Name: De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a imagem de alta resolução da barreira hematoencefálica em camundongos usando seções cerebrais flutuantes e microscopia confocal. Este método permite a quantificação de organelas subcelulares na unidade neurovascular.

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R.V. trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos de pós-doutorado de Roche (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
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<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-387-45524-2_23">Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging</a>. , 453-467 (2006).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
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<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

Os autores estão sob emprego remunerado pela Roche.

O protocolo descrito acima descreve a preparação das seções flutuantes de cérebro, coloração imunofluorescente, aquisição de imagem e parâmetros de análise para a microscopia de alta resolução do BBB. Este método tem sido usado recentemente para investigar a localização do anticorpo entrega plataformas3, o transporte de IgG endógena através do BBB,17e a heterogeneidade do BBB após Pericito perda18. Diferentes etapas do protocolo podem ser modificadas para adaptar-se ao objetivo específico do experimento. Primeiro, o uso de espessura (100 µm) seções facilita a sua manipulação durante os procedimentos de imunocoloração e montagem. Ele também permite a reconstrução 3D da rede capilar, a unidade neurovascular e para a geração de capilar e secções transversais NVU. No entanto, penetração de anticorpos dentro as secções de tecido pode variar e algumas mancha do anticorpo pode ser restrito à camada superficial do tecido perto da lamela. O protocolo pode ser modificado através do aumento da concentração de detergente durante a etapa de permeabilização e/ou o comprimento do passo permeabilização para melhorar a penetração do anticorpo no tecido. Em segundo lugar, a qualidade de imagem pode ser comprometida ao tentar adquirir imagens mais profundas dentro do tecido (geralmente de 20 a 30 µm abaixo da superfície), devido à dispersão da luz, bem como aberrações ópticas de incompatibilidade de índice de refração. Para superar este problema, novos métodos para tecido de compensação e de penetração de anticorpo ativo20 podem ser combinados com este protocolo de imagem maiores volumes de tecido. Em terceiro lugar, deconvolução é realizada após a aquisição de imagens para melhorar a resolução axial da imagem. A escolha do algoritmo de deconvolução cega usado neste protocolo baseou-se (i) a sua facilidade de uso, como sem pre-cálculo da função de ponto-propagação é necessária, (ii) a sua robustez para melhorar a qualidade de imagem21e (iii) a ausência de artefatos na mIgG estruturas intracelulares após a implementação. Dependendo das estruturas intracelulares visualizadas na amostra, outros algoritmos de deconvolução podem resultar em maior qualidade de imagem. As seguintes referências21,22 fornecem uma ampla discussão sobre as vantagens e limitações de algoritmos adicionais para deconvolução da imagem. Finalmente, o uso de um pacote de software de análise de imagem permitiu a segmentação de capilares e estruturas intracelulares em três dimensões. Claramente, análise de imagem não se restringe ao software descrito no protocolo e pacotes alternativos, por exemplo aqueles discutidos em referência23, pode ser usado para imagens de segmento. A adequação dos programas de software diferente para a análise das estruturas intracelulares através do BBB deve ser verificada empiricamente por avaliar a precisão da segmentação de imagens.
Desde que este método é baseado em amostras de fixas, ele não fornece informações directas sobre a dinâmica de transcytosis através do BBB. No entanto, pode ser combinada com as experiências do tempo-curso24, por exemplo por via intravenosa, injetando a molécula de interesse e medindo sua acumulação dentro BECs em pontos diferentes de tempo após a injeção, para reconstruir a cinética de transporte intracelular. A vantagem dessa abordagem é que ela permite a análise de regiões profundas do cérebro, como mostrado em18, que são atualmente inacessíveis para intravital abordagens de imagens ao vivo. Um passo crítico durante o protocolo é o monitoramento cuidadoso de fixação de tecidos. Fixação com 4% PFA reduz drasticamente a imunogenicidade de organelas intracelulares e de imunoglobulinas endógeno ou administrado perifericamente17 (figura 1B). Uma limitação do presente protocolo é sua exigência de qualidade anticorpos(ou seja, baixa mancha não específica, baixa reatividade cruzada) apropriados para imunofluorescência. Desde que tais reagentes estão disponíveis, o método pode ser aplicado para investigar a localização intracelular de qualquer proteína de interesse. Por exemplo, o protocolo foi usado para identificar os lisossomos no cérebro células endoteliais17. Também deve ser notado que, desde que este protocolo baseia-se na microscopia confocal, a resolução lateral é limitada pela difração e não é possível resolver estruturas menores que cerca de 175 a 250 nm (Figura 2).
Estudos anteriores têm realizado uma análise detalhada da composição celular da unidade neurovascular usando microscopia confocal25,26. No entanto, investigar transporte intracelular no BBB se baseia principalmente na utilização de microscopia eletrônica de transmissão19,,27,28. Enquanto esse método oferece a mais alta resolução lateral das estruturas intracelulares, microscopia eletrônica continua a ser uma técnica desafiadora com baixa taxa de transferência. Além disso, o número de diferentes alvos moleculares que podem ser visualizadas por EM é muito limitado. Este protocolo oferece uma alternativa acessível para investigar o transporte intracelular no BBB. O procedimento completo, da coleção do cérebro para análise de imagem, pode ser executado em 5 a 6 dias. Se os anticorpos apropriados estão disponíveis, imunofluorescência permite a detecção simultânea de vários tipos de célula/moléculas dentro da mesma amostra. Além disso, esse protocolo poderia ser combinado com técnicas de microscopia Super-resolução para superar as limitações na resolução espacial29. No geral, o protocolo descrito acima permite a quantificação de alterações a localização intracelular de proteínas de interesse dentro da unidade neurovascular. Sua aplicação para diferentes perturbações genéticas ou farmacológicas permitirá investigar as funções de estrutura e transporte intracelulares do BBB na vivo.

A barreira hemato - encefálica (BBB) é uma barreira celular contínua formada por astrócitos, pericitos, neurônios e células endoteliais que separa a circulação de sangue1sistema nervoso central (SNC). O Regulamento de transporte através do BBB desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do cérebro e é mediado por propriedades especializadas das células endoteliais do cérebro (BECs). A presença de junções intercelulares apertadas entre BECs e uma baixa taxa basal de transcytosis limitar o transporte paracellular e transcellular de moléculas transmitidas pelo sangue, respectivamente2. Recentemente, o caminho de transcytosis na BECs tem sido aproveitado para melhorar a sua prestação de terapêuticas grandes moléculas para o cérebro3,4. No entanto, os mecanismos de transcytosis através do BBB ainda não foram totalmente caracterizado5,6.
Extenso trabalho tem sido feito em vitro para decifrar os mecanismos celulares e moleculares que regulam o transporte intracelular através de BECs7,8,9,10, 11, mas esses sistemas não conseguem recapitular a complexa arquitetura e fisiologia da unidade neurovascular (NVU). Por outro lado, estudos em vivo12,13 fornecem informações quantitativas detalhadas sobre as taxas de transporte através do BBB mas não fornecer insights sobre os mecanismos intracelulares de transporte. Portanto, investigar os componentes celulares e intracelulares do NVU in vivo e ex vivo continua a ser muito desafiador14. Apenas um número limitado de técnicas é aptos para analisar estruturas subcelulares dentro de células do NVU. A maioria dos estudos usar microscopia eletrônica, mas esta técnica é limitada pelos protocolos complexos necessários para a preparação adequada de tecido e manuseio de amostras. Portanto, estabelecemos uma metodologia baseada na microscopia confocal de alta resolução que facilitasse o processamento das amostras de cérebro, a análise e a quantificação dos compartimentos subcellular dentro das células do NVU.
Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza as seções flutuantes cérebro do rato para executar quantitativos de imagem do BBB e NVU a nível celular e subcelular. Temos testado e validado um número de anticorpos para imagem e reconstruir o NVU em três dimensões. Além disso, este protocolo permite imagens com a máxima resolução óptica de difração limitada das organelas dentro de capilares do cérebro. Juntamente com a análise de imagem, este protocolo pode ser usado para investigar o transporte intracelular de macromoléculas através do BBB sob diferentes condições experimentais, por exemplo, em modelos de doença de rato de neurodegeneração.

<table><tbody><tr><td>Clone de anticorpo monoclonal de rato ER-MP12 contra CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Labels Células endoteliais cerebrais Uso na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de rato contra Podocalixina</td><td>R& D Sistemas</td><td>MAB1556</td><td>Rótulos Lúmen de capilares Utilizar na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, utilizado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho contra CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Rótulos Membrana basal dos capilares Utilizar na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-coelho de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de cabra contra CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Rótulos pericitos Uso na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-cabra de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Clone de anticorpo monoclonal de camundongo G-A-5 contra GFAP acoplado a Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Marcadores Astrócitos Uso na diluição 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho contra Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Rótulos Microglia Uso na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de rato ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Rótulos Lisossomos Usar na diluição 1:100 detectar com IgG policlonal anti-rato de burro (H+L) acoplado ao corante AlexaFluor adequado, usado na diluição 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal de burro contra IgG de camundongo (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Uso na diluição 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal de burro contra IgG de camundongo (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Uso na diluição 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal de cabra contra IgG de camundongo (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Uso na diluição 1:400</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman papel de filtro qualitativo prepledido Grau 0858 1/2, cola de</td></tr><tr><td>cianoacrilato</td> granulada <td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Meio de montagem fluorescente</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Meio de montagem fluorescente</td></tr><tr><td>Dako Ratos adultos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J camundongos machos ou fêmeas entre 9 e 19 meses de idade</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>micrótomo de lâmina vibratória Leica VT100S</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X com detectores HyD e laser de luz branca</td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF versão 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Bitplane scientific software</td><td>NA</td><td>Imaris versão 7.6.5 build 31770 para x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

de alta resolução de imagem latente confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3d e quantificação de transcytosis

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

A barreira hemato - encefálica (BBB) é uma interface multicelular dinâmica que regula o transporte de moléculas entre o cérebro e a circulação. Transcytosis do outro lado do BBB regula a entrega de anticorpos terapêuticos, metabólitos e hormônios para o parênquima cerebral. Aqui, apresentamos um protocolo que combina imunofluorescência de seções flutuantes com laser de varredura, microscopia confocal e análise de imagem para visualizar as organelas subcelulares dentro das células endoteliais no BBB. Combinar este conjunto de dados com software de análise de imagem 3D permite a segmentação semi-automática e quantificação do volume capilar e área de superfície, bem como o número e intensidade das organelas intracelulares no BBB. A detecção de rato endógeno da imunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares e sua quantificação no BBB é usada para ilustrar o método. Este protocolo potencialmente pode ser aplicado para a investigação dos mecanismos de controlo BBB transcytosis de moléculas diferentes em vivo.

Como exemplos representativos das imagens obtidas no protocolo descrito aqui, seções de cérebro de rato foram coradas com anticorpos reconhecer diferentes componentes do NVU, incluindo a membrana basal, astrócitos, pericitos e células endoteliais (ver Tabela de materiais para anticorpos específicos utilizados) (Figura 1A, D e E). Com essa resolução, é possível distinguir os processos individuais de hamartomas e ponta-pés que estão em contato direto com os capilares.
Para destacar a adequação deste protocolo para a detecção de estruturas intracelulares, seções de cérebro de animais perifericamente injetados com o de anticorpo humano anti-Tau mAb8616 estavam manchadas com um fluorescente etiquetado anticorpos anti-humano ( Figura 1B). mAb86 é conhecido por especificamente os neurônios alvo expressando uma forma patológica de Tau16. Usando o protocolo descrito neste documento, o mAb86 foi detectada com resolução de difração limitada dentro de estruturas vesiculares individuais dentro de neurônios (Figura 1B-C). Além disso, o mouse endógeno IgG foi detectado nas estruturas intracelulares dentro das células endoteliais, mas não em pericitos (Figura 1D-E e Figura 2).
A aquisição de z-pilhas confocal de alta resolução da vasculatura cerebral permite a segmentação tridimensional dos capilares e vesículas intracelulares no BBB. A Figura 2 mostra um exemplo do processo de renderização e segmentar um capilar rotulado com CollagenIV e mouse IgG-positivo intracelulares vesículas. Através da quantificação por exemplo um conjunto de dados completo de imagens segmentadas, medindo-se o número de vesículas por volume capilar, é possível estudar mudanças nos processos de transporte intracelular sob diferentes condições. Figura 3 B-C mostra as diferenças em mIgG vesículas número e fluorescência intensidade correspondente a mIgG no parênquima cerebral, respectivamente, após esgotamento do Pericito no modelo de pdgf-bret/ret rato como relatado anteriormente 17. a mesma abordagem também recentemente foi usada para analisar as alterações no transporte intracelular no BBB entre cerebrais diferentes regiões18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figura 1: Rotulagem de vários tipos de células e estruturas subcelulares do neurovascular unidade Imagens representativas da unidade neurovascular (A e D) e vesículas intracelulares contidas em (B) de neurônios ou células endoteliais (E) obtidas com este protocolo. A imagem de projeção de intensidade máxima na A (topo) mostra a distribuição de astrócitos GFAP positivo (vermelhos) ao redor de capilares classificados pelo CollagenIV (verdes). As setas apontam para processos individuais hamartomas. Barra de escala = 20 µm. Com essa resolução, os processos individuais astrocyte e ponta-pés são claramente visíveis, como mostra a imagem ampliada da região in a box (parte inferior). Pontas de seta apontam para hamartomas ponta-pés. Barra de escala = 10 µm. A imagem em B mostra o acúmulo de um anticorpo perifericamente-injetado, mAb86 (verde), dentro de um neurônio hippocampal. Pontas de seta apontam para individuais vesículas mAb86-positivo. Barra de escala = 10 µm. O gráfico em C mostra a intensidade do perfil de linha de uma única vesícula. O tamanho da vesícula foi estimado pela largura total no máximo metade de um ajuste Gaussian (linha preta sólida) da curva de intensidade (linha verde e círculos). As imagens em D mostram uma reconstrução tridimensional de uma célula endotelial (verde), rodeada por um Pericito (vermelho) dentro da lâmina basal (CollagenIV, cinzento). Os painéis inferiores mostram os canais individuais de fluorescência. Barra de escala = 10 µm. As imagens E mostrar a localização do mIgG (vermelho) em vesículas intracelulares dentro das células endoteliais (à esquerda do painel, CD31 em verde) mas não em pericitos (painel à direita, CD13 em verde). Em todas as imagens, DAPI manchado núcleos são mostrados em azul. Barra de escala = 5 µm. painéis D e E foram modificadas da referência17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figura 2 : Renderização tridimensional de capilares e vesículas intracelulares na barreira sangue - cérebro. Com o protocolo descrito, de alta resolução imagens confocal de capilares CollagenIV-positivo (verdes) e rato IgG vesículas intracelulares (vermelho) foram adquiridas (A). O painel esquerdo mostra uma única secção óptica com secções transversais. As setas apontam para individuais mIgG-positivo vesículas dentro das células endoteliais do cérebro. O painel sobre a reconstrução da direita mostra o 3D da z-pilha cheia usando software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais). O volume capilar (B) e vesículas individuais (C) foram processadas em três dimensões e quantificados usando o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais). Em todas as imagens, DAPI manchado núcleos são mostrados em azul. Escala de barras = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figura 3 : Quantificação da mIgG localização intracelular no BBB. Imagens representativas mostrando (A) reconstruções tridimensionais dos capilares (rotulados com collagenIV, verde) e a distribuição da mIgG (vermelho) em camundongos C57BL/6 e em Pericito pdgf-bret/ret empobrecido ratos anteriormente descritos em19. Barras de escala = 10 µm. As imagens em B mostram a segmentação das vesículas intracelulares dentro da máscara de CollagenIV. The gráfico em B mostra a quantificação e comparação do número de vesículas mIgG por volume de capilar. Cada ponto representa medições de segmentos individuais capilares. A linha contínua mostra a média e as barras de erro representam o desvio padrão dos dados. As imagens em C mostrar o sinal de fluorescência mIgG fora a máscara de CollagenIV. Da mesma forma, o gráfico em C mostra a quantificação e comparação da intensidade de fluorescência mIgG no parênquima cerebral entre camundongos C57BL/6 e pdgf-bret/ret ratos Pericito empobrecido. Unidades de intensidade de fluorescência foram normalizadas pela intensidade média mIgG parênquima medida em todos os camundongos C57BL/6. Esta figura foi modificada da referência17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e reconstrução tridimensional da barreira hematoencefálica do camundongo. Ele combina imunofluorescência de seções flutuantes com microscopia confocal para analisar organelas subcelulares dentro das células endoteliais cerebrais. Este método adiciona a preparação de seções de flutuação livre do cérebro, coloração de imunofluorescência, aquisição de imagens e parâmetros de análise para microscopia de alta resolução da barreira hematoencefálica. A principal vantagem da técnica é que ela permite a quantificação de organelas subcelulares dentro das células da unidade neurovascular. Demonstrando o procedimento estará Roberto Villase

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Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

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