Name: Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a investigar o papel do CCL5 hipotalâmico na sinalização de insulina e metabolismo da glicose em camundongos usando bombas micro-osmóticas para infusão intracerebroventricular. Este método permite manipular vias de sinalização cerebral de forma precisa e controlada.

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Nota: Todos os protocolos e métodos utilizados em assuntos animais tenham sido aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões de utilização (IACUC) da Universidade de medicina de Taipei (números de protocolo: LAC-2014-0387)
1. preparação da bomba osmótica-Micro sistemas de infusão
Nota: Preparar a bomba, buffer de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) e drogas (solução de proteína RANTES/Met-CCL5 (10 ng/mL em aCSF)) sob condições estéreis, usando amortecedores filtrados com 0,2 µm filtros e realizar todos os procedimentos sob o capô de cultura com luvas. Os procedimentos de cirurgia são realizados da seguinte forma:
<ol>
	<li>Preparar as bombas micro-osmótica um dia antes da cirurgia: encher a bomba de micro-osmótica de cérebro com fluido cerebrospinal artificial (aCSF) com uma seringa de 1 mL e agulha blunt-cabeça fornecido juntamente com o kit. Mergulhe a bomba micro-osmótica em aCSF e coloque-o em uma coqueteleira e agite suavemente durante a noite. Atenção: A bomba deve ser preenchida com aCSF, e devem-se evitar as bolhas de ar no interior da bomba (figura 1A).</li>
	<li>Antes de iniciar a cirurgia, prepare a solução de proteína recombinante RANTES/Met-CCL5 (10 ng/mL, diluída em aCSF) para ser usado no experimento. Remova a bomba aCSF e encher a bomba com a solução de fármaco lentamente até excesso vaza. Nota: 15 mL aCSF ou Met-CCL5/RANTES solução é suficiente para 5-8 bombas. Atenção: Repita o procedimento para garantir que a bomba está completamente cheia com a droga sem bolhas dentro.</li>
	<li>Cortar os tubos do cateter o comprimento desejado e anexá-los com a agulha de infusão de cérebro sem corte-extremidade no kit de infusão de cérebro. Preencha o kit de infusão e tubos com a droga.</li>
	<li>Finalmente, montar e anexar o kit de infusão de cérebro para a bomba de micro-osmótica. Atenção: Não há bolhas devem ser formadas no tubo ou a bomba (figura 1A).</li>
	<li>Mergulhe a fusão de todo o cérebro-bomba osmótica definida em aCSF em um tubo de 50ml esterilizado para evitar que a bomba de secar. O conjunto de fusão bomba osmótica-cérebro está agora pronto para ser usado para a cirurgia. Nota: Os sistemas de micro-osmótica da bomba podem ser usados para infusão de drogas a longo prazo. Isso garante um modo seguro e conveniente de entrega de droga dentro do cérebro de rato.</li>
</ol>
2. intracerebral cirurgia Ventricular – implantação da micro bomba osmótica
Cuidado: Esterilizar o ambiente cirúrgico com 75% de etanol e certifique-se de que as pessoas envolvidas no estudo estão usando luvas estéreis e um jaleco limpo. Instrumentos cirúrgicos / instrumentos devem ser autoclavados e seco antes do uso e posteriormente esterilizado com cirurgias de ratos nas entrelinhas de 75% de etanol.
<ol>
	<li>Pesar o mouse e anestesiá-lo usando injeção intra-peritoneal (IP) com xilazina/cetamina (cetamina 50mg/kg, xilazina 10 mg/kg). Atenção: Peso corporal de ratos inferior 24 g não é recomendado para cirurgia de implante de bomba osmótica.</li>
	<li>Montar e fixar a cabeça de rato no aparato estereotáxica (figura 1B).</li>
	<li>Use um par de tesouras cirúrgicas e pinças para cortar a pele exterior cobrindo o crânio. Use iodo para limpar o crânio periférico.</li>
	<li>Separe a camada mais externa da pele da pele subcutânea com a ajuda de um par de pinças de blunt-cabeça perto da região do pescoço para a implantação de conjunto bomba osmótica-cérebro fusão (Figura 1).</li>
	<li>Marca o ponto de infusão com referência ao mapa do cérebro (Figura 1) usando o aparelho estereotáxico. Neste experimento, a agulha precisa ser implantada na região do ventrículo 3rd (Bregma: lateral de 0.0 mm, 1,3 mm posterior, ventral 5,7 mm).</li>
	<li>Faça um furo com uma broca de prego ao redor da área marcada no crânio (Figura 1E). Cuidado: Tenha cuidado para não quebrar o rato meninges e dos vasos sanguíneos, evitando assim o rompimento de micro vasos no cérebro.</li>
	<li>Coloque o conjunto de fusão micro-osmótica bomba-cérebro contendo aCSF (como controle) ou drogas (solução de proteína Met-CCL5/RANTES) sob a pele para trás a região do pescoço e inserir a infusão de cérebro agulha no orifício perfurado para infundir a droga no cérebro do rato ( Figura 1E). A agulha irá penetrar nas meninges e entrar no ventrículo. Fixe a agulha no lugar no crânio usando gel dessensibilizante de superfície (Figura 1F) e espere 1-2 min até a cola secar. Em seguida, corte a parte saliente no topo da agulha (Figura 1- H).</li>
	<li>Use uma cola adesiva de tecido para curar a ferida na cabeça de operação. Aplicar 50 µ l da cola em cima da ferida, puxe ambos os lados da pele juntos e segure por 30 s para permitir que a pele selar (Figura 1I). Atenção: Utilize compressa embebida em álcool 100% para limpar a ferida após a cirurgia e 100 ul penicilina com estreptomicina para prevenir a infecção. Nota: Pele do rato irá formar tecido cicatricial e curar em poucos dias após a administração da cola cirúrgica. A principal vantagem da cola é a vacância de pontos cirúrgicos que podem causar irritação na pele ou inflamação.</li>
	<li>Lugar o mouse em uma gaiola limpa mantido num prato quente (aquecido a 37 ° C) e aguarde até que o mouse se recupera do efeito anestésico. Atenção: É fundamental para manter a temperatura do corpo do mouse para aumentar a chance de sobrevivência após a cirurgia.</li>
	<li>Após um período de uma semana de recuperação, os ratos estará prontos para novas experiências, tais como o teste de tolerância de glicose Oral (OGTT) e teste de tolerância a insulina (ITT).</li>
</ol>
3. teste de tolerância à glicose oral (OGTT)
Nota: Execute o teste de tolerância à glicose oral 7 dias após a infusão de aCSF e MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µ l). Manter um 6 h rápido para os ratos antes OGTT com abastecimento de água suficiente. Manter os animais na bancada de trabalho mesmo, onde os experimentos serão executados para que eles podem aclimatar ao meio ambiente para reduzir o stress durante o procedimento.
<ol>
	<li>Preparação de solução de glicose: antes de realizar o experimento, preparar a solução de glicose, dissolvendo a 3,75 g glicose em 15 mL de água destilada H2O.</li>
	<li>Defina um calendário para gravar as leituras durante o procedimento experimental (tabela 1). Nota: É importante criar uma tabela de tempo com intervalos adequados entre cada exame de sangue para permitir exato de gravação durante o experimento.</li>
	<li>Pesar cada rato após jejum e calcular a quantidade apropriada de glicose para ser injetado.</li></ol>Por exemplo, se o rato pesa 30 g, a quantidade de solução de glicose a ser administrado deve ser 300 µ l.
	<li>Prepare os seguintes instrumentos na bancada de trabalho:<ol>
		<li>Glicosímetro (pressione o botão start para verificar o status da bateria, certifique-se de que ele está funcionando antes do teste.)</li>
		<li>Chip de glicose</li>
		<li>Seringa de insulina (seringa de insulina de 0,3 mL)</li>
		<li>Lâminas de barbear</li>
		<li>Temporizador</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uma vez que o banco está configurado, medir e registrar o nível de glicose no sangue da seguinte maneira: colocar um limpa e glicose novo chip para o glicosímetro e pressione o botão Iniciar para zerá-lo.</li>
	<li>Pegue o mouse pela parte de trás do pescoço e acariciar a cauda algumas vezes para garantir o fluxo de sangue suficiente para a região da cauda.</li>
	<li>Usando uma nova lâmina de barbear para cortar um pequeno pedaço da cauda e esprema uma pequena gota de sangue (aproximadamente 10-20 µ l) para o chip de glicose. O sangue deve preencher o chip para permitir uma medição precisa. O glicosímetro exibirá o nível de glicose imediatamente. Se a máquina mostra "erro", repita o procedimento com um novo chip de glicose. Nota: O chip de glicose requer apenas uma gota de sangue. Quando a amostra de sangue deve ser coletado mais de uma vez, simplesmente aplica pressão executando várias vezes os dedos ao longo da cauda do rato, mantendo a extremidade da cauda diretamente em cima do chip para coletar sangue. Não é necessário cortar a extremidade da cauda cada vez enquanto a recolha de amostras de sangue.</li>
	<li>Em seguida, alimente os ratos glicose (0,25 g/mL) por via oral, usando a técnica de gavagem intragástrico. A quantidade de glicose para ser administrada deve ser calculada utilizando a fórmula: 10 X solução de glicose µ l de peso do corpo (por exemplo, se pesa o rato 30 g, a quantidade de solução de glicose a ser administrada será 300 µ l). Inicie o temporizador imediatamente após a administração de glicose oral.</li>
	<li>Repita o procedimento de medição de glicose em 15, 30, 60, 90 e 120 min.</li>
	<li>Depois de todas as leituras de nível de glicose foram registradas, descartar as lâminas de barbear e chips de glicose em um recipiente de risco biológico. Volte a colocar a comida em gaiolas de ratos e devolvê-los para a sala de animais.</li>

4. teste de tolerância de a insulina (ITT)
Nota: O teste de tolerância à insulina e o teste de tolerância à glicose oral devem ser agendadas pelo menos 7 dias de intervalo para reduzir o efeito do jejum em animais. Para o teste de tolerância à insulina (ITT), insulina humana (U/Kg 0,75) será administrada através de injeção de IP.
<ol>
	<li>Preparação da solução de insulina 0,25 U: diluir 100U insulina humana para o rácio de 1: 400 em solução salina.</li>
	<li>Pesar cada rato após o jejum e calcular a quantidade injetada de insulina em conformidade: o volume (µ l) de 0.25 insulina U ser injetados IP = 3 X BW (0,75 U insulina/Kg de peso corporal). Por exemplo: para um mouse pesando 28,8 g, injetar: 28,8 X 3 = 86.4 µ l (insulina de 0,25 U diluído) (tabela 2). Atenção: Os mesmos animais podem ter os pesos de corpo diferente após 6 h de jejum em dias diferentes. Assim, é necessário medir o peso corporal antes e após jejum e conduta que o OGTT e ITT teste. Peso do corpo do mouse pode cair dependendo da espécie, gênero e duração do jejum. Doses mais elevadas de insulina podem causar choque de insulina e levariam até a morte do animal.</li>
	<li>Criar uma tabela (tabela 2) para gravar as leituras durante o procedimento experimental. Repita as etapas de 3.4. para 3,8. para os níveis de glicose do sangue de medição.</li>
</ol>

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<li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O mecanismo da inflamação crônica e quimiocinas relacionadas como CCL5 e seu receptor – CCR5 no desenvolvimento do diabetes tipo 2 permanece obscuro. A inflamação crônica provoca infiltração de macrófagos nos tecidos adiposo e afeta o Regulamento de adipocinas; Entretanto, também atrai as células β e prejudica a secreção de insulina das ilhotas de Langerhans em resposta à glicose no sangue. Hipotálamo no cérebro desempenha um papel importante como um centro de controle, na coordenação de insulina e adipokine sinais dos tecidos periféricos sistêmicos em regular o apetite, o metabolismo da glicose do sangue periférico e a resposta de insulina. Muitos estudos também indicam que a inflamação hipotalâmica leva a defeituosa regulação da homeostase de energia bem como defeituosa ilhotas pancreáticas e função hepática2,3,9,10. CCL5 no cérebro contribui para a regulação de temperatura ingestão e corpo comida ao hipotálamo11,,12; no entanto, a correlação de CCL5 para sinalização de insulina hipotalâmica e sistêmica está clara. Para resolver esta questão, que mostra um fenótipo de resistência de insulina com maiores níveis de insulina e níveis elevados de glicose no sangue8foi gerado um rato de nocaute de corpo inteiro CCL5 (CCL5- / -). No entanto, requer muito tempo para desenvolver o fenótipo T2DM e é difícil de investigar o papel e o mecanismo de CCL5 em sinal de insulina hipotalâmico devido a possíveis efeitos compensatórios a longo prazo. Portanto, uma manipulação direta de CCL5 sinalização nos neurônios do hipotálamo é a melhor abordagem. Há, no entanto, vários tipos de neurônios na região do hipotálamo e é bastante caro e demorado para gerar camundongos nocaute específicos de célula. Utilizando um ICV de infusão pode, assim, poupar tempo e fornecem uma abordagem mais específica para manipular CCL5 função diretamente no cérebro, ignorando possíveis reações inflamatórias periféricas.
Estudos utilizando bombas osmóticos já publicados anteriormente, proporcionando grandes exemplos e demonstrações de técnicas envolvidas na implantação de bombas osmóticos em roedores13. No entanto, enfrentamos alguns desafios ao seguir esses protocolos em nosso estudo. Primeiro, alguns dos equipamentos utilizados no protocolo é bastante caro, incluindo 1) o sistema elétrico para chegar ao local, desenho e inserir a agulha no cérebro de rato, 2) o sistema thermo para manter a temperatura do corpo do mouse e 3) o oxigênio-isoflurano fornecimento de sistema para administrar anestesia para ratos. Em segundo lugar, as técnicas descritas em outros artigos eram difíceis de replicar porque só fomos capazes de utilizar animais dentro de um pequeno intervalo de peso corporal e em determinadas idades para nosso estudo. Estamos conscientes de que os ratos maiores são mais adequados para a cirurgia e implantação. No entanto, em nosso estudo, nós tivemos que usar ratos menores e mais jovens para evitar o excesso de peso e os efeitos do envelhecimento na regulação de glicose insulina e sangue: somente ratos masculinos com corpo de peso 25 ± 2 g e idade cerca de 2 meses de idade foram escolhidos no estudo. Assim, é difícil de realizar a cirurgia e suturar a ferida na cabeça do rato. Em terceiro lugar, a resposta inflamatória tem que ser minimizada após a cirurgia, desde que uma citocina inflamatória é o alvo neste estudo. Ratos e ratazanas podem remover a sutura e feridas abertas facilmente após a cirurgia, o que irá resultar em inflamação e aumentar as reações do chemokine. Portanto, uma estratégia para chegar ao local e desenhar e inserir a agulha no cérebro de rato que evita a infecção secundária é necessária. Portanto, nós modificamos os protocolos descritos anteriormente para fazer esta técnica custo-eficaz, mais fácil e menos prejudicial para os animais, conforme descrito no parágrafo seguinte.
Em primeiro lugar, nós costumávamos uma broca do prego manualmente um furo ao redor da área de destino marcada no crânio, conforme descrito na etapa 2.6. Este método é rentável e permite controlar todo o procedimento, a fim de não danificar o rato meninges e dos vasos sanguíneos. Regulamento de glicose do sangue é prejudicado após acidente vascular cerebral agudo, tais como uma hemorragia no cérebro. Hiperglicemia aguda e diabetes-como síndromes também foram observados após acidente vascular cerebral em ambientes clínicos14,15. Da mesma forma, também encontramos resposta de nível e insulina glicose prejudicada em camundongos com hemorragia e pus no cérebro. Estamos conscientes de que controle melhor da cirurgia baseada no manual é necessária para garantir a consistência dos resultados. Em segundo lugar, aproveitamos um recém-desenvolvido biomaterial médica comumente usado em clínicas, colagem adesiva de tecido (passo 2.8), para selar a pele na cabeça do rato após a cirurgia, portanto, evitando pontos e acelerar a taxa de cura. Isto facilita os procedimentos cirúrgicos executar e reduz a possibilidade de inflamação secundária. Em terceiro lugar, o tempo necessário para executar todo o procedimento cirúrgico é comparativamente mais curto, que aumenta a chance de sobrevivência para os ratos e reduz a dose da droga anestésica, sendo injectada intraperitonealmente. Nós observada uma taxa de sobrevivência de alta (95%) e obteve resultados relativamente precisos seguindo este protocolo modificado.
A limitação dessa técnica é o período de tempo relativamente curto de entrega da droga. Embora uma bomba osmótica pode ser colocada no corpo do mouse como alternativa sem re-abertura do cérebro, nosso estudo apenas incide sobre o efeito do chemokine inflamatória no cérebro para regular a sinalização de insulina sistêmica periférica. Cirurgia adicional em tecidos periféricos possivelmente poderia induzir uma reação inflamatória nos tecidos periféricos, que então aumentaria a expressão de chemokine inflamatória e afetar os resultados. Em segundo lugar, a meia-vida da droga também limita a duração do estudo. Proteínas recombinantes como chemokine geralmente têm uma meia-vida mais curta, que perde sua atividade ao longo do tempo, embora ela também nos permite estudar o efeito de bloqueio CCL5 sinalização no cérebro a curto prazo. Nossos estudos anteriores também descreveram uma abordagem de modificação genética para gerar um rato de nocaute CCL5, que fornece um modelo com a longo prazo efeitos8.
Existem algumas novas técnicas e métodos alternativos para entregar drogas para o cérebro. A nanotecnologia é uma técnica poderosa, que pode ser usada para entregar drogas no sistema nervoso central. No entanto, muitos medicamentos são termossensível e podem ser destruídos quando tentando empacotá-los em nanopartículas16. Além disso, nanopartículas podem passar BBB e ser captação pelas células que são apropriados para siRNA ou drogas mais comuns, mas não é um método ideal para ligação ao ligante-receptor.CCL5 requer ligação ao seu receptor, CCR5, nos neurônios hipotálamo ARC para levar a efeito8, e a entrega de CCL5 antagonista CCL5 Metem neurônios através de nanopartículas pode causar uma perda da habilidade para ligar e bloquear o CCR5 na célula superfície.
O nível de glicose no sangue foi significativamente maior em camundongos administrados com o antagonista-CCL5 MetCCL5, em comparação com os controles (ratos administrados com aCSF) no teste de tolerância a glicose oral. Administração de insulina adicional (teste de tolerância à insulina) também foi capaz de diminuir o sangue glicose nível no MetCCL5 recebendo ratos (Figura 4B), que sugere que a insulina endógena e externa não pode reduzir níveis de glicose no sangue Quando bloqueio hipotalâmico CCL5 sinalização. Os ratos tornou-se resistente à insulino, sem atividade CCL5 no hipotálamo. Serine302 aumento de fosforilação do IRS-1 foi encontrada nos ratos recebendo Met-CCL5 comparado aos ratos controle recebendo aCSF (Figura 5A-B). Fosforilação da serina 302 do IRS-1 tem sido mostrada para induzir uma dissociação física do IRS-1 do receptor de insulina, que é das principais causas de resistência de insulin6; a insulina é possível activar sinais a jusante, tais como a via PI3K-Akt. Um estudo de estimulação de insulina ex vivo confirmou a insulina a jusante molécula de sinalização Akt (p-AktS473) não foi ativada por insulina no tecido hipotalâmico rato infundido com Met-CCL5 e, em vez disso, a fosforilação da serina 302 aumentou. No total, dados fisiológicos (OGTT e ITT) e estudo molecular demonstram que hipotalâmico CCL5 sinalização Medeia o Regulamento de sinal de insulina hipotalâmico, que contribui para o metabolismo de insulina sistemática resistência e glicose.
A função e o mecanismo de CCL5 e CCR5 em diabetes associada a obesidade ainda não está claro. Kitade et al relataram que a deficiência CCR5 protegidos ratos da inflamação induzida pela obesidade, recrutamento de macrófagos e de resistência de insulin17. No entanto, outros estudos por Kennedy et al encontraram resultados opostos, indicando que CCR5 deficiência prejudica a tolerância à glicose sistêmica, bem como dos adipócitos e muscular insulina sinalização18. Ambos os estudos aplicados a uma dieta de alto teor de gordura para induzir a obesidade, o que leva a inflamação crônica de corpo inteiro e resposta compensatória. Estes estudos não forneceram mecanismos limpos e claros de CCL5 e CCR5 no Regulamento de sinalização de insulina. Por outro lado, a técnica de bomba osmótica permite uma infusão específicas do cérebro e evita a resposta compensatória com tempo limitado para entrega.
Em conclusão, embora a bomba osmótica com o sistema de infusão de cérebro parece ser uma técnica "antiga", ele fornece um método mais barato, mais fácil e menos prejudicial de entrega de drogas e ajuda a investigar a função de sinalização em ligante-receptor o cérebro.

Insulina afeta uma ampla variedade de tecidos, incluindo o cérebro. Insulina atravessa a barreira hemato - encefálica, entra no sistema nervoso central (SNC) e vincula-se com o receptor de insulina (IR) no hipotálamo para regular a ingestão de alimentos, atividade simpática e resposta periférica da insulina. Inflamação crônica nos tecidos adiposos periféricos tem sido proposta para contribuir para o tipo 2 diabetes mellitus (T2DM), mas como estas reações inflamatórias afetam a insulina sinaliza no hipotálamo para mediar insulina sistêmica resposta e glicose intolerância Ainda não está claro. Alguns quimiocinas participarem na regulação do apetite e regulamento de temperatura do corpo no hipotálamo1 como fator de necrose tumoral-alfa (TNFa), interleucina (IL) -6, IL-1 β, monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) e CCL5 (ligante motivo C-C 5 ). Além disso, a inflamação no hipotálamo leva à resistência à insulina em T2DM2,3.
Entre estes quimiocinas, a alteração dos níveis de expressão de chemokine CCL5 e seu receptor, CCR5, em tecidos adiposo tem sido associada com arteriosclerose e glicose intolerância em T2DM em humanos como em animais. CCL5 também tem funções neuroendócrinas, incluindo a regulação da temperatura de corpo e ingestão de comida, no hipotálamo. Assim, é importante investigar se CCL5 participa da ativação de sinal de insulina dentro do hipotálamo ou os tecidos periféricos.
Sinalização de insulina é fortemente regulamentado dentro das células. A ligação de receptores de insulina para insulina (IR) ativa proteínas de substrato (IRS) do receptor insulin, seguidas de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteína quinase B (PKB/AKT) ativação e glicose transporte-4 (GLUT4) membrana translocação4 . Proteínas de IRS são os reguladores chaves nesta via de sinalização: eles têm vários resíduos tirosina e serina, que podem ser fosforilados em resposta a positivo ou negativa insulina sinaliza5. Por exemplo, fosforilação da serina 302 em IRS-1 pode causar a dissociação física do IRS-1 do IR e bloquear a transdução de sinal de insulina, levando à insulina resistência6. A deficiência de atividade de proteínas IRS no hipotálamo tem demonstrada induzir resistência à insulina e intolerância à glicose em ratos7.
Uma maneira comum de estudar a função de um gene específico é a manipulação da expressão de genes alvo, distribuídos ao longo de todo o corpo do organismo. No entanto, isto pode ter várias desvantagens: 1) pode gerar efeitos de regulamentação ou compensatórios de feedback diferentes ao longo do tempo e 2) este método não nos ajuda a ilustrar o papel da proteína alvo em regiões específicas do cérebro. Também, específicas de tecido e célula gene nocaute animais levar um longo tempo para se reproduzir... e são caras. Assim, usamos um curto prazo sistema de bomba osmótica infusão cérebro - uma maneira relativamente rápida e conveniente de interferir com a sinalização da proteína alvo no cérebro usando a droga antagonista para superar os problemas acima mencionados. Estereotáxica injeções costumávamos exigir habilidade cirúrgica intrincada e extensivo investimento em tempo e instrumentação. Neste protocolo, nós fornecemos uma maneira simples e segura para realizar a injeção estereotáxica e um método rápido, menos prejudicial e instantâneo para detectar a concentração de glicose no sangue e investigar o papel de CCL5 no hipotálamo insulina sinalização de regulamento.

<table><tbody><tr><td>Adesivo de tecido Vetbond</td><td>3M</td><td>#1049SB</td><td>A cola usada para selar o local da lesão na cabeça do rato</td></tr><tr><td>LOCTITE 454 adesivo instantâneo</td><td>Durect Corporation</td><td>#8670</td><td>A cola usada para fixar a agulha no crânio do rato</td></tr><tr><td>Alzet Micro-Osmotic Pump</td><td>Durect Corporation</td><td>#9922</td><td>0.11 &mu; l por hora, 28 dias</td></tr><tr><td>Sistema de infusão cerebral</td><td>Durect Corporation</td><td>#8851</td><td>1-3 mm, usado para perfundir a droga no cérebro de camundongos</td></tr><tr><td>Glicosímetro</td><td>Roche</td><td>#06870244001</td><td>Usado para medir o nível de glicose no sangue</td></tr><tr><td>Chip de glicose</td><td>Roche</td><td>#06454011020</td><td>Usado para carregar a amostra de sangue</td></tr><tr><td>Sigma azul de Evan</td><td></td><td>#MKBK0523V</td><td>Para demonstrar a infusão da droga área</td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>#3232145 C</td><td>Usado para administrar insulina por via intraperitoneal</td></tr><tr><td>MIO NE116 CONTROL UNIT (broca de unha)</td><td>Sistema Mio</td><td>#E235-015</td><td>Para fazer um furo no crânio do camundongo</td></tr><tr><td>CCL5/Met-RANTES Protein R</td><td>& D</td><td>#ADB0111081</td><td>CCL5 humano recombinante, fórmula aCSF derivada de E-coli</td></tr><tr><td></td><td>119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM de glicose</td><td></td><td>Filtro esterilizar com um 0,22 &mu; m aparelho de filtro e armazenar a 4&deg;C. aCSF é estável por 3-4 semanas</td></tr><tr><td>Phospho-IRS-1 Serine302 anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>#12879</td><td>1:1000 diluição</td></tr><tr><td>IRS-1 (D23G12) anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>#12879</td><td>1:1000 diluição</td></tr><tr><td>Phospho-Akt Serine 473 anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>#9916</td><td>1:2000 diluição</td></tr><tr><td>Akt (pan) (C67E7) anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>#9916</td><td>Diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Animais: C57BL/6</td><td>NAR Labs</td><td>Linhagem de camundongos</td><td></td> do tipo selvagem usada no estudo</tr></tbody></table>

estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulina regula o metabolismo sistemático no hipotálamo e a resposta de insulina periférica. Uma reacção inflamatória nos tecidos adiposos periféricos contribui para o desenvolvimento de diabetes mellitus (T2DM) tipo 2 e regulação de apetite no hipotálamo. Receptor do chemokine Chemokine CCL5 e C-C tipo 5 (CCR5) níveis têm sido sugeridos para mediar a arteriosclerose e glicose intolerância na diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Além disso, CCL5 desempenha um papel neuroendócrino no hipotálamo regulando comida ingestão e a temperatura corporal, assim, levando-na investigar a sua função na sinalização da insulina hipotalâmica e regulação do metabolismo da glicose periférica.
O sistema de infusão de cérebro micro-osmótica bomba é uma maneira rápida e precisa para manipular CCL5 função e estudar o seu efeito no cérebro. Ele também fornece uma abordagem alternativa conveniente para gerar um animal transgénico nocaute. Neste sistema, CCL5 sinalização foi bloqueada por infusão intracerebroventricular (ICV) seu antagonista, MetCCL5, usando uma bomba de micro-osmótica. A capacidade de resposta metabolismo e insulina glicose periférica foi detectada pelo teste de tolerância de glicose Oral (OGTT) e teste de tolerância a insulina (ITT). Atividade de sinalização de insulina então foi analisada pela mancha de proteínas de amostras de tecido derivado de animais.
Depois de 7-14 dias de infusão MetCCL5, o metabolismo da glicose e insulina receptividade foi prejudicada em ratos, como pode ser visto nos resultados do OGTT e ITT. A fosforilação de serine302 do IRS-1 foi aumentada e a atividade de Akt reduziu-se em neurônios hipotálamo de ratos seguindo CCL5 inibição. No total, nossos dados sugerem que bloquear CCL5 no cérebro do rato aumenta a fosforilação do IRS-1 S302 e interrompe a sinalização hipotalâmica insulina, levando a uma diminuição da função da insulina em tecidos periféricos, bem como a deficiência de glicose metabolismo.

Implantes cirúrgicos de bombas de infusão osmótica contendo qualquer aCSF como controle ou antagonista CCL5 MetCCL5 (para bloquear CCL5 efeitos no cérebro), realizaram-se nos ratos. Em 7 e 14 dias após a cirurgia, a tolerância à glicose periférica e responsividade de insulina de ratos foram analisados usando OGTT (depois de 7 dias) e ITT (após 14 dias), como mencionado no protocolo. O teste de tolerância à glicose oral (OGTT) e teste de tolerância à insulina (ITT) de ratos foram realizados após 6 horas de jejum. Os ratos foram administrados com glicose por via oral, com a quantidade com base em seus pesos respectivos de corpo. Foram gravadas as alterações nos níveis de glicose no sangue, como mostrado na Figura 3. O teste de sensibilidade de insulina foi realizado por injeção intraperitoneal de insulina (IP) em camundongos e a mudança de nível de glicose no sangue foi medida imediatamente. As alterações dos níveis de glicose no sangue após a estimulação da insulina em camundongos com drogas de infusão diferentes foram registradas, como mostrado na Figura 4. O nível de glicose no sangue foi apenas ligeiramente reduzido após a administração de glicose (Figura 3B) e injeção de insulina (Figura 4B) em ratos com infusão de CCL5 antagonista (MetCCL5) em comparação com os ratos com infusão aCSF. Estes resultados sugerem deficiências na função da insulina no metabolismo da glicose periférica em ratos com MetCCL5 administrado no cérebro.
Em seguida, analisamos a ativação do sinal de insulina, avaliando a fosforilação do IRS-1 e os níveis de ativação de Akt em tecidos hipotalâmicas. A fosforilação da serina no 302 do IRS-1 foi upregulated em camundongos tratados com antagonista (MetCCL5) (Figura 5B-C) quando os ratos foram alimentados normalmente. No grupo controle, aCSF foi administrada no hipotálamo de ratos e o desafio de insulina ativado a molécula sinal a jusante Akt (473 de serina Akt fosforilada) (Figura 5, F) sem aumentar o IRS-1 serine302 ativação ( Figura 5 -E) e Akt serine473 fosforilação. Em contraste, o sinal de Akt não foi aumentado em camundongos infundidos com MetCCL5, mas houve um aumento na fosforilação da serina do IRS-1 302 em vez disso. Enquanto isso, bloqueando o sinal CCL5 no cérebro do rato interrompeu a atividade de insulina no hipotálamo e função insulínica periférica prejudicada. De nossas conclusões gerais, tais como os resultados da ITT, OGTT e ex vivo desafio de insulina, concluímos que CCL5 no hipotálamo contribui para a ativação do sinal de insulina e do metabolismo da glicose periférica após estímulo de insulina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
Figura 1. Bomba osmótica preparação e implantação procedimento cirúrgico em rato. (A), a infusão de cérebro bomba e kit de preparação perfundida com solução de fármaco. Setas vermelhas indicam os tubos cateter preenchidos com líquido. (B) correção e montar a cabeça de rato no aparato estereotáxica. (C) separado da camada mais externa da pele da pele subcutânea para a implantação do conjunto de infusão de cérebro-bomba micro-osmótica; linhas de traço indicam a localização dos implantes bomba osmótica. (D) a seta indica o lado de infusão. (E) Drill um buraco ao redor da área marcada no crânio. (F) a infusão de cérebro-bomba osmótica definido na parte de trás do rato e insira a agulha de infusão de cérebro no orifício perfurado (traço dentro de um círculo). (G) fixar a agulha para o crânio usando cola de tecido-adesivo e retire o topo da agulha (tesoura apontou em G) como mostrado em (H). (eu) selo da ferida usando tecido colagem adesiva. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
Figura 2. Imagens representativas da área de difusão de drogas quando a droga é administrada na região ventricular, utilizando a bomba osmótica. Azul do Evan é a representante droga usada em ilustração de infusão de drogas a bomba osmótica para a região ventricular (A) e difusão em ventrículos laterais e terceiros (B). Barra de escala = 0,5 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
Figura 3. Metabolismo da glicose dos ratos após a cirurgia, medido pelo teste de tolerância a glicose oral (OGTT). A distribuição dos níveis de glicose no sangue alterado seguinte a administração oral de glicose em camundongos WT infundida com aCSF (A) e antagonista, CCL5 M(B). Dados apresentados como média ± SE. (figura modificada de8). * p &lt; 0.05, pela ANOVA de duas vias. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
Figura 4. Função de insulina na glicemia de ratos - o teste de tolerância à insulina (ITT). A distribuição dos níveis de glicose no sangue mudou depois da injeção de insulina em camundongos WT infundido com aCSF (A) e infundido com antagonista, CCL5 M(B). Dados apresentados como média ± SE (figura modificada de8). p &lt; 0.001, pela ANOVA de duas vias. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
Figura 5. Atividade de sinal de insulina em ratos após a cirurgia. (A) mancha ocidental do inibitório serina 302 fosforilação formulário do IRS-1 (insulin resposta substrato-1, pIRS1S302) nos tecidos do hipotálamo de ratos tratados com aCSF ou antagonista CCL5, MetCCL5 (CCL5M) bomba de infusão. (B) níveis relacionados de fósforo-IRS-1S302 após infusão no hipotálamo de camundongos com alimentação normal.(C) mancha ocidental da S302 fosforilação do IRS-1 e Akt ativação (fósforo-Akt S473, pAktS473) com ou sem estimulação da insulina no tecido hipotalâmico após aCSF ou infusão CCL5 MET. (D-E) Níveis relativos de pIRS-1S302, pS6KT421e pAktS473. ("2" em cada gráfico de barras defende: n = 2 para todas as quantificações). (As barras em branco em 5D-E, deixou: sem insulina; os bares de tiras em 5D-E, certo: com insulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>ID do mouse</td>
			<td>Corpo</td>
			<td>Glicose</td>
			<td>Início</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>peso</td>
			<td>ΜL = 10xBW</td>
			<td>tempo</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Calendário para a gravação do teste de tolerância de glicose Oral (OGTT)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>ID do mouse</td>
			<td>Corpo</td>
			<td>Insulina 0,25 IU</td>
			<td>Início</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>peso</td>
			<td>ΜL = 3xBW</td>
			<td>tempo</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
			<td>mins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86.4</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>75,9</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Calendário para a gravação do teste de tolerância de insulina (ITT)

Este protocolo estuda o papel do ligante de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) no hipotálamo, entregando um antagonista, MetCCL5, dentro do cérebro de rato usando um sistema de infusão de cérebro de bomba micro-osmótica. Esta inibição transitória de CCL5 atividade interrompida hipotalâmica insulina sinalização, levando à intolerância à glicose e a sensibilidade periférica à insulina sistêmica.

Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

O objetivo geral deste experimento é investigar o papel da sinalização hipotalâmica de C-C-L-5 na função da insulina no sistema periférico e no metabolismo da glicose, manipulando a sinalização de C-C-L-5 administrando o antagonista Met-C-C-L-5 através de um sistema de entrega ventricular intercerebral, a bomba micro-osmótica. Este medicamento pode ajudar a responder às principais questões no campo da fisiologia bioquímica, como a quimiocina CCL-5 no controle do metabolismo da glicose no corpo e na capacidade de resposta à insulina no cérebro. A principal vantagem dessa medida é que o experimentador pode facilmente manipular certas sinalizações no cérebro por um período de tempo, como o C-C-L-5 aqui, sem efeito compensatório ou desenvolvimento de distúrbio, o que geralmente acontece quando fazemos manipulação genética em roedores.A demonstração visual desse procedimento é importante, pois a inserção da bomba microosmótica e a medição precisa do nível de insulina e glicose no sangue exigem habilidade e precisão. Um dia antes da cirurgia, prepare as bombas micro-osmóticas cerebrais usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de cabeça romba para encher as bombas com líquido cefalorraquidiano artificial, ou ACSF. Em seguida, mergulhe a bomba em A-C-S-F e coloque-a em um shaker para agitar suavemente durante a noite.No dia seguinte, retire o A-C-S-F da bomba e encha-o completamente com uma solução medicamentosa previamente preparada diluída em A-C-S-F até que o excesso vaze. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para cortar os tubos do cateter no comprimento desejado. Usando uma agulha de infusão cerebral de ponta romba, conecte os tubos ao kit de infusão cerebral.Em seguida, encha os tubos do kit de infusão com a solução do medicamento. Depois de montar o kit, conecte-o à bomba micro-osmótica. Finalmente, para evitar que a bomba seque, mergulhe a configuração de infusão cerebral da bomba osmótica em ACSF dentro de um tubo esterilizado de 50 mililitros.Para iniciar a cirurgia, monte e fixe a cabeça de um camundongo anestesiado em um aparelho estereotáxico. Usando uma tesoura cirúrgica e pinças, corte a pele externa que cobre o crânio. Em seguida, use iodo para limpar o crânio periférico.Em seguida, use uma tesoura de cabeça romba perto da região do pescoço para separar a camada mais externa da pele da pele subcutânea para o implante do conjunto de fusão cerebral da bomba osmótica. Use o aparelho estereotáxico para marcar o ponto de infusão com referência ao mapa cerebral. Use uma broca de unha para fazer um furo ao redor da área marcada no crânio, tomando cuidado para não quebrar as meninges e os vasos sanguíneos do camundongo.Em seguida, coloque o conjunto de fusão cerebral da bomba micro-osmótica contendo a droga de interesse, ou ACSF como controle, sob a pele atrás da região do pescoço. Para infundir a droga no cérebro, insira a agulha de infusão cerebral no orifício perfurado. Use gel dessensibilizante de superfície para fixar a agulha no crânio e espere até que a cola seque.Corte a parte saliente em cima da agulha. Antes de iniciar o teste de tolerância à glicose, prepare a solução de glicose dissolvendo 3,75 gramas de glicose e 15 mililitros de água destilada. Estabeleça um cronograma com intervalos adequados entre cada exame de sangue para registrar as leituras durante o experimento.Em seguida, pese cada camundongo após o jejum para calcular a quantidade apropriada de glicose para a injeção. Em seguida, na bancada de trabalho, prepare um cronômetro, chip de glicose, glicosímetro, seringa de insulina e lâminas de barbear. Para medir o nível de glicose no sangue, primeiro insira um novo chip de glicose no glicosímetro e pressione o botão Iniciar para definir o zero.Em seguida, pegue o mouse na parte de trás do pescoço e acaricie sua cauda para garantir um fluxo sanguíneo suficiente. Use uma nova lâmina de barbear para cortar um pequeno pedaço da cauda e, em seguida, esprema uma gota de sangue no chip de glicose. Usando a técnica de lavagem intragástrica, alimente o camundongo com glicose e inicie imediatamente o cronômetro.Meça a glicose em diferentes momentos. Para iniciar o teste de tolerância à insulina, prepare 0,25 unidades de solução de insulina humana. Em seguida, pese cada camundongo após o jejum para calcular a quantidade apropriada de insulina para a injeção.Em seguida, estabeleça um cronograma para registrar as leituras durante o experimento. Finalmente, após a injeção de insulina, meça o nível de glicose no sangue como feito anteriormente. O metabolismo da glicose foi medido pelo teste oral de tolerância à glicose após a cirurgia, após a administração oral de glicose em camundongos.As alterações no nível de glicose no sangue em camundongos infundidos com A-C-S-F, ou infundidos com antagonista C-C-L-5, são registradas e mostradas aqui. O teste de sensibilidade à insulina também foi realizado e o nível de glicose no sangue em camundongos infundidos com o antagonista C-C-L-5 foi apenas ligeiramente reduzido em comparação com os camundongos controle, sugerindo deficiências na função da insulina no metabolismo periférico da glicose em camundongos tratados com C-C-L-5. Para analisar a ativação do sinal de insulina, a proteína substrato do receptor de insulina, ou fosforilação IRS-1, foi avaliada no hipotálamo.Em camundongos tratados com antagonista C-C-L-5 quando alimentados normalmente, a fosforilação de I-R-S-1 foi regulada positivamente em comparação com o grupo controle. Para analisar melhor a ativação do sinal de insulina, os níveis de serina fosforilada 4-7-3 Akt, molécula de sinalização a jusante da insulina, também foram avaliados. Posteriormente, o sinal de desafio com insulina A-K-T foi aumentado nos camundongos tratados com A-C-S-F controle, mas não nos camundongos tratados com antagonistas C-C-L-5.Uma vez que a inserção da bomba micro-osmótica levará apenas meia hora se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a cabeça do mouse esteja ligeiramente erguida e a coluna esteja reta no aparelho estereotáxico. Essa técnica fornece ao pesquisador uma maneira de explorar o efeito de uma droga, uma quimiocina ou uma função proteica no cérebro do roedor.Seguindo este procedimento, medidas adicionais como manipular a expressão gênica com uma entrega intracerebral de um vírus, ou crisper 9, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como como o CCL-5 e o receptor CCL-5 participam dos circuitos de digestão e metabolismo dos alimentos?

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Teste oral de tolerância à glicose (OGTT): medindo o metabolismo da glicose em camundongos

Neste vídeo, demonstramos a montagem de um sistema de infusão cerebral com bomba micro-osmótica seguida de sua implantação cirúrgica no crânio do camundongo. Este sistema permite a entrega contínua de medicamentos potenciais e facilita o estudo de seus efeitos no cérebro e no tecido cerebral.

Sistema de Infusão Contínua de Medicamentos em Modelo de Camundongo: Um Procedimento Cirúrgico para Implantar Sistema de Infusão de Bomba Micro-osmótica no Cérebro de Camundongo para Administração Contínua de Medicamentos

Este vídeo demonstra o efeito da infusão contínua de drogas no cérebro do camundongo nos níveis de glicose no sangue. O metabolismo da glicose é avaliado coletando sangue da cauda de um camundongo em jejum e medindo os níveis de glicose antes e depois da administração oral de glicose. A tolerância à insulina é avaliada pela injeção de insulina no camundongo, com níveis de glicose registrados em intervalos específicos.

Avaliando o efeito da infusão contínua de drogas no cérebro de camundongos nos níveis periféricos de glicose

O atual artigo descreve a geração e caracterização metabólica de ratos alimentados com dieta de alto teor de gordura como um modelo de obesidade e resistência à insulina induzida pela dieta. Possui ainda mais protocolos detalhados para executar o teste de tolerância à glicose oral e o teste de tolerância à insulina, monitoramento de alterações de todo o organismo de glicose metabolismo na vivo.

Estudo do metabolismo in vivo da glicose em camundongos alimentados com dieta de alto teor em gordura usando o teste oral de tolerância à glicose (OGTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT)

Aqui, descrevemos um método simples para implantar um monitor de glicose contínuo comercial projetado para pacientes em camundongos e fornecemos os scripts para analisar os resultados.

Monitoramento Contínuo Simples de Glicose em Camundongos em Movimento Livre

Este artigo descreve um protocolo detalhado para aumentar a concentração de glicose no líquido cefalorraquidiano (LCR) de camundongos. Esta abordagem pode ser útil para estudar os efeitos da glicose elevada no LCR sobre a neurodegeneração, cognição e metabolismo periférico da glicose em camundongos.

Implante de Minibomba Osmótica para Aumento da Concentração de Glicose no Líquido Cefalor de Camundongos

Um clamp hiperglicêmico é usado para medir a liberação de insulina com uma concentração de glicose no sangue mais alta mantida. Uma pinça hipoglicemiante serve para medir a produção de glicose induzida por respostas contra-regulatórias. Ambos os métodos utilizam o mesmo procedimento cirúrgico. Apresentamos aqui uma técnica de clamp para avaliar o metabolismo sistêmico da glicose.

Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes

Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.

Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto

Aprenda a investigar o papel do CCL5 hipotalâmico na sinalização de insulina e metabolismo da glicose em camundongos usando bombas micro-osmóticas para infusão intracerebroventricular. Este método permite manipular vias de sinalização cerebral de forma precisa e controlada.

Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal

Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

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