Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

O objetivo geral deste procedimento é processar a matriz extracelular cardíaca em um hidrogel, o que permite estudar o efeito da matriz em vários ensaios baseados em células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo cardíaco, como como a matriz extracelular afeta o comportamento celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o uso da matriz extracelular para fazer experimentos em larga escala in vitro ou in vivo.

As aplicações desta técnica podem ser estendidas para uma terapia para infarto do miocárdio porque a matriz pode fornecer pistas de sobrevivência essenciais. Para iniciar o experimento, use um bisturi estéril com lâmina número dez, para remover o tecido adiposo de um miocárdio ventricular esquerdo previamente obtido. Corte o miocárdio em cubos de aproximadamente 1 por 1 por 1 cm, usando um bisturi.

Em seguida, coloque os cubos em um tubo estéril de 50 mL. Armazene os tubos contendo os cubos a 80 graus Celsius. Retire o tubo contendo os cubos preparados do freezer e transporte-o em gelo para o criostato.

Defina a temperatura do objeto e da câmara do criostato para 15 graus Celsius. Refrigere os tubos e carimbos vazios de 50 mL na câmara. Adicione uma camada de meio de criossecção no carimbo frio e deixe congelar até ficar branco e sólido.

Adicione uma segunda camada de meio de criossecção e coloque um tubo de miocárdio na segunda camada. Certifique-se de que o meio de criossecção e o miocárdio estejam completamente congelados. Em seguida, insira o carimbo com miocárdio congelado no suporte e aperte todos os parafusos.

Apare a superfície do tecido até obter uma superfície de corte uniforme. Secione o miocárdio congelado com seccionamento automático para garantir cortes uniformes. Aproximadamente 30 a 40 seções podem ser cortadas de um cubo.

Coloque cada fatia, após o corte, frouxamente em um tubo pré-resfriado de 50 mL. Feche os tubos cheios e coloque-os no gelo. Transfira as secções congeladas de todos os tubos de 50 ml para um copo estéril.

Adicione 50 mL de solução de lise por tubo de 50 mL contendo fatias de miocárdio. Em seguida, agite as fatias de miocárdio em um béquer estéril. Coe o líquido com as fatias de tecido em uma peneira grossa.

Em seguida, transfira as fatias de tecido com uma pinça romba para um novo béquer estéril. Adicione 50 mL de 0,5% SDS em PBS por tubo inicial de 50 mL de fatias de miocárdio. Agitar o copo continuamente durante seis horas a 100-150 rpm à temperatura ambiente.

Depois de agitar, coe o líquido com as fatias de tecido em uma peneira grossa. Usando uma pinça romba, transfira as fatias de tecido para um novo béquer estéril e lave as fatias três vezes com 50 mL de PBS. Em seguida, lave as fatias durante a noite em PBS, com 1% de penicilina estreptomicina e 1% de nistatina.

No dia seguinte, remova a solução de lavagem e adicione 25 mL de FBS pré-aquecido a 37 graus Celsius com estreptomicina 1% de penicilina e 1% de nistatina, aos cortes descelularizados por tubo inicial de 50 mL de cortes de miocárdio. Incube as fatias por três horas a 37 graus Celsius para remover qualquer DNA restante da matriz. Em seguida, transfira as fatias para um novo béquer estéril e lave três vezes com 50 mL de PBS.

Coloque as fatias de ECM frouxamente em uma nova placa estéril de seis poços. Congele o ECM a 80 graus Celsius e liofilize-o por dois dias em um liofilizar. Para a pulverização da fatia ECM, use tubos de moagem contendo esferas de cerâmica de 1.4 mm.

Encha os tubos frouxamente com ECM liofilizado, usando uma pinça estéril e romba. Congele os tubos em nitrogênio líquido. Insira os tubos congelados na fresadora e pulverize o ECM.

Defina a duração para 30 segundos, ajuste a velocidade máxima e inicie o dispositivo. Após a pulverização, retire os tubos e congele-os novamente em nitrogênio líquido. Lave as micropartículas dos tubos, adicionando 1 mL de ddH20 por tubo, e agite para solubilização completa.

Em seguida, filtrar a solução heterogênea através de uma tela de 200 micrômetros, em um tubo de 50 mL. Congele o tubo em nitrogênio líquido. Substitua a tampa padrão do tubo por um filtro de 0.22 micrômetro para evitar que o pó escorra para fora do tubo.

Insira o tubo no liofilizador e liofilize novamente para remover a água da etapa de lavagem. Dissolva o pó de ECM humano liofilizado previamente preparado em solução de pepsina, até uma concentração final de 10 mg por mL. Transfira a solução para tubos de 2 mL com um volume de 1 mL por tubo.

Pipete a solução para misturar bem. Em seguida, coloque os tubos no agitador e agite a 1200 rpm por 48 horas a 27 graus Celsius. Retire os tubos do shaker e coloque-os no gelo ou em um suporte de tubo pré-resfriado.

Misture 1/9 do volume da solução de ECM de PBS 10X frio, com 1/10 de um volume de solução de ECM de hidróxido de sódio 0,1 molar frio, em um tubo pré-resfriado e coloque-o no gelo para neutralizar a solução de ECM digerida e inativar a pepsina. Finalmente, adicione a solução ECM à mistura de neutralização e misture bem por pipetagem ou vórtice. Ensaios quantitativos para componentes individuais da ECM revelaram uma remoção de DNA mais completa e melhor preservação de colágeno total, elastina e glicossominoglicanos em comparação com a descelularização apenas por SDS.

A RT-PCR foi usada para quantificar a expressão de proteínas cardiomiocitas estruturais, fatores de transcrição cardiomiogênicos precoces e tardios e genes marcadores de superfície de células endoteliais em ESC murino, submetidos a diferenciação espontânea. O contato com a cECM impulsiona as células-tronco pluripotentes, de preferência em direção a um fenótipo semelhante ao cardiomiócitos. A microscopia de luz com contraste de fase demonstra que a digestão enzimática do cECM por 48 horas resulta em uma solução de ECM mais homogeneizada.

A coloração viva/morta de fibroblastos cardíacos humanos em hidrogel cECM mostra maior viabilidade. Tanto as micropartículas cECM quanto o hidrogel cECM aumentam a atividade metabólica das células contráteis HL-1, em condições isquêmicas, em comparação com as células em cultura padrão. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de uma semana, do tecido ao hidrogel, se for realizada corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de regeneração cardíaca, explorarem os efeitos da matriz extracelular cardíaca, in vitro e in vivo, sistemas modelo.