentamos um método sensível e objetivo para determinar a função sensorial do roedor hind pata por um sistema de análise de marcha automática.
O objetivo geral deste procedimento é analisar a alodinia mecânica de camundongos com lesão crônica por constrição usando um sistema automatizado de análise da marcha. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa da dor, medindo a função sensorial após lesão de nervos periféricos em roedores. A principal vantagem dessa técnica é que o sistema de análise é rápido e fácil de usar e também pontua automaticamente vários parâmetros da marcha.
Para este estudo, camundongos ICR machos domésticos pesando 20 a 25 gramas em condições padrão por pelo menos uma semana. Selecione os ratos com base em sua aparência e comportamento. Não use ratos que apresentem aparências ou comportamentos anormais, como perda de cabelo, cicatrizes e menos movimento.
Usando os camundongos selecionados, a partir de cinco dias antes da cirurgia, colete dados automatizados da marcha diariamente para ter uma medição inicial. Um dia antes da cirurgia, realize o teste de Von Frey com um filamento de um grama na pata traseira para obter uma resposta basal. Equilibre as respostas entre o grupo de lesão e o grupo simulado.
Em cada dia de teste, leve os ratos para a sala de teste comportamental e aclimate-os em sua própria gaiola doméstica por pelo menos 30 minutos antes do teste. A cada dois dias após a cirurgia, meça a alodinia mecânica usando um teste de Von Frey. Coloque o mouse em uma caixa de acrílico transparente limpa em um piso de malha de metal e deixe-o se aclimatar à caixa por 30 minutos.
Em seguida, aplique suavemente um filamento de Von Frey de um grama na superfície plantar da pata traseira ipsilateral até que o filamento se dobre. Repita esse padrão de estimulação 10 vezes, observando as retiradas das patas. Aguarde pelo menos 10 segundos entre as estimulações.
Registre o número de saques e pontue sua frequência para análise. Em dias alternados, realize também o teste de análise da marcha que deve ser feito no escuro. Novamente, aclimate os ratos à sala de teste em sua gaiola doméstica por pelo menos 30 minutos.
Para configurar o dispositivo de análise da marcha, vá para o controle do software. Na guia de configuração, defina o comprimento da passarela para 30 centímetros, defina a duração máxima da corrida para cinco segundos e defina a variação máxima da corrida para 50%Em seguida, selecione uma câmera registrada na guia de configuração do menu do programa e, em seguida, selecione abrir aquisição na guia adquirir. Após a mensagem de status, clique no botão de fundo instantâneo para tirar uma foto de fundo da passarela vazia.
Agora coloque um mouse na passarela e deixe-o se aclimatar ao dispositivo por 10 minutos. O aparelho deve sempre ser lavado com álcool entre os ratos. Depois que o mouse se aclimatar ao dispositivo, clique no botão iniciar aquisição.
A gravação começa automaticamente de acordo com o movimento do mouse. Quando o mouse atravessar claramente a passarela, o programa classificará automaticamente as corridas compatíveis com um ícone verde. Se o software não conseguir detectar as pegadas, um ícone vermelho acenderá.
Depois de coletar pelo menos cinco execuções compatíveis, selecione a opção classificar execuções na guia adquirir do menu do programa. Selecione qual ensaio deve ser analisado e clique no botão de classificação automática. Os resultados são salvos automaticamente.
Para visualizar os resultados, clique em exibir estatísticas de execução no menu analisar. O teste de Von Frey e a análise automatizada da marcha foram usados para avaliar camundongos submetidos à cirurgia CCI em 10 dias consecutivos de pós-operatório. A frequência de retirada da pata aumentou dois dias após a cirurgia e foi mantida por 10 dias.
Este efeito pode ser significativamente reduzido por injeções pós-operatórias diárias de gabapentina. Usando o software de análise de marcha, o tamanho das pegadas traseiras esquerda e direita pode ser comparado. Normalmente, as áreas são as mesmas, o que é indicado por um valor de 50%.
A cirurgia CCI teve um efeito significativo na impressão da pata e esse efeito pode ser significativamente reduzido usando gabapentina. O software de análise de marcha também é capaz de detectar a mudança de durações de postura única quando o mouse está suportando peso em apenas uma pata traseira. Isso é calculado e mostrado como uma variação percentual.
Essa métrica mostra o mesmo efeito para a cirurgia CCI e os tratamentos com gabapentina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como operar e analisar sistemas automatizados de análise de marcha para investigar a fisiopatologia da dor neuropática em modelos animais, como lesão por constrição crônica.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método sensível para avaliar a resposta à dor em um modelo murino neuropático utilizando um sistema automatizado de análise da marcha. Ele investiga a função sensorial da pata traseira do roedor após lesão por constrição crônica, com o objetivo de responder perguntas fundamentais na pesquisa da dor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Dor
- Análise Comportamental
Antecedentes
- A lesão por constrição crônica é um método comum para induzir dor neuropática em modelos de roedores.
- A alodinia mecânica é utilizada para avaliar a resposta à dor após lesão do nervo periférico.
- Os métodos atuais podem apresentar baixa sensibilidade na detecção de alterações sutis nas funções sensoriais.
- Um sistema automatizado de análise da marcha fornece uma avaliação objetiva da função locomotora.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a eficácia de um sistema automatizado de análise da marcha para medir respostas à dor após lesão nervosa.
- Comparar a função sensorial antes e após intervenção cirúrgica.
- Avaliar o impacto de analgésicos, como a gabapentina, sobre as respostas à dor.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza um sistema automatizado de análise da marcha para monitorar a locomoção de roedores.
- Camundongos machos ICR com lesão por constrição crônica passam por avaliações pré e pós-cirúrgicas.
- Realize medições basais utilizando o teste de Von Frey e a análise automatizada da marcha.
- Os camundongos são testados diariamente por dez dias consecutivos após a cirurgia.
- Os dados da marcha são coletados em um ambiente escuro com parâmetros específicos de configuração para o sistema de análise.
Resultados Principais
- A frequência de retirada da pata aumentou após a cirurgia, indicando sensibilidade à dor, o que poderia ser atenuado pelo tratamento com gabapentina.
- A análise da marcha revelou alterações significativas nas áreas de impressão da pata traseira após a lesão.
- A duração da postura única foi afetada, destacando a utilidade da análise da marcha na detecção de mudanças comportamentais sutis.
- Os resultados indicam que tanto o teste de Von Frey quanto a análise da marcha são eficazes para avaliar a alodinia mecânica.
Conclusões
- Este procedimento permite uma análise sensível e objetiva da resposta à dor neuropática em modelos de roedores.
- O sistema automatizado de análise da marcha aprimora o estudo dos mecanismos da dor e de analgésicos.
- Os achados têm implicações para o desenvolvimento de novos tratamentos para doenças relacionadas à dor.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise automatizada da marcha fornece uma avaliação objetiva e quantitativa da dor neuropática em modelos de roedores, superando as limitações de testes sensoriais subjetivos como o teste de von Frey. Este método aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer leituras reprodutíveis da locomoção que se correlacionam com a alodinia mecânica. Ele apoia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao permitir a avaliação padronizada e de alto rendimento da eficácia analgésica em modelos pré-clínicos de dor.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a desmistificação mecanicista de alvos analgésicos por meio de parâmetros quantitativos da marcha, como área da pegada e duração da fase de apoio simples.
- Valor Operacional: Reduz o viés do experimentador e a variabilidade associada ao teste manual de von Frey, melhorando a reprodutibilidade dos dados entre diferentes locais.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao correlacionar alterações locomotoras com fenótipos de dor em modelos de lesão por constrição crônica.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera saídas padronizadas e quantitativas (por exemplo, tempo de balanço, ângulo da pata) adequadas para a otimização de ensaios e confirmação de hits.
- Valor Operacional: Automatiza a coleta e análise de dados, aumentando a produtividade e reduzindo a intervenção manual na triagem comportamental.
- Prontidão do Ensaios: Estabelece métricas de marcha basais e pós-lesão que permitem avaliação confiável de compostos em programas de descoberta de analgésicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Detecta alterações sutis na marcha com sustentação de peso que refletem a integração sensorial e motora relevante para a avaliação clínica da dor.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento contínuo e longitudinal da progressão da dor e da resposta ao fármaco ao longo de vários dias após a lesão.
- Continuidade Tradutiva: Alinha-se com os pontos de avaliação clínicos da análise da marcha, apoiando a extrapolação entre espécies no desenvolvimento de analgésicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação de eficácia pré-clínica, especialmente em programas de dor neuropática, onde leituras funcionais objetivas são fundamentais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações espontâneas na locomoção após lesão nervosa.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da classificação automatizada de corridas adequadas e extração consistente de parâmetros.
- Análises: Fornece leituras multivariadas da marcha (por exemplo, duração da fase de apoio, simetria da pegada) que facilitam análises de resposta à dose e de curso temporal.
- Pesquisa Translacional: Conecta déficits locomotores pré-clínicos a biomarcadores clínicos de dor por meio de vias motoras e sensitivas homólogas.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável em diversos projetos de descoberta de analgésicos devido ao seu fluxo de trabalho automatizado e baseado em software.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na caracterização do fenótipo da dor.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio da subtração automatizada do fundo e da classificação de corridas.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir/interromper ao fornecer biomarcadores objetivos e quantificáveis do engajamento de alvos analgésicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em métricas de marcha consistentes e longitudinais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neurociência comportamental e sistemas de rastreamento de movimento baseados em vídeo.
- Depende de iluminação controlada, calibração da passarela e hardware de câmera registrado para detecção precisa das pegadas.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de aclimatação e critérios de seleção de corridas compatíveis.
- A adaptação entre diferentes sistemas modelo pode exigir ajuste no comprimento da passarela e nos limiares de duração.
- As limitações práticas incluem sensibilidade a perturbações ambientais e exclusão de corridas não compatíveis, conforme observado no material de origem.
