Name: Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a avaliar respostas celulares à estimulação mecânica aguda em Dictyostelium discoideum usando ensaios de microscopia e fluxo de cisalhamento. Este método isola a resposta inicial da motilidade celular.

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Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenção de saúde R35 GM118177 ao PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
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<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos descritos aqui para oferecer uma maneira conveniente para avaliar a população e comportamento de células individuais em resposta para distorcer o fluxo. Importante, enquanto estudos anteriores analisaram localização de líder e retardamento marcadores de borda durante a migração, a abordagem atual permite investigação dos efeitos imediatos aplicando-se o fluxo de cisalhamento aguda. Usando este método demonstrámos que, na verdade, a resposta inicial de células de fluxo de cisalhamento não requer migração celula...

Migração de células eucarióticas é tendencioso por diversas pistas químicas e físicas no ambiente, incluindo gradientes de solúveis ou substrato-limite quimioatraentes, rigidez variável de substratos, campos elétricos, o fluxo de cisalhamento. Embora tenha havido muitos avanços na nossa compreensão dos mecanismos moleculares dirigindo quimiotaxia, menos é conhecido sobre outros tipos de migração dirigida e como esses diversos sinais são integrados no nível celular para produzir um unificado migratórias resposta.
Dirigido a migração em direção a uma concentração crescente de um quimiotático envolve três componentes comportamentais: motilidade direcional sensoriamento e polaridade1. Motilidade refere-se ao movimento aleatório de células alcançado pela protrusão pseudopod. Direcional é a capacidade de uma célula para detectar a origem de um quimiotático de detecção, que pode ocorrer mesmo em imobilizado células. Polaridade se refere à distribuição assimétrica mais estável dos componentes intracelulares, entre a borda do revestimento de uma célula, o que leva a maior persistência em movimento e líderes.
Resposta celular a um quimiotático depende da atividade de quatro redes reguladoras conceitualmente definidas: receptor / proteína G, transdução de sinal, citoesqueleto de actina e polaridade1. Quimiotático de ligação ao receptor acoplado à proteína G transmite o sinal via Via G proteínas α e βγ para a rede de transdução de sinal a jusante, que amplifica o sinal direcional. Vários caminhos dentro da rede de transdução de sinal agem em paralelo e alimentam a rede de citoesqueleto de actina para polimerização de actina viés e protrusão pseudopod consequente, na direção do gradiente. Entre os importantes reguladores da quimiotaxia são Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-quinase (PI3K), homólogo fosfatase e tensin (PTEN) e guanylyl-ciclase. Mecanismos de feedback dentro da rede de transdução de sinal e entre a transdução de sinal e redes de citoesqueleto de actina mais amplificam a resposta. Finalmente, a rede de polaridade mal definidos recebe entrada do citoesqueleto de actina e preconceitos ainda mais a rede de transdução de sinal para promover a migração persistente na direção do gradiente.
Muito de nossa compreensão mecanicista da quimiotaxia foi tornado possível por causa do desenvolvimento de biossensores fluorescente-tag para vários componentes das redes reguladoras. Muitos reguladores de quimiotaxia tem uma distribuição assimétrica da molécula reguladora em si ou a sua actividade. Por exemplo, biosensores que reconhecem ativado versões de pequenas GTPases Ras e Rap1 – domínios de ligação de Ras de Raf1 (referido como RBD aqui) e RalGDS, respectivamente – localizar a extremidade dianteira de uma célula de chemotaxing2,3. Da mesma forma, PI3K e seu produto fosfatidilinositol (3, 4,5)-triphosphate (PIP3), reconhecido por um domínio de homologia (PH) plecstrina, também mostram a localização na frente de um celular4,5. Em contraste, um 3-fosfatase PTEN, que converte a PIP3 volta a fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato, localiza-se à borda da célula6de atraso. Importante, estes biosensores alterar sua localização em resposta à estimulação global com um quimiotático. Marcadores de ponta, que são citosólica ou nas pontas de saliências em uma célula de descanso, relocalize ao córtex, Considerando que o atraso marcadores de borda, que têm localização cortical e estão ausentes das pontas dos saliências em uma célula de descanso, se tornar citosólico após estimulação. Análise da distribuição de biosensor em resposta à estimulação global com um quimiotático minimiza a contribuição de motilidade e polaridade, que muitas vezes confundem as observações. Estimulação global ou uniforme de uma suspensão de células com um quimiotático também é usada como uma ferramenta para avaliar alterações de toda a população na ativação da proteína, muitas vezes detectado por fosforilação de proteínas a7,8,9 . Este ensaio bioquímico é usado principalmente para obter informação temporal, Considerando que a microscopia é usada para reunir informações temporais e espaciais sobre o comportamento de vários componentes das redes reguladoras.
A rede de transdução de sinal incorpora características de um sistema excitável10,11. Respostas aos estímulos Quimiotáticos supralimiar são "tudo ou nada" e exibir os períodos refratários. As respostas também são acionadas estocàstica e podem mostrar comportamento oscilatório. Eventos de transdução de sinal estão localizados as regiões do córtex que se propagam como ondas12,13,14,15. Frente, trás, marcadores são recrutados para ou dissociam-se, as zonas activas das ondas propagação. Devido a região refratária à direita da zona activa, as ondas opostas dirigidas aniquilar como eles se encontram. As propagação ondas de transdução de sinal fundamentam as saliências celulares que medeiam a migração de células10.
Grande parte das informações acima mencionadas na quimiotaxia veio os estudos sobre a ameba social Dictyostelium discoideum, embora semelhantes mecanismos reguladores são também aplicáveis aos neutrófilos e outros tipos de células de mamíferos16 . Dictyostelium é um organismo modelo bem estabelecida que tem uma robusta quimiotático resposta durante a fome, quando milhares de células únicas migram em direção a um centro de agregação, eventualmente formando um corpo multicelular de frutificação contendo esporos. Quimiotaxia é também essencial durante a fase de crescimento de célula única deste organismo para localizar fontes de alimento bacteriana. Importante, migração de células únicas Dictyostelium é notavelmente semelhante a migração de neutrófilos mamíferos ou células de câncer metastático, os quais sofrem muito rápida migração ameboide-tipo. Na verdade, ambos a topologia global das redes reguladoras, bem como muitas das vias de transdução de sinal individuais envolvidas na quimiotaxia são conservadas entre Dictyostelium e leucócitos mamíferos17. Além disso, outras células, como fibroblastos, usam quinase de tirosina do receptor (RTK) em vez de GPCRs; no entanto, RTKs pode alimentar em redes semelhantes.
Em contraste com a quimiotaxia, informação detalhada sobre os mecanismos de sinalização que levam vários outros modos de migração dirigida é carente. Da mesma forma às células migrando em um gradiente quimiotático vários estudos relataram ativação e/ou localização de marcadores típicos de vanguarda, incluindo polimerização de actina, PIP3 e/ou quinase de sinal-regulado extracellular (ERK) 1/2, no frente de células em fase dirigido a migração em resposta ao cisalhamento fluxo ou alterações nos campos elétricos18,19,20,21. No entanto, nestes estudos exposição contínua ao estímulo também resultou na migração celular, deixando em aberto a questão se, por exemplo, os marcadores de ponta localizar especificamente em resposta a um estímulo, ou se eles simplesmente localizar na vanguarda por causa do aumento do número de pseudopods na frente de uma célula de migração.
Desenvolvemos os ensaios que nos permitem observar a resposta das células à aguda perturbação mecânica entregada como fluxo de cisalhamento, tanto a nível da população e como células individuais22. Semelhante à estimulação global com um quimiotático, pós-dose agudação com fluxo de cisalhamento permite o estudo da resposta celular a um estímulo mecânico sem a contribuição de confundimento de motilidade ou polaridade. Combinar estes ensaios bioquímicos e microscópicos com perturbações genéticas ou farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecânicos como são percebidos e transmitida. Além disso, esta abordagem também fornece um método novo para grampear a jusante do sistema do receptor quimiotático na ausência de um quimiotático, isolando, assim, as redes sinal transdução e actina citoesqueleto do receptor/G rede de proteínas.
Usando as técnicas descritas abaixo nós recentemente demonstrou que a tensão de cisalhamento aguda leva à ativação de vários componentes do sinal quimiotáxico transdução e actina citoesqueleto redes22. Aplicando o estímulo mecânico agudo em intervalos variáveis, temos demonstrado que, da mesma forma quimioatraentes, resposta a estímulos mecânicos também exibe características de um sistema excitável, incluindo o comportamento tudo ou nada da resposta sob saturar as condições e a presença de um período refratário. Finalmente, combinando estimulação mecânica e química, mostramos que os dois estímulos compartilham sinal transdução e actina citoesqueleto redes, permitindo que o provável para a integração de múltiplos estímulos a migração celular viés.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Use para preparar meios HL-5 e placas SM (etapas 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Peptona de proteose</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Use para preparar mídia HL-5 (etapa 1.1)</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Use para preparar mídia HL-5 e placas SM (etapas 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Use para preparar meios HL-5 e tampão fosfato 10X (etapas 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Use para preparar meios HL-5, placas SM e tampão fosfato 10X (etapas 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Estreptomicina (sulfato de diidroestreptomicina)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Use para preparar meios HL-5 (etapa 1.1)</td></tr><tr><td>Peptona (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Use para preparar placas SM (etapa 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Use para preparar placas SM (etapa 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Use para preparar placas SM (etapa 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Use para preparar o DB Buffer (etapa 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Use para preparar DB Buffer (passo 1.4)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Use para preparar cafeína (passo 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-monofosfato cíclico, Sal de Sódio)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Use para preparar cAMP (passo 1.6)</td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Use para preparar folic ácido (etapa 1.7)</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio decahidratado</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Use para preparar Latrunculina A (etapa 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl gel de poliacrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Uso para immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Membrana de fluoreto de polivinilideno</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Uso para immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorpo de coelho</td><td>Sinalização celular</td><td>2060</td><td>Anticorpo primário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorpo XP</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Anticorpo primário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (de burro)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Anticorpo secundário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Substrato de quimioluminescência aprimorado (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Uso para immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Tampão de decapagem (tampão de decapagem Restore Plus Western blot)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Uso para immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Uso para immunoblotting (etapa 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes cepa (não patogênica)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais e Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital (modelo G-33, ou uma alternativa comparável)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Use para cultivar K. aerogenes (etapa 2.1.1) e para basalar e estimular células D. discoideum (etapa 3). O raio de giro para este agitador é de 9,5 mm.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Use para preparar placas SM (etapa 1.2)</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Use para contar células D. discoideum (etapa 2.1.2)</td></tr><tr><td>Placa de 35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Use para plaquear D. discoideumcélulas para estimulação mecânica seguida de lise celular (etapa 3.1.1)</td></tr><tr><td>Copo de poliestireno (5 ml)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Utilizar para estimular a suspensão celular D. discoideum com um quimioatraente (passo 3.2.2)</td></tr><tr><td>Unidade fluídica com bomba (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Utilizar para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum num canal (passos 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Lâmina com canal (&mu;-Slide III 3 em 1 ibiTreat: #1.5 lamínula de polímero, tratamento para cultura de tecidos, esterilizado)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por um dispositivo fluídico (etapas 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Reservatórios de 50 mL (Suporte de reservatório Ibidi para unidade fluídica)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Linhas para a unidade fluídica (Conjunto de Perfusão AMARELO e VERDE)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5). Nota: as duas linhas também podem ser cortadas da tubulação de 1,6 mm (número de catálogo 10842).</td></tr><tr><td>Linha para o dreno (tubulação de 1,6 mm de diâmetro interno)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5).</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Zeiss Observer.Z1 equipado com uma objetiva de óleo 40X/1,3 e uma objetiva de ar 20X/0,3 (ou uma alternativa comparável)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Usado para obter imagens de células D. discoideum com contraste de fase ou iluminação de fluorescência (etapas 4 e 5)</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de disco giratório UltraView equipado com um microscópio confocal de disco giratório 40&vezes;/1,25&ndash; 0,75 objetiva de óleo (ou uma alternativa comparável)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Uma alternativa usada para criar imagens de células D. discoideum (etapa 4.1.4)</td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet (Eppendorf; modelo 5247, ou uma alternativa comparável) com Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D e 5192000027</td><td>Use para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum por uma micropipeta (etapa 4.3). Nota: o número de catálogo é para a versão mais recente do equipamento (4i).</td></tr><tr><td>Micropipeta (Femtotip; 1 &mu; m diâmetro externo, 0,5 &mu; m de diâmetro interno )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Use para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum por uma micropipeta (passo 4.3)</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregador (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Use para encher a micropipeta (femtotip) com tampão (passo 4.3.1)</td></tr><tr><td>Câmara de 1 poço (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por uma micropipeta (etapa 4.3.2)</td></tr><tr><td>Câmara de 8 poços (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por adição de tampão em massa (etapa 4.4.1)</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>SoftwareSoftware de Análise de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Imagem (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Use para quantificar a resposta à estimulação mecânica (etapa 4.5)</td></tr><tr><td>Software de análise de migração (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Use para quantificar a velocidade e persistência da célula (etapa 5.4)</td></tr></tbody></table>

avaliação de dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Quimiotaxia, ou migração de um gradiente de um quimiotático, é o melhor modo compreendido de migração dirigida. Estudos utilizando social ameba Dictyostelium discoideum revelou que uma rede de transdução de sinal complexo de vias paralelas amplifica a resposta ao quimioatraentes e leva a polimerização de actina tendenciosa e protrusão de um pseudopod no direção de um gradiente. Em contraste, os mecanismos moleculares dirigindo outros tipos de migração dirigida, por exemplo, devido à exposição ao cisalhamento fluxo ou campos elétricos, não são conhecidos. Muitos reguladores de quimiotaxia exibem localização no líder ou borda de revestimento de uma célula de migração, bem como mostram mudanças transientes na localização ou ativação após estimulação global com um quimiotático. Para entender os mecanismos moleculares de outros tipos de migração dirigida, desenvolvemos um método que permite o exame da resposta celular à estimulação mecânica aguda, com base em breve (2-5 s) exposição ao fluxo de cisalhamento. Esta estimulação pode ser entregue em um canal enquanto imagem células expressando fluorescente-etiquetadas biosensores para examinar o comportamento de células individuais. Além disso, a população celular pode ser estimulada em um prato, lysed e immunoblotted usando anticorpos que reconhecem versões ativas de proteínas de interesse. Combinando os dois ensaios, um pode examinar uma ampla gama de moléculas ativadas por alterações na localização subcellular e/ou fosforilação. Usando esse método, determinamos que estimulação mecânica aguda provoca ativação das redes de citoesqueleto sinal quimiotáxico transdução e actina. A capacidade de examinar as respostas celulares à estimulação mecânica aguda é importante para compreender os eventos inicial necessários para motilidade induzida pelo fluxo de cisalhamento. Esta abordagem também fornece uma ferramenta para o estudo da rede de transdução de sinal quimiotáxico sem a influência de confundimento do receptor quimiotático.

Resposta temporal de reguladores de quimiotaxia para estimulação mecânica aguda
Para avaliar a resposta das células de d. discoideum à estimulação mecânica, células aderentes de agregação-competentes foram expostas a um breve pulso de fluxo de cisalhamento. Agregação-competente D. discoideum células secretam o acampamento, que pode ser percebido pelas células. Para superar a contribuição de sinalização celular, as...

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar a atividade de vários componentes da rede de transdução de sinal intracelular após uma breve perturbação mecânica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da migração celular, como a forma como as células sentem e migram direcionalmente em direção a diversas pistas ambientais, incluindo estímulos mecânicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o exame da resposta inicial ao estímulo mecânico sem a contribuição confusa da motilidade ou polaridade para a resposta.Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando testamos a resposta das células aderentes ao quimioatraente que foi entregue com uma leve agitação e notamos uma resposta robusta das células estimuladas com o controle do veículo. Para começar, prepare Klebsiella aerogenes inoculando um pequeno número de células de estoque congelado em meio HL5 sem antibióticos e incube a cultura durante a noite. O crescimento de Dictyostelium na presença da bactéria Klebsiella aerogenes reduzirá o número de macropinossomas, o que melhorará a capacidade de resposta celular a estímulos externos.Cronometre o experimento para que, quando as bactérias es

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Biologia

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.

Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada

Infecção da próstata pode ser um fator que contribui na mediação dor pélvica na prostatite crônica. Descreve-se o processo para a preparação do inoculo bacteriano padronizado, a instilação de bactérias para dentro da uretra de ratos machos e metodologia para medir a alodinia táctil em ratos ao longo do tempo.

Medição da alodinia táctil em um modelo murino de prostatite bacteriana

Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

Função sensorial anormal subjacente a dor visceral e outros sintomas de doenças inflamatórias e funcionais do intestino. Um protocolo para a gravação eletrofisiológica dos nervos aferentes do cólon em uma preparação de colorectum de rato ex vivo é apresentado aqui.

In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

O objetivo deste protocolo é mostrar como realizar um ensaio melhorado para o nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. Usamos o ensaio aqui para demonstrar que a hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) existe em larvas de Drosophila.

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Aprenda a avaliar respostas celulares à estimulação mecânica aguda em Dictyostelium discoideum usando ensaios de microscopia e fluxo de cisalhamento. Este método isola a resposta inicial da motilidade celular.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

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