Análise do ciclo celular
O ciclo celular refere-se ao conjunto de processos celulares e bioquímicos que ocorrem dentro de uma célula que leva à sua divisão. Uma célula passa por diferentes estágios do ciclo, e o tempo necessário para completar esse processo é quase constante para um tipo de célula. Qualquer desvio desta duração é indicativo de divisão celular anormal. Portanto, a análise do ciclo celular torna-se uma ferramenta muito útil para biólogos interessados em estudar mecanismos de divisão celular, o que, em última análise, ajudará no tratamento de pacientes com doenças como o câncer, em que o ciclo celular é interrompido.
Este vídeo discutirá o princípio e um protocolo generalizado de análise do ciclo celular. Por fim, mostraremos algumas aplicações deste método comumente usado.
Vamos aprender o que é a análise do ciclo celular, e como esse ensaio funciona.
Essencialmente, a análise do ciclo celular de uma população mista nos diz quantas células estão em cada uma das diferentes fases. Isso é mais comumente feito avaliando o conteúdo de DNA da célula. Você pode pensar: por que o conteúdo de DNA? Para entender isso, vamos rever brevemente o que acontece com o DNA cromossômico à medida que uma célula progride ao longo do ciclo.
Durante a fase G1, o conteúdo de DNA dentro de uma célula não muda. Através da fase S, a replicação do DNA ocorre, e no final desta fase o conteúdo de DNA é dobrado. Na fase G2, as células verificam se não há erros na duplicação do DNA e, finalmente, no final da fase M, esse DNA é dividido igualmente em duas células filhas. Portanto, rotular DNA pode ajudar um cientista a determinar o estágio do ciclo celular.
Uma consideração importante para esta rotulagem é a escolha do corante de ligação de DNA. Bromodeoxyuridina, ou BrdU, é um ácido nucleico analógico e imita estruturalmente a timmidina. Isso permite que brdU incorpore na cadeia crescente durante a replicação do DNA. Portanto, este corante rotula as células apenas na fase S. Após a incorporação da BrdU, os fios de DNA são separados, e brdU é detectado com a ajuda de anticorpos fluorescentes marcados.
Outros compostos, como o iodeto de propídio ou PI, que é inerentemente fluorescente, intercalam entre ácidos nucleicos duplos e, portanto, mancham células em todos os estágios. No entanto, a quantidade de coloração de PI é proporcional à quantidade de DNA.
Embora a seleção de uma mancha dependa do experimento em questão, os pesquisadores muitas vezes usam procedimentos de coloração dupla. Moléculas como pi que se ligam proporcionalmente a todas as células podem facilmente diferenciar células G1 das células de fase G2 ou M. No entanto, as células de fase S ainda estão em transição. Portanto, a adição de moléculas como a BrdU que só rotulam células de fase S aumentam a especificidade da detecção do estágio de ciclo celular. Finalmente, as células são analisadas usando citometria de fluxo para enumerar células em diferentes estágios de ciclo celular.
Agora que você entende os princípios por trás da coloração do ciclo celular, vamos discutir um procedimento usando BrdU e PI.
Configure pratos de cultura celular: um para o experimento, e três adicionais como controles. Com cerca de 60% de confluência, a RU dissolvida nos meios culturais é adicionada às células vivas, seguida pela incubação. Nesta fase, brdU é incorporado dentro do DNA replicante.
Após a incubação, as células são centrifugadas e resuspengiadas em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou PBS. Em seguida, as células são fixadas adicionando suspensão celular dropwise ao frio do gelo 70% etanol enquanto vórtices suavemente. Isso cessa a divisão celular e evita a aglomeração.
As células fixas são novamente centrifugadas e resuspendidas em PBS. Em seguida, uma solução de ácido concentrado contendo um detergente, como Triton-X, é adicionada às células dropwise. O detergente permeabiliza as células para permitir a entrada de compostos impermeáveis por membrana, e o ácido diminui o pH e denatura o DNA, expondo BrdU. As células são então centrifugadas, supernadante é descartada, e a pelota é resuspendida em solução alcalina para restaurar o pH.
Por fim, as células são lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo BrdU conjugado a uma etiqueta fluorescente à temperatura ambiente. Após esta etapa, as amostras devem ser protegidas contra a luz para evitar fotobleaching.
Quando a coloração dupla, as células são incubadas com PI e RNase. RNase é necessário para remover fios duplos RNA-RNA ou RNA-DNA, que também se ligam ao PI e podem produzir resultados falsos positivos. As células são então passadas através de um coador de células para fazer uma suspensão celular única, o que é necessário para análise citométrica de fluxo.
Agora que você aprendeu o protocolo de coloração, vamos rever como analisar os dados obtidos.
Resumidamente, na citometria de fluxo um raio laser brilha em um fluxo estreito de suspensão de célula única, e a emissão em determinados comprimentos de onda dos corantes em cada célula é detectada como um único evento em um gráfico de dispersão.
Aqui, o lote de dispersão de células manchadas de PI mostram dois aglomerados distintos, um com quase o dobro da quantidade de PI do que o outro. Após a otimização do detector pi, esses conjuntos aparecem como dois picos em uma análise histograma. O pico em maior intensidade de PI representa células G2/M, e o de menor intensidade representa as células G1. As áreas sob esses picos representam o número de células nas fases correspondentes.
Da mesma forma, os eventos BrdU-FITC podem ser exibidos em uma análise histograma em uma escala logarítmica. Esta trama mostra que as células positivas de BrdU são distintamente mais brilhantes do que as células não manchadas, e como apenas uma fração da população está na fase S, um pico maior de células não manchadas de BrdU pode ser visto.
O gráfico de dispersão de células manchadas com BrdU e PI pode ser exibido com PI no eixo X linear e BrdU no eixo Y logarítmico, e isso mostra um padrão de ferradura indo de G1, S, para G2. A proporção de células nas áreas fechadas pode ser determinada e exibida em um gráfico de barras.
Agora que passamos pelo protocolo básico para análise de ciclo celular, vamos ver como ele pode ser usado em várias configurações experimentais.
Um. Ao combinar manipulações genéticas com a análise do ciclo celular, os cientistas estudam papéis de proteínas específicas na progressão do ciclo celular. Neste estudo, os cientistas superexpressaram uma proteína chamada p27 em fibroblastos embrionários de camundongos. Os resultados demonstram que a superexpressão levou a um menor número de células na fase S, indicando que essa proteína desempenha um papel crítico na regulação do ciclo celular.
Usando a análise do ciclo celular, os cientistas podem comparar cinética de progressão. Aqui, foram comparadas cinéticas de progressão entre duas linhas de células cancerígenas colorretais e uma linha celular contra o câncer de mama. Os resultados demonstraram que as células cancerígenas de mama progrediram através do ciclo celular a uma taxa mais lenta em comparação com as linhas celulares colorretais, dada a maior porcentagem de células cancerígenas de mama no G1 ao longo do tempo.
Por fim, para análise do ciclo de células in vivo, a BrdU pode ser injetada em roedores e a população celular alvo pode ser isolada para análise do ciclo celular. Neste estudo, as células-tronco hematopoiéticas ou HSCs de camundongos injetados por BrdU foram isoladas para análise citométrica de fluxo. Os dados coletados revelaram a distribuição de HSCs entre diferentes estágios de ciclo celular com predominância na fase G1 e S.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE na análise do ciclo celular. Revisamos os princípios por trás desse processo, detalhamos um protocolo passo a passo e revisamos como esse tipo de análise é usada em várias configurações experimentais. Como sempre, obrigado por assistir!
O ciclo celular refere-se ao conjunto de eventos através dos quais uma célula cresce, replica seu genoma e, finalmente, se divide em duas células filh…
O ciclo celular refere-se ao conjunto de processos celulares e bioquímicos que ocorrem dentro de uma célula que leva à sua divisão. Uma célula passa por diferentes estágios do ciclo, e o tempo necessário para completar esse processo é quase constante para um tipo de célula. Qualquer desvio desta duração é indicativo de divisão celular anormal. Portanto, a análise do ciclo celular torna-se uma ferramenta muito útil para biólogos interessados em estudar mecanismos de divisão celular, o que, em última análise, ajudará no tratamento de pacientes com doenças como o câncer, em que o ciclo celular é interrompido.
Este vídeo discutirá o princípio e um protocolo generalizado de análise do ciclo celular. Por fim, mostraremos algumas aplicações deste método comumente usado.
Vamos aprender o que é a análise do ciclo celular, e como esse ensaio funciona.
Essencialmente, a análise do ciclo celular de uma população mista nos diz quantas células estão em cada uma das diferentes fases. Isso é mais comumente feito avaliando o conteúdo de DNA da célula. Você pode pensar: por que o conteúdo de DNA? Para entender isso, vamos rever brevemente o que acontece com o DNA cromossômico à medida que uma célula progride ao longo do ciclo.
Durante a fase G1, o conteúdo de DNA dentro de uma célula não muda. Através da fase S, a replicação do DNA ocorre, e no final desta fase o conteúdo de DNA é dobrado. Na fase G2, as células verificam se não há erros na duplicação do DNA e, finalmente, no final da fase M, esse DNA é dividido igualmente em duas células filhas. Portanto, rotular DNA pode ajudar um cientista a determinar o estágio do ciclo celular.
Uma consideração importante para esta rotulagem é a escolha do corante de ligação de DNA. Bromodeoxyuridina, ou BrdU, é um ácido nucleico analógico e imita estruturalmente a timmidina. Isso permite que brdU incorpore na cadeia crescente durante a replicação do DNA. Portanto, este corante rotula as células apenas na fase S. Após a incorporação da BrdU, os fios de DNA são separados, e brdU é detectado com a ajuda de anticorpos fluorescentes marcados.
Outros compostos, como o iodeto de propídio ou PI, que é inerentemente fluorescente, intercalam entre ácidos nucleicos duplos e, portanto, mancham células em todos os estágios. No entanto, a quantidade de coloração de PI é proporcional à quantidade de DNA.
Embora a seleção de uma mancha dependa do experimento em questão, os pesquisadores muitas vezes usam procedimentos de coloração dupla. Moléculas como pi que se ligam proporcionalmente a todas as células podem facilmente diferenciar células G1 das células de fase G2 ou M. No entanto, as células de fase S ainda estão em transição. Portanto, a adição de moléculas como a BrdU que só rotulam células de fase S aumentam a especificidade da detecção do estágio de ciclo celular. Finalmente, as células são analisadas usando citometria de fluxo para enumerar células em diferentes estágios de ciclo celular.
Agora que você entende os princípios por trás da coloração do ciclo celular, vamos discutir um procedimento usando BrdU e PI.
Configure pratos de cultura celular: um para o experimento, e três adicionais como controles. Com cerca de 60% de confluência, a RU dissolvida nos meios culturais é adicionada às células vivas, seguida pela incubação. Nesta fase, brdU é incorporado dentro do DNA replicante.
Após a incubação, as células são centrifugadas e resuspengiadas em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou PBS. Em seguida, as células são fixadas adicionando suspensão celular dropwise ao frio do gelo 70% etanol enquanto vórtices suavemente. Isso cessa a divisão celular e evita a aglomeração.
As células fixas são novamente centrifugadas e resuspendidas em PBS. Em seguida, uma solução de ácido concentrado contendo um detergente, como Triton-X, é adicionada às células dropwise. O detergente permeabiliza as células para permitir a entrada de compostos impermeáveis por membrana, e o ácido diminui o pH e denatura o DNA, expondo BrdU. As células são então centrifugadas, supernadante é descartada, e a pelota é resuspendida em solução alcalina para restaurar o pH.
Por fim, as células são lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo BrdU conjugado a uma etiqueta fluorescente à temperatura ambiente. Após esta etapa, as amostras devem ser protegidas contra a luz para evitar fotobleaching.
Quando a coloração dupla, as células são incubadas com PI e RNase. RNase é necessário para remover fios duplos RNA-RNA ou RNA-DNA, que também se ligam ao PI e podem produzir resultados falsos positivos. As células são então passadas através de um coador de células para fazer uma suspensão celular única, o que é necessário para análise citométrica de fluxo.
Agora que você aprendeu o protocolo de coloração, vamos rever como analisar os dados obtidos.
Resumidamente, na citometria de fluxo um raio laser brilha em um fluxo estreito de suspensão de célula única, e a emissão em determinados comprimentos de onda dos corantes em cada célula é detectada como um único evento em um gráfico de dispersão.
Aqui, o lote de dispersão de células manchadas de PI mostram dois aglomerados distintos, um com quase o dobro da quantidade de PI do que o outro. Após a otimização do detector pi, esses conjuntos aparecem como dois picos em uma análise histograma. O pico em maior intensidade de PI representa células G2/M, e o de menor intensidade representa as células G1. As áreas sob esses picos representam o número de células nas fases correspondentes.
Da mesma forma, os eventos BrdU-FITC podem ser exibidos em uma análise histograma em uma escala logarítmica. Esta trama mostra que as células positivas de BrdU são distintamente mais brilhantes do que as células não manchadas, e como apenas uma fração da população está na fase S, um pico maior de células não manchadas de BrdU pode ser visto.
O gráfico de dispersão de células manchadas com BrdU e PI pode ser exibido com PI no eixo X linear e BrdU no eixo Y logarítmico, e isso mostra um padrão de ferradura indo de G1, S, para G2. A proporção de células nas áreas fechadas pode ser determinada e exibida em um gráfico de barras.
Agora que passamos pelo protocolo básico para análise de ciclo celular, vamos ver como ele pode ser usado em várias configurações experimentais.
Um. Ao combinar manipulações genéticas com a análise do ciclo celular, os cientistas estudam papéis de proteínas específicas na progressão do ciclo celular. Neste estudo, os cientistas superexpressaram uma proteína chamada p27 em fibroblastos embrionários de camundongos. Os resultados demonstram que a superexpressão levou a um menor número de células na fase S, indicando que essa proteína desempenha um papel crítico na regulação do ciclo celular.
Usando a análise do ciclo celular, os cientistas podem comparar cinética de progressão. Aqui, foram comparadas cinéticas de progressão entre duas linhas de células cancerígenas colorretais e uma linha celular contra o câncer de mama. Os resultados demonstraram que as células cancerígenas de mama progrediram através do ciclo celular a uma taxa mais lenta em comparação com as linhas celulares colorretais, dada a maior porcentagem de células cancerígenas de mama no G1 ao longo do tempo.
Por fim, para análise do ciclo de células in vivo, a BrdU pode ser injetada em roedores e a população celular alvo pode ser isolada para análise do ciclo celular. Neste estudo, as células-tronco hematopoiéticas ou HSCs de camundongos injetados por BrdU foram isoladas para análise citométrica de fluxo. Os dados coletados revelaram a distribuição de HSCs entre diferentes estágios de ciclo celular com predominância na fase G1 e S.
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O ciclo celular refere-se ao conjunto de processos celulares e bioquímicos que ocorrem dentro de uma célula que leva à sua divisão. Uma célula passa por diferentes estágios do ciclo, e o tempo necessário para completar esse processo é quase constante para um tipo de célula. Qualquer desvio desta duração é indicativo de divisão celular anormal. Portanto, a análise do ciclo celular torna-se uma ferramenta muito útil para biólogos interessados em estudar mecanismos de divisão celular, o que, em última análise, ajudará no tratamento de pacientes com doenças como o câncer, em que o ciclo celular é interrompido.
Este vídeo discutirá o princípio e um protocolo generalizado de análise do ciclo celular. Por fim, mostraremos algumas aplicações deste método comumente usado.
Vamos aprender o que é a análise do ciclo celular, e como esse ensaio funciona.
Essencialmente, a análise do ciclo celular de uma população mista nos diz quantas células estão em cada uma das diferentes fases. Isso é mais comumente feito avaliando o conteúdo de DNA da célula. Você pode pensar: por que o conteúdo de DNA? Para entender isso, vamos rever brevemente o que acontece com o DNA cromossômico à medida que uma célula progride ao longo do ciclo.
Durante a fase G1, o conteúdo de DNA dentro de uma célula não muda. Através da fase S, a replicação do DNA ocorre, e no final desta fase o conteúdo de DNA é dobrado. Na fase G2, as células verificam se não há erros na duplicação do DNA e, finalmente, no final da fase M, esse DNA é dividido igualmente em duas células filhas. Portanto, rotular DNA pode ajudar um cientista a determinar o estágio do ciclo celular.
Uma consideração importante para esta rotulagem é a escolha do corante de ligação de DNA. Bromodeoxyuridina, ou BrdU, é um ácido nucleico analógico e imita estruturalmente a timmidina. Isso permite que brdU incorpore na cadeia crescente durante a replicação do DNA. Portanto, este corante rotula as células apenas na fase S. Após a incorporação da BrdU, os fios de DNA são separados, e brdU é detectado com a ajuda de anticorpos fluorescentes marcados.
Outros compostos, como o iodeto de propídio ou PI, que é inerentemente fluorescente, intercalam entre ácidos nucleicos duplos e, portanto, mancham células em todos os estágios. No entanto, a quantidade de coloração de PI é proporcional à quantidade de DNA.
Embora a seleção de uma mancha dependa do experimento em questão, os pesquisadores muitas vezes usam procedimentos de coloração dupla. Moléculas como pi que se ligam proporcionalmente a todas as células podem facilmente diferenciar células G1 das células de fase G2 ou M. No entanto, as células de fase S ainda estão em transição. Portanto, a adição de moléculas como a BrdU que só rotulam células de fase S aumentam a especificidade da detecção do estágio de ciclo celular. Finalmente, as células são analisadas usando citometria de fluxo para enumerar células em diferentes estágios de ciclo celular.
Agora que você entende os princípios por trás da coloração do ciclo celular, vamos discutir um procedimento usando BrdU e PI.
Configure pratos de cultura celular: um para o experimento, e três adicionais como controles. Com cerca de 60% de confluência, a RU dissolvida nos meios culturais é adicionada às células vivas, seguida pela incubação. Nesta fase, brdU é incorporado dentro do DNA replicante.
Após a incubação, as células são centrifugadas e resuspengiadas em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou PBS. Em seguida, as células são fixadas adicionando suspensão celular dropwise ao frio do gelo 70% etanol enquanto vórtices suavemente. Isso cessa a divisão celular e evita a aglomeração.
As células fixas são novamente centrifugadas e resuspendidas em PBS. Em seguida, uma solução de ácido concentrado contendo um detergente, como Triton-X, é adicionada às células dropwise. O detergente permeabiliza as células para permitir a entrada de compostos impermeáveis por membrana, e o ácido diminui o pH e denatura o DNA, expondo BrdU. As células são então centrifugadas, supernadante é descartada, e a pelota é resuspendida em solução alcalina para restaurar o pH.
Por fim, as células são lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo BrdU conjugado a uma etiqueta fluorescente à temperatura ambiente. Após esta etapa, as amostras devem ser protegidas contra a luz para evitar fotobleaching.
Quando a coloração dupla, as células são incubadas com PI e RNase. RNase é necessário para remover fios duplos RNA-RNA ou RNA-DNA, que também se ligam ao PI e podem produzir resultados falsos positivos. As células são então passadas através de um coador de células para fazer uma suspensão celular única, o que é necessário para análise citométrica de fluxo.
Agora que você aprendeu o protocolo de coloração, vamos rever como analisar os dados obtidos.
Resumidamente, na citometria de fluxo um raio laser brilha em um fluxo estreito de suspensão de célula única, e a emissão em determinados comprimentos de onda dos corantes em cada célula é detectada como um único evento em um gráfico de dispersão.
Aqui, o lote de dispersão de células manchadas de PI mostram dois aglomerados distintos, um com quase o dobro da quantidade de PI do que o outro. Após a otimização do detector pi, esses conjuntos aparecem como dois picos em uma análise histograma. O pico em maior intensidade de PI representa células G2/M, e o de menor intensidade representa as células G1. As áreas sob esses picos representam o número de células nas fases correspondentes.
Da mesma forma, os eventos BrdU-FITC podem ser exibidos em uma análise histograma em uma escala logarítmica. Esta trama mostra que as células positivas de BrdU são distintamente mais brilhantes do que as células não manchadas, e como apenas uma fração da população está na fase S, um pico maior de células não manchadas de BrdU pode ser visto.
O gráfico de dispersão de células manchadas com BrdU e PI pode ser exibido com PI no eixo X linear e BrdU no eixo Y logarítmico, e isso mostra um padrão de ferradura indo de G1, S, para G2. A proporção de células nas áreas fechadas pode ser determinada e exibida em um gráfico de barras.
Agora que passamos pelo protocolo básico para análise de ciclo celular, vamos ver como ele pode ser usado em várias configurações experimentais.
Um. Ao combinar manipulações genéticas com a análise do ciclo celular, os cientistas estudam papéis de proteínas específicas na progressão do ciclo celular. Neste estudo, os cientistas superexpressaram uma proteína chamada p27 em fibroblastos embrionários de camundongos. Os resultados demonstram que a superexpressão levou a um menor número de células na fase S, indicando que essa proteína desempenha um papel crítico na regulação do ciclo celular.
Usando a análise do ciclo celular, os cientistas podem comparar cinética de progressão. Aqui, foram comparadas cinéticas de progressão entre duas linhas de células cancerígenas colorretais e uma linha celular contra o câncer de mama. Os resultados demonstraram que as células cancerígenas de mama progrediram através do ciclo celular a uma taxa mais lenta em comparação com as linhas celulares colorretais, dada a maior porcentagem de células cancerígenas de mama no G1 ao longo do tempo.
Por fim, para análise do ciclo de células in vivo, a BrdU pode ser injetada em roedores e a população celular alvo pode ser isolada para análise do ciclo celular. Neste estudo, as células-tronco hematopoiéticas ou HSCs de camundongos injetados por BrdU foram isoladas para análise citométrica de fluxo. Os dados coletados revelaram a distribuição de HSCs entre diferentes estágios de ciclo celular com predominância na fase G1 e S.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE na análise do ciclo celular. Revisamos os princípios por trás desse processo, detalhamos um protocolo passo a passo e revisamos como esse tipo de análise é usada em várias configurações experimentais. Como sempre, obrigado por assistir!
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Q1: Why is DNA content used to determine cell cycle phases?
DNA content changes predictably during the cell cycle, making it an ideal marker for phase identification. During G1, DNA remains constant; during S phase, DNA replicates and doubles; during G2, cells verify replication accuracy; and during M phase, DNA divides equally into daughter cells. These characteristic changes allow scientists to sort cells by their current cycle stage.
Q2: What is the difference between BrdU and propidium iodide staining?
BrdU, a thymidine analog, incorporates only into newly synthesized DNA during S phase, labeling replicating cells exclusively. Propidium iodide intercalates between all double-stranded DNA and stains cells at every cycle stage, with fluorescence proportional to DNA amount. Dual staining combines both dyes to increase specificity: PI differentiates G1 from G2/M cells, while BrdU identifies S phase cells in transition.
Q3: How does flow cytometry detect cells in different cycle phases?
Flow cytometry passes a single cell suspension through a laser beam, detecting fluorescent emissions from DNA-binding dyes at specific wavelengths. Each cell's signal appears as a single event on a scatter plot. PI-stained cells produce two distinct peaks in histogram analysis: higher intensity represents G2/M cells with doubled DNA, while lower intensity represents G1 cells with normal DNA content.
Q4: Why is RNase added during the dual staining protocol?
RNase removes RNA-RNA and RNA-DNA double strands that also bind to propidium iodide, which would produce false positive results and skew data interpretation. By eliminating these non-DNA targets, RNase ensures that PI fluorescence reflects only DNA content, improving the accuracy of cell cycle phase determination and allowing reliable quantification of cells in each phase.
Q5: What does the horseshoe pattern indicate in a BrdU and PI scatter plot?
The horseshoe pattern in a dual-stained scatter plot displays the progression of cells through the cell cycle. The pattern shows cells transitioning from G1 (lower PI, no BrdU) through S phase (increasing PI and BrdU signal) to G2/M (high PI, no BrdU). This visual representation helps researchers quantify the proportion of cells in each gated area and understand population dynamics during cell cycle progression.
Q6: How can cell cycle analysis reveal protein roles in cell division?
By combining genetic manipulations with cell cycle analysis, scientists can observe how altering specific proteins affects cycle progression. For example, overexpressing p27 in mouse fibroblasts reduced S phase cell numbers, demonstrating that p27 regulates cell cycle progression. This approach allows researchers to identify critical proteins involved in cell division, with applications for understanding cancer and developing therapeutic strategies.
Q7: What is the purpose of fixing cells in ice-cold ethanol during the protocol?
Ice-cold 70% ethanol fixes cells by ceasing cell division and preventing clumping, which would compromise analysis accuracy. The cold temperature and gentle vortexing preserve cell integrity while stopping metabolic activity. Fixed cells can then be safely permeabilized with detergent and acid solutions to expose BrdU and allow antibody penetration without cellular degradation.
Capítulos neste vídeo
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Overview
0:56
Principle Behind Cell Cycle Analysis
3:33
Generalized Protocol for BrdU and PI Staining
5:43
Flow Cytometric Analysis
7:26
Applications
9:07
Summary