Imagens ao vivo da proteína GLUT4 tráfico de Mouse de neurônios hipotálamo primário usando microscopia de deconvolução
7 de dezembro de 2017
Este protocolo descreve uma técnica para observação de tempo real verde fluorescência proteína (GFP) com a tag 4 de transportador de glicose (GLUT4) proteína tráfico após estimulação da insulina e caracterização da função biológica de CCR5 na insulina – GLUT4 sinalização via com microscopia de deconvolução.
O objetivo geral deste experimento é observar o tráfego de proteínas em tempo real em células neuronais primárias, como GLUT4, em neurônios hipotalâmicos com danos mínimos. Este método pode explicar questões-chave relacionadas à regulação neuronal da sinalização e metabolismo da insulina, como no caso do diabetes mellitus tipo 2. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem isolar culturas de células primárias e observar o efeito induzido pela droga em tempo real.
A implicação dessa técnica é escolher uma terapia para diabetes tipo 2 ou resistência à insulina relacionada ao cérebro, porque agora sabemos como esse sinal de insulina está sendo alterado pela quimiocina CCL5 em neurônios hipotalâmicos. Para iniciar este procedimento, cubra as placas de cultura com lisina poli-D um dia antes da cultura. Para um prato de seis poços, adicione 1,5 mL de lisina poli-D a 0,05 mg / mL a cada poço.
No dia seguinte, remova a lisina poli-D e lave a louça duas vezes com 2 mL de ddH2O. Em seguida, encha as placas de Petri de 10 cm com 20 mL de meio de lavagem e mantenha-as no gelo. Encha os tubos de 15 mL com meio de lavagem e mantenha-os no gelo.
Para isolamento do tecido cerebral, esterilize a plataforma, o microscópio de dissecação e as ferramentas cirúrgicas com etanol a 75% para evitar contaminação. Depois disso, corte ao redor da área do cordão umbilical para isolar os filhotes sem danificá-los. Em seguida, remova a cabeça de cada filhote e prenda-a no lugar usando a pinça reta de ponta fina.
Use outra pinça curva de ponta fina para remover a pele externa e o crânio de ambos os lados e retire-os da direção anterior para a dorsal. Em seguida, mantenha os cérebros isolados em uma placa de Petri limpa com meio de lavagem gelada. Vire o cérebro e mantenha o lado ventral para cima.
Em seguida, isole o tecido hipotalâmico com uma pinça curva de ponta fina. Segure o lobo olfatório com a pinça afiada e retire as meninges finas que circundam todo o cérebro com a pinça curva. Vire para a parte inferior do córtex e separe o hipocampo do córtex, puxando-o para o lado.
Quando todas as regiões do cérebro estiverem isoladas, pique esses tecidos nos tubos de 15 ml contendo meio de lavagem gelada. Neste procedimento, enxágue os tecidos invertendo o tubo contendo tecido duas a três vezes. Em seguida, mantenha o tubo reto para permitir que os tecidos se acalmem.
Remova o meio superior usando a pipeta Pasteur de vidro conectada a um sistema de vácuo. Para lavar o tecido, adicione 15 mL de meio de lavagem a frio e inverta o tubo duas a três vezes. Após a lavagem final, remova o meio de lavagem com a ajuda de uma pipeta de 1 mL.
Incube os tecidos com tampão de digestão de papaína-tripsina em banho-maria a 37 graus Celsius por sete a 14 minutos. Em seguida, neutralize a atividade das enzimas adicionando um volume de soro fetal bovino. Mantenha o tubo na prateleira e aguarde de um a dois minutos para permitir que os tecidos se acalmem.
Em seguida, remova o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta de 1 mL. Adicione 6 mL de meio de revestimento no tubo de ensaio e pipete o tecido para cima e para baixo 50 vezes suavemente com uma pipeta de 5 mL. Mantenha o tubo no rack e espere de um a dois minutos para permitir que os tecidos grossos e não dissociados se acalmem.
Em seguida, transfira a fase superior contendo células dissociadas para um novo tubo e dilua-o com meio de plaqueamento. Em seguida, adicione 2 mL de meio de cultura completo em cada poço do prato de seis poços. Para preparar as células para imagens ao vivo, remova cuidadosamente as lamínulas com neurônios usando uma pinça e coloque-as na lâmina de vidro com cuidado.
Em seguida, remova o excesso de meio com lenços delicados, dobrando-os duas vezes e colocando-os cuidadosamente na lamínula sem movê-la. É essencial remover o excesso de meio para evitar movimentos desnecessários na lamínula. Em seguida, trate as amostras de células selecionadas com CCL5 a 10 ng/mL ou insulina a 10 unidades/mL por um minuto.
Em seguida, adicione 1,5 mcL de insulina diluída na borda das lamínulas. Em seguida, adicione óleo de imersão em uma lente objetiva de 60 vezes com ampliação de 1,52 NA. Em seguida, coloque as lamínulas no microscópio de deconvolução com as lamínulas voltadas para baixo e presas corretamente.
Use iluminação de campo claro ou fluorescência para identificar as células-alvo. Depois, ajuste o foco até que as células-alvo possam ser claramente observadas. Não mova a lente objetiva para fora da área da lamínula para evitar arranhões desnecessários.
Em seguida, identifique GFP-GLUT4 pelo sinal GFP. Em seguida, identifique as células-alvo desejadas para aquisição de imagens. Em seguida, defina os parâmetros experimentais adequados em cada célula-alvo, incluindo número de pixels, comprimento de onda de excitação, porcentagem de transmissão, tempo de exposição, espessura da pilha, intervalo de tempo e tempo total de imagem.
Ajuste o parâmetro de exposição para aproximadamente 2000 a 3000 contagens para obter a intensidade máxima de pixels. Para minimizar o branqueamento fotográfico de fluorescência, reduza a porcentagem de transmissão de luz de excitação o máximo possível, mantendo o tempo de exposição inferior a um segundo. Defina o limite superior e inferior da pilha Z em cada célula-alvo movendo a platina do microscópio até que a parte superior e inferior da célula-alvo estejam ligeiramente fora de foco.
É muito importante minimizar o branqueamento da foto fluorescente na morte dos neurônios após a imagem da luz. Esta figura mostra que os neurônios hipotalâmicos primários cultivados foram marcados com o marcador de neurônio MAP2. O marcador neuronal hipotalâmico POMC e sua co-expressão de CCR5.
A imagem co-localizada mostra que o CCL5 é expresso em neurônios hipotalâmicos positivos para POMC. Essas imagens mostram a expressão da proteína GFP-GLUT4 em neurônios hipotalâmicos do tipo selvagem e neurônios hipotalâmicos CCR5 duplo-negativos. Os neurônios foram estimulados com insulina ou CCL5.
As setas apontam para o pontilhado GFP-GLUT4 na neurite antes ou depois da estimulação com insulina ou CCL5, e os asteriscos indicam a superfície GLUT4-GFP antes ou depois da estimulação CCL5. Uma vez dominada, esta gravação de laboratório da técnica de células primárias pode ser feita entre uma a quatro horas, dependendo dos requisitos do experimento e se é feita corretamente. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo da neurociência explorarem a possibilidade de caracterizar o efeito imediato induzido por drogas na cultura de células primárias.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar um neurônio hipotalâmico primário, um neurônio do hipocampo e um neurônio cortical. Além do laboratório, você também pode saber como realizar uma gravação ao vivo da molécula serial em diferentes estímulos. Não se esqueça de colocar o jaleco e as luvas e usar etanol com frequência para evitar a contaminação por bactérias e fungos de animais.
Também tenha muito cuidado ao lidar com lamínulas e neurônios durante todo o procedimento.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para observar em tempo real o tráfego do Transportador de Glicose 4 (GLUT4) marcado com GFP em células neuronais hipotalâmicas primárias após estimulação com insulina. Também explora o papel do CCR5 na via de sinalização insulina–GLUT4, contribuindo com insights sobre a regulação neuronal da sinalização da insulina e do metabolismo, relevante para o diabetes tipo 2.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Endocrinologia
Contexto
- O estudo foca nos mecanismos de transporte do GLUT4 em resposta à insulina.
- Aborda questões comportamentais e metabólicas relacionadas ao diabetes melito tipo 2.
- O envolvimento do CCR5 na sinalização da insulina fornece novas possibilidades terapêuticas.
- Culturas primárias de células neuronais permitem danos mínimos durante a experimentação.
Objetivo do Estudo
- Investigar a dinâmica do tráfego de GLUT4 em resposta à insulina.
- Avaliar o papel do CCR5 na via de sinalização da insulina.
- Ampliar a compreensão das influências neuronais sobre a regulação da insulina.
Métodos Utilizados
- Utilizou-se culturas primárias de neurônios hipotalâmicos para imagem em tempo real.
- O isolamento de tecidos cerebrais de filhotes foi realizado em condições estéreis.
- A imagem em tempo real foi realizada por microscopia de desconvolução para rastrear o tráfego de GLUT4.
- As células foram tratadas com insulina e CCL5 durante a aquisição de imagens para observar os efeitos.
- Ajustes-chave nos parâmetros experimentais foram feitos para minimizar o fotoenvelhecimento.
Resultados Principais
- O tráfego de GFP-GLUT4 foi visualizado em resposta à estimulação por insulina e CCL5.
- As observações indicaram co-localização de CCR5 com marcadores neuronais, afetando o transporte de GLUT4.
- Esta pesquisa revela possível desregulação nos mecanismos de sinalização da insulina devido ao CCR5.
- Os resultados destacam interações cruciais entre sinalização neuronal e metabolismo.
Conclusões
- O estudo permite a observação em tempo real do tráfego de GLUT4 induzido por insulina em neurônios.
- Os achados enfatizam o papel do CCR5, sugerindo direções terapêuticas para o diabetes tipo 2.
- As implicações se estendem para a compreensão dos mecanismos neuronais que influenciam distúrbios metabólicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização em tempo real do tráfego de GLUT4 em neurônios hipotalâmicos primários, fornecendo subsídios mecanicistas sobre a disregulação da sinalização insulínica relevante para o diabetes tipo 2. Ao associar a sinalização de quimiocinas (CCL5) à dinâmica neuronal dos transportadores de glicose, ele apoia a validação de alvos em vias de doenças metabólicas do SNC. A abordagem reduz os riscos de hipóteses iniciais ao fornecer dados quantitativos, em células vivas, sobre a translocação proteica sob estimulação controlada.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar a relação funcional entre CCR5 e a translocação de GLUT4 estimulada por insulina em neurônios hipotalâmicos.
- Valor Operacional: Permite a observação direta da dinâmica proteica em células primárias, reduzindo a dependência de sistemas substitutos.
- Valor Preditivo: Apoia a desmistificação mecanicista de alvos do SNC envolvidos na regulação metabólica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da eficiência de translocação da GLUT4 à membrana após estimulação por insulina ou quimiocinas.
- Valor Operacional: Estabelece um ensaio reprodutível de imagem em tempo real para rastrear a dinâmica de transportadores em modelos neuronais.
- Prontidão do Ensaio: Fornece dados com resolução espacial e em sequência temporal, adequados para o perfil de efeitos de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona desequilíbrios periféricos de quimiocinas com defeitos no sinalização central da insulina em um modelo neuronal relevante para a doença.
- Valor Operacional: Utiliza neurônios hipotalâmicos primários de modelos selvagens e deficientes em CCR5 para avaliar respostas dependentes do genótipo.
- Continuidade Tradutiva: Conecta achados in vitro à fisiopatologia in vivo da obesidade e do diabetes tipo 2.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial, apoiando a validação de hipóteses antes da identificação de compostos líderes e testes de eficácia pré-clínica em programas de doenças metabólicas.
- Biologia da Descoberta: Testa as ligações mecanicistas entre receptores de quimiocinas e o transporte de glicose regulado por insulina em neurônios.
- Triagem: Fornece desfechos quantitativos baseados em imagens para avaliar os efeitos de compostos no tráfego de GLUT4.
- Análises: Oferece medições baseadas em intensidade de pontos de GFP-GLUT4 e localização na membrana para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a modelos pré-clínicos utilizando neurônios primários que refletem os padrões de coexpressão neuronal de CCR5 e POMC.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalonável de imagem em tempo real aplicável a outros transportadores ou receptores marcados fluorescentemente em culturas neuronais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em hipóteses de alvo ao visualizar dinâmicas proteicas em tempo real em células fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de imagem em células vivas com parâmetros definidos de excitação, exposição e aquisição em z para minimizar o fotoenvelhecimento.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao revelar se um alvo modula a sinalização da insulina em populações neuronais-chave.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapias metabólicas direcionadas ao SNC com base em evidências mecanicistas obtidas de modelos neuronais relevantes para humanos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de neurônios primários, manipulação estéril de tecidos e microscopia de fluorescência em células vivas.
- Depende do acesso a sistemas de microscopia de desconvolução com objetivas de imersão em óleo de 60x e controles ambientais.
- Necessita padronização entre equipes para preparo celular, tempo de estimulação e parâmetros de aquisição de imagens.
- Deve levar em conta a variabilidade na eficiência de transfeção de células primárias e na expressão basal de GLUT4 ao comparar condições.
- Limitado pelos riscos de fototoxicidade durante imagens prolongadas, mitigados pela otimização da intensidade de excitação e do tempo de exposição conforme descrito no protocolo.
