Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

O objetivo geral deste experimento é investigar o papel da sinalização hipotalâmica de C-C-L-5 na função da insulina no sistema periférico e no metabolismo da glicose, manipulando a sinalização de C-C-L-5 administrando o antagonista Met-C-C-L-5 através de um sistema de entrega ventricular intercerebral, a bomba micro-osmótica. Este medicamento pode ajudar a responder às principais questões no campo da fisiologia bioquímica, como a quimiocina CCL-5 no controle do metabolismo da glicose no corpo e na capacidade de resposta à insulina no cérebro. A principal vantagem dessa medida é que o experimentador pode facilmente manipular certas sinalizações no cérebro por um período de tempo, como o C-C-L-5 aqui, sem efeito compensatório ou desenvolvimento de distúrbio, o que geralmente acontece quando fazemos manipulação genética em roedores.

A demonstração visual desse procedimento é importante, pois a inserção da bomba microosmótica e a medição precisa do nível de insulina e glicose no sangue exigem habilidade e precisão. Um dia antes da cirurgia, prepare as bombas micro-osmóticas cerebrais usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de cabeça romba para encher as bombas com líquido cefalorraquidiano artificial, ou ACSF. Em seguida, mergulhe a bomba em A-C-S-F e coloque-a em um shaker para agitar suavemente durante a noite.

No dia seguinte, retire o A-C-S-F da bomba e encha-o completamente com uma solução medicamentosa previamente preparada diluída em A-C-S-F até que o excesso vaze. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para cortar os tubos do cateter no comprimento desejado. Usando uma agulha de infusão cerebral de ponta romba, conecte os tubos ao kit de infusão cerebral.

Em seguida, encha os tubos do kit de infusão com a solução do medicamento. Depois de montar o kit, conecte-o à bomba micro-osmótica. Finalmente, para evitar que a bomba seque, mergulhe a configuração de infusão cerebral da bomba osmótica em ACSF dentro de um tubo esterilizado de 50 mililitros.

Para iniciar a cirurgia, monte e fixe a cabeça de um camundongo anestesiado em um aparelho estereotáxico. Usando uma tesoura cirúrgica e pinças, corte a pele externa que cobre o crânio. Em seguida, use iodo para limpar o crânio periférico.

Em seguida, use uma tesoura de cabeça romba perto da região do pescoço para separar a camada mais externa da pele da pele subcutânea para o implante do conjunto de fusão cerebral da bomba osmótica. Use o aparelho estereotáxico para marcar o ponto de infusão com referência ao mapa cerebral. Use uma broca de unha para fazer um furo ao redor da área marcada no crânio, tomando cuidado para não quebrar as meninges e os vasos sanguíneos do camundongo.

Em seguida, coloque o conjunto de fusão cerebral da bomba micro-osmótica contendo a droga de interesse, ou ACSF como controle, sob a pele atrás da região do pescoço. Para infundir a droga no cérebro, insira a agulha de infusão cerebral no orifício perfurado. Use gel dessensibilizante de superfície para fixar a agulha no crânio e espere até que a cola seque.

Corte a parte saliente em cima da agulha. Antes de iniciar o teste de tolerância à glicose, prepare a solução de glicose dissolvendo 3,75 gramas de glicose e 15 mililitros de água destilada. Estabeleça um cronograma com intervalos adequados entre cada exame de sangue para registrar as leituras durante o experimento.

Em seguida, pese cada camundongo após o jejum para calcular a quantidade apropriada de glicose para a injeção. Em seguida, na bancada de trabalho, prepare um cronômetro, chip de glicose, glicosímetro, seringa de insulina e lâminas de barbear. Para medir o nível de glicose no sangue, primeiro insira um novo chip de glicose no glicosímetro e pressione o botão Iniciar para definir o zero.

Em seguida, pegue o mouse na parte de trás do pescoço e acaricie sua cauda para garantir um fluxo sanguíneo suficiente. Use uma nova lâmina de barbear para cortar um pequeno pedaço da cauda e, em seguida, esprema uma gota de sangue no chip de glicose. Usando a técnica de lavagem intragástrica, alimente o camundongo com glicose e inicie imediatamente o cronômetro.

Meça a glicose em diferentes momentos. Para iniciar o teste de tolerância à insulina, prepare 0,25 unidades de solução de insulina humana. Em seguida, pese cada camundongo após o jejum para calcular a quantidade apropriada de insulina para a injeção.

Em seguida, estabeleça um cronograma para registrar as leituras durante o experimento. Finalmente, após a injeção de insulina, meça o nível de glicose no sangue como feito anteriormente. O metabolismo da glicose foi medido pelo teste oral de tolerância à glicose após a cirurgia, após a administração oral de glicose em camundongos.

As alterações no nível de glicose no sangue em camundongos infundidos com A-C-S-F, ou infundidos com antagonista C-C-L-5, são registradas e mostradas aqui. O teste de sensibilidade à insulina também foi realizado e o nível de glicose no sangue em camundongos infundidos com o antagonista C-C-L-5 foi apenas ligeiramente reduzido em comparação com os camundongos controle, sugerindo deficiências na função da insulina no metabolismo periférico da glicose em camundongos tratados com C-C-L-5. Para analisar a ativação do sinal de insulina, a proteína substrato do receptor de insulina, ou fosforilação IRS-1, foi avaliada no hipotálamo.

Em camundongos tratados com antagonista C-C-L-5 quando alimentados normalmente, a fosforilação de I-R-S-1 foi regulada positivamente em comparação com o grupo controle. Para analisar melhor a ativação do sinal de insulina, os níveis de serina fosforilada 4-7-3 Akt, molécula de sinalização a jusante da insulina, também foram avaliados. Posteriormente, o sinal de desafio com insulina A-K-T foi aumentado nos camundongos tratados com A-C-S-F controle, mas não nos camundongos tratados com antagonistas C-C-L-5.

Uma vez que a inserção da bomba micro-osmótica levará apenas meia hora se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a cabeça do mouse esteja ligeiramente erguida e a coluna esteja reta no aparelho estereotáxico. Essa técnica fornece ao pesquisador uma maneira de explorar o efeito de uma droga, uma quimiocina ou uma função proteica no cérebro do roedor.

Seguindo este procedimento, medidas adicionais como manipular a expressão gênica com uma entrega intracerebral de um vírus, ou crisper 9, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como como o CCL-5 e o receptor CCL-5 participam dos circuitos de digestão e metabolismo dos alimentos?