Name: Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a descelularização de miocárdio humano para produzir hidrogel de matriz extracelular auto-montável. Este método preserva componentes da matriz e viabiliza ensaios celulares in vitro e in vivo para pesquisa cardíaca.

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O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque. Pacientes fornecido o consentimento informado para o uso do tecido para fins de investigação, e o processo de coleta de tecido foi aprovado pelo Comitê de ética da Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) e Conselho de revisão institucional.

O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque e foi aprovado pela Comissão de Conselho e ética a revisão institucional da Universidade de medicina Charité. Todos os pacientes fornecidos escritos, consentimento informado para o uso de tecido cardíaco para estudos experimentais.
1. preparação do miocárdio humano para seccionamento
<ol><li>Obter o miocárdio ventricular esquerdo (tamanho varia dependendo do tipo de cirurgia) diretamente da sala de operações e transporte em PBS frio em um recipiente estéril.</li>
	<li>Remova todo o tecido gordo com um bisturi estéril com uma lâmina n º 10 em condições estéreis.</li>
	<li>Corte o miocárdio em cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 cm com um bisturi.</li>
	<li>Coloque os cubos em tubos estéreis de 50 mL. Nota: Para pausar, executar passo 1.5, caso contrário continue com o passo 2.2. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento para evitar a degradação das proteínas e uma diminuição na qualidade do tecido.</li>
	<li>Armazenar os tubos que contém os cubos a-80 ° C. O tecido pode ser armazenado por vários meses.</li>
</ol>2. corte dos cubos de miocárdio em fatias
<ol><li>Leve os tubos contendo os cubos preparados fora do congelador.</li>
	<li>Transporte em gelo para o criostato.</li>
	<li>Definir o objeto e a câmara de temperatura-15 ° c. Nota: A temperatura certa é crucial para garantir o corte perfeito.</li>
	<li>Relaxa os tubos vazios de 50 mL e selos na câmara ou em gelo seco.</li>
	<li>Adicione uma camada (aproximadamente 0,5 - 1,0 mL) de cryosection médio para o carimbo frio e deixá-la congelar até é branca e sólida.</li>
	<li>Adicionar uma segunda camada de cryosection médio e coloque um cubo de miocárdio para esta camada.</li>
	<li>Certifique-se de meio de cryosection e miocárdio são completamente congelado antes de continuar. Nota: Quando o meio da amostra e cryosection não são congelados o seccionamento será prejudicada. Cryosection completamente congelado médio gira de fluídos e transparentes para sólido, branco e não transparente. Os cubos do miocárdio precisam de pelo menos 30 min a 1 h para congelar completamente se continuar imediatamente da etapa 1.4. Quando o tecido é congelado não deve deformar quando tocou/tratado com pinças.</li>
	<li>Insira o selo com miocárdio congelado no suporte e aperte os parafusos.</li>
	<li>Apare a superfície do tecido até à obtenção de uma superfície de corte mesmo.</li>
	<li>Conjunto de corte espessura a 300 µm.</li>
	<li>Seção do miocárdio congelado com seccionamento automático. Isto garante a seções de corte uniformes. Aproximadamente 30 a 40 seções podem ser cortadas de um cubo.</li>
	<li>Coloque cada fatia após seccionamento frouxamente em um tubo de 50ml pré-resfriada. Nota: Não pressione as fatias ou pacote firmemente. Aproximadamente 40 fatias podem caber em um tubo.</li>
	<li>Fechar os tubos cheios e colocar no gelo. Nota: Para pausar ir sobre com passo 2.14, caso contrário continue com o passo 3.2.</li>
	<li>Fatias de miocárdio loja a-80 ° C. As fatias podem ser armazenadas por vários meses.</li>
</ol>3. decellularization do miocárdio humano fatias
<ol><li>Pegue o número necessário de tubos de 50 mL contendo seções de miocárdio fora do congelador-80 ° C e transporte no gelo.</li>
	<li>Transferi as seções congeladas de todos os tubos de 50 mL do passo 3.1 em um béquer estéril. Aproximadamente 40 fatias são adicionadas para o copo por tubo de 50 mL. O copo deve ser três vezes o volume dos tubos de 50 mL; por exemplo, para decellularization de um tubo de 50 mL, use um copo de 150 mL.</li>
	<li>Adicione 50 mL de solução de lise (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7,4 em H2O) pelo tubo de 50 mL com fatias do miocárdio.</li>
	<li>Agite as fatias do miocárdio em um béquer estéril em 100-150 rpm continuamente por 2 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coe o líquido com as fatias de tecido através de uma peneira grossa. Transferi as fatias de tecido com uma pinça contundente para um novo copo estéril. Adicione 50 mL de SDS 0,5% em PBS por tubo de 50ml inicial de fatias do miocárdio (por exemplo, usar 100ml SDS solução quando dois tubos de 50 mL de seções do miocárdio estão sendo decellularized).</li>
	<li>Agitar continuamente durante 6 h em 100-150 rpm, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coe o líquido com as fatias de tecido através de uma peneira grossa. Transferir as fatias de tecido com uma pinça contundente para um novo copo estéril e lavar 3 vezes com 50 mL de PBS por 10 min cada e agitando a 150 rpm. Em seguida, lave a noite em PBS com 1% penicilina/estreptomicina e 1% nistatina (PBS-P/S-N) em 100-150 rpm e 4 ° C, agitando. Nota: A lavagem completa é crucial para remover completamente qualquer SDS residual. Os restos de SDS são tóxicos quando o ECM é usado em combinação com células.</li>
	<li>Remover a solução de lavagem e adicionar 25 mL pré-aquecido FBS (37 ° C) com 1% penicilina/estreptomicina e 1% nistatina para as decellularized fatias por tubo inicial 50 mL de fatias do miocárdio.</li>
	<li>Incubar durante 3 h a 37 ° C. Nesta etapa, qualquer DNA restante é removido da matriz devido a atividade de DNase intrínseca do FBS.</li>
	<li>Transfira as fatias para um novo copo estéril e lavar 3 vezes com 50 mL de PBS por 10 min cada e agitando a 150 rpm. Nota: As fatias de ECM podem ser armazenadas em PBS-P/S-N em 4 ° C por vários dias. No entanto, recomenda-se proceder de imediato.</li>
</ol>4. processamento do cECM Decellularized a pó
<ol><li>Coloque as fatias de ECM frouxamente em uma placa nova de estéril 6. Congelar o ECM a-80 ° C e lyophilize para 2 dias em um liofilizador. Nota: mais do que uma fatia pode ser colocada por bem. Disponha as fatias para cobrir completamente a superfície do poço. Sobrepondo as fatias não afeta o sucesso subsequente de pulverização.</li>
	<li>Para a pulverização da fatia ECM, uso de moagem específicos tubos contendo grânulos de cerâmica 1,4 mm (ver Tabela de materiais). Encha os tubos frouxamente com ECM liofilizado usando uma pinça estéril de Franco. Para obter melhores resultados, recomenda-se um peso total de ECM entre 10-20 mg. Nota: Se o ECM é embalado demasiado firmemente em tubos de moagem o processo de pulverização será negativamente afetado.</li>
	<li>Os tubos snap-congelamento em nitrogênio líquido. ATENÇÃO: nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa, usar proteção pessoal apropriada.</li>
	<li>
Inserir os tubos congelados a máquina de trituração e pulverizar o ECM.
	<ol>
<li>Definir a duração de 30 s e um máximo de velocidade e iniciar o dispositivo.</li>
		<li>Depois de terminar, retire os tubos e snap-congelar novamente em nitrogênio líquido.</li>
		<li>Repeti cinco vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as micropartículas dos tubos, adicionando 1 mL ddH2O pelo tubo e agitar ou vórtice para solubilizing completa. Filtre a solução heterogênea, através de uma malha de 200 µm em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Congele o tubo em nitrogênio-80 ° C ou líquido.</li>
	<li>Substitua a tampa padrão do tubo com um filtro de 0,22 µm. Esta tampa de filtro impede que o pó fluindo para fora do tubo, mas permite a circulação de ar para evaporação da água.</li>
	<li>Inserir os tubos no Liofilizador e lyophilize novamente para remover a água da etapa (etapa 4.5) Nota: Liofilização neste passo pode demorar até 3 dias.</li>
	<li>Armazenar o pó a-80 ° C até o processamento adicional ou continuar com a etapa 5.1.</li>
</ol>5. homogeneização de base enzima de cECM Micropartículas
<ol><li>Pepsina suína em 0,01 M HCl (pH 2,0) a uma concentração de 1 mg/mL, dissolva. Coloque em um agitador rotativo à temperatura ambiente até que é completamente dissolvido.</li>
	<li>Dissolva o pó liofilizado de ECM humano (4.8. etapa) da solução de pepsina a uma concentração final de 10 mg/mL. Homogeneizar através de pipetagem. O volume total varia de acordo com a quantidade de solução de ECM necessária. Por exemplo, dissolvem-se 10 mg de pó de ECM em 1 mL de solução de pepsina. Nota: Dissolver as partículas pode ser suportado através da utilização do Vortex suave (1.000-1.500 RPM). Restante em pedaços de micropartículas afetará negativamente a digestão.</li>
	<li>Transferi a solução para tubos de 2 mL com um volume de 1 mL por tubo.</li>
	<li>Coloque os tubos em um agitador de tubo por 48 h a 27 ° C e 1.200 rpm.</li>
	<li>Tirar os tubos do agitador e colocar no gelo ou um suporte de tubo pré-refrigerado.</li>
	<li>Mistura 1/9 do volume da solução de ECM de frio 10x PBS (pH 7,4) com 1/10 do volume da solução de ECM frio 0,1 M de NaOH em um tubo pré-resfriado e lugar no gelo. Esta mistura irá neutralizar a solução ECM digerida e irreversivelmente inativar a pepsina.</li>
	<li>Adicione a solução de ECM para a mistura de neutralização e misture completamente através de pipetagem ou num Vortex.</li>
	<li>Defina o ECM para a concentração desejada com 1X PBS (pH 7,4). O pH da solução pode ser verificado com papel de pH. Nota: O cálculo de exemplo para 10 mL digerido solução ECM: Adicione 10 mL de HCl (pH 2,0) pepsina suína 10 mg. Adicione 100 mg ECM em pó para solução de pepsina. Nota: O cálculo de exemplo para neutralizar 10 mL digerido solução ECM e definindo a concentração para 8 mg/mL: Vol.Final = cIniciar x VolIniciar / cFinal = 10 mg / mL x 10ml / 8 mg/mL = 12,5 mL Vol.10xPBS = Volcomeçar / 9 = 1/9 da PBS de 10 x 10 mL = 1,11 mL VolNaOH = Volcomeçar / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL Vol.1xPBS = Vol VolFinal - Volcomeçar -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL</li>
</ol>

<ol><li>Elliott, R., Hoehn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Commercial+Porcine+Skin+for+Wound+Dressings%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings.</a> Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).</li>
<li>Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Extracellular+Matrix%3A+An+Ever-Changing+and+Diverse+Entity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity.</a> Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction.</a> Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+Delivery+of+Notch+Ligand-Containing+Hydrogels+Improves+Cardiac+Function+and+Angiogenesis+Following+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction.</a> Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).</li>
<li>Gaetani, R., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+derived+extracellular+matrix+enhances+cardiogenic+properties+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells.</a> Cell Transplant. , (2015).</li>
<li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+microvascular+grafts+for+cardiac+tissue+preservation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction.</a> Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+The+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Fong, A. H., Romero-López, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li>
<li>DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+High+Yielding+Method+for+Preparing+Tissue+Specific+Extracellular+Matrix+Coatings+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture.</a> PLoS ONE. 5 (9), e13039(2010).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+extracellular+matrix+hydrogels+as+scaffolds+for+spinal+cord+injury+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair.</a> Tissue Eng Part A. , (2016).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter-deliverable+hydrogel+derived+from+decellularized+ventricular+extracellular+matrix+increases+endogenous+cardiomyocytes+and+preserves+cardiac+function+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+extracellular+matrix+supports+myocardial+lineage+commitment+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).</li>
<li>Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li>
<li>Kappler, B., Anic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoprotective+capacity+of+processed+human+cardiac+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).</li>
<li>Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+localization+of+cardiac+collagen+type+VI.+Associations+with+other+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components.</a> Circulation Research. 70 (5), (1992).</li>
<li>Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+protection+by+inhalation+of+exogenous+solubilized+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171165(2017).</li>
<li>Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+zebrafish+cardiac+extracellular+matrix+induces+mammalian+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration.</a> Science Advances. 2 (11), e1600844(2016).</li>
<li>Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li>
<li>Sarig, U., Sarig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+myocardial+ECM+patch+drives+cardiac+progenitor+based+restoration+even+after+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring.</a> Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).</li>
<li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ao preparar o ECM do miocárdio humano, o objetivo é alcançar o seguinte: remoção de material celular imunogênica relevante, preservação da integridade de ECM e bioatividade, esterilidade, não-toxicidade do produto final, compatibilidade de GMP-processo, e adequação do produto para um determinado aplicativo em termos de manipulação. Combinando nosso protocolo de decellularization de 3 passos com tratamento subsequente em micropartículas ou auto-montagem hidrogel, material de ECM cardíaco humano é obtido que possui activid...

A matriz extracelular (ECM) fornece não somente estrutural apoio mas também é importante para a célula biológica e tecido função1. No coração, o ECM participa na regulação das respostas fisiopatológicas como fibrose, inflamação, angiogênese, função contrátil de casos e viabilidade e destino de células progenitoras residente. Além de seus principais componentes fibrosas glicoproteínas, glicosaminoglicanos e proteoglicanos - contém uma série de fatores de crescimento secretados, citocinas e vesículas membranosas que contém proteínas e ácidos nucleicos2,3.
Recentemente tornou-se claro que preparações de ECM acelulares não são apenas inestimáveis para o estudo de interacções célula-matriz, mas também para potenciais aplicações terapêuticas baseada em célula. A importância de fornecer um ambiente adequado para produtos terapêuticos celular ou tecidos engenharia agora é amplamente reconhecida. Foram feitas tentativas para combinar suspensões celulares ou compostos ativos com hidrogel de biopolymeric definido4,5,6 ou com coquetéis de proteína secretadas pelas células de sarcoma murino (i.e., Matrigel, Geltrex) 7. no entanto, o antigo limitaram bioatividade, estes últimos são problemáticos em processos de qualidade GMP, e ambas faltam a bioatividade de tecido-específica de cardíaca ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization do miocárdio tem sido realizado anteriormente por perfusão do coração toda via a vasculatura coronária14,15. Enquanto isso é possível em animais corações, corações humanos intactas são raramente disponíveis. Portanto, um processo de imersão que permite a manipulação de amostras de tecidos obtidas na sala de cirurgia foi favorecido. Nosso protocolo de "3 passos" contém separado 3 etapas de incubação ou seja Lise, solubilização e remoção de DNA. Que produz o ECM do miocárdio humano com em grande parte preservada da proteína e glicosaminoglicano composição16,17. Essas fatias cECM permitem em vitro estudos de interacções célula-matriz, mas são mal adaptadas para aplicações terapêuticas de potenciais humano-escala. O processo de fabricação estendeu-se então para produzir cECM liofilizado micropartículas ou um hidrogel de cECM18.
Este protocolo permite a decellularization do miocárdio humano obtido de amostras cirúrgicas, preservando os principais componentes da matriz extracelular do miocárdio (ECM) e sua atividade biológica. Este protocolo é recomendado quando ECM cardíaco humano com conserva bioatividade de tecido-específica é necessária para estudos experimentais de interacções célula-matriz, ou quando um ambiente adequado é necessário para abordagens baseadas em células de regeneração miocárdica. Em princípio, também é possível adaptar este protocolo para condições GMP-classe, para que o uso de cECM processado deve ser viáveis aplicações terapêuticas no futuro.

<table><tbody><tr><td>Balance</td><td>DR Precisa, Dietikon, Suíça</td><td>Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Blades Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Alemanha</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (6 poços)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemanha</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação Eppendorf (1,5 ou 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemanha</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml, 50ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemanha</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Biochrome, Berlim, Alemanha</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Liofilização</td><td>Labconco, Kansas City, EUA</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Congelador (-80&deg; C)</td> <td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo Tipo 819</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Minilys Homogeneizador</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemanha</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1,4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Alemanha</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas Rotamax 120</td><td>Heidolph, Schwabach, Alemanha</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>Microscópio estéreo CN30.3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &micro; m</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Misturadores analógicos de rolos e balancins Stuart</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T composto</td><td>Hartenstein, Würzburg, Alemanha</td><td>TTEK</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de transfusão 200&micro; m</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, Padrão, 125 mm</td><td>Destaques Médicos, Rohrdorf, Alemanha</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, Nova York, EUA</td><td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para in vitro e in vivo de aplicações

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Preparações de matriz acelular extracelular são úteis para estudar interações célula-matriz e facilitam aplicações da terapia celular regenerativa. Vários produtos comerciais da matriz extracelular estão disponíveis como hidrogel ou membranas, mas estes não possuem atividade biológica de tecido-específica. Porque decellularization de perfusão geralmente não é possível com o tecido do coração humano, desenvolvemos um processo de decellularization de imersão de 3 passos. Fatias do miocárdio humanas, adquiridas durante a cirurgia são primeiro tratadas com tampão de Lise hiperosmolar livre de detergente, seguida de incubação com o iônico detergente, Dodecil sulfato de sódio, e o processo é concluído, explorando a atividade de DNase intrínseca de soro fetal bovino. Esta técnica resulta em folhas sem célula da matriz extracelular cardíaca com em grande parte preservada composição arquitetura e biopolímero de tecido fibroso, que foram mostrados para fornecer pistas ambientais específicas para populações de células cardíacas e tronco pluripotentes células. Folhas de matriz extracelular cardíaca podem então ser mais transformadas em um pó microparticulado sem mais modificação química, ou, através de digestão de pepsina a curto prazo, em um hidrogel de matriz extracelular cardíaca auto-montagem com conservados Bioatividade.

O protocolo de 3 passos para decellularization do miocárdio humano aqui apresentados resultados em quase completa remoção de material celular, preservando-se os principais componentes de ECM e a estrutura fibrillar do ECM. Após decellularization, a bruta remoção de células do tecido é evidente pela mudança na cor (figura 1A). A análise histológica com H &amp; E e Masson Trichrome manchas revelou a ausência completa de células intactas residuais (<strong class...

Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

O objetivo geral deste procedimento é processar a matriz extracelular cardíaca em um hidrogel, o que permite estudar o efeito da matriz em vários ensaios baseados em células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo cardíaco, como como a matriz extracelular afeta o comportamento celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o uso da matriz extracelular para fazer experimentos em larga escala in vitro ou in vivo.As aplicações desta técnica podem ser estendidas para uma terapia para infarto do miocárdio porque a matriz pode fornecer pistas de sobrevivência essenciais. Para iniciar o experimento, use um bisturi estéril com lâmina número dez, para remover o tecido adiposo de um miocárdio ventricular esquerdo previamente obtido. Corte o miocárdio em cubos de aproximadamente 1 por 1 por 1 cm, usando um bisturi.Em seguida, coloque os cubos em um tubo estéril de 50 mL. Armazene os tubos contendo os cubos a 80 graus Celsius. Retire o tubo contendo os cubos preparados do freezer e transporte-o em gelo para o criostato.Defina a temperatura do objeto e da câmara do criostato para 15 graus Celsius. Refrigere os tubos e carimbos vazios de 50 mL na câmara. Ad

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato...

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Descrevemos o isolamento de cardiomiócitos neonatal e na preparação das células para encapsulamento em construções de hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos. Descrevemos métodos para analisar a engenharia de tecidos do miocárdio após o período de cultura, incluindo a força ativa gerada com a estimulação elétrica e viabilidade celular e coloração imuno.

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Esse método permite a decellularization de um órgão complexo sólido usando um protocolo simples baseado em choque osmotic e perfusão de detergente iônico com o mínimo de órgão matriz de interrupção. É composto por uma técnica de novela decellularization para corações humanos dentro uma bolsa pressurizada com monitoramento em tempo real da saída de detritos de celular e dinâmica de fluxo.

Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida

O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Fibroblastos isolados do coração humano adulto foram cultivados para confluir em placas revestidas de gelatina para produzir a matriz extracelular específica do miocárdio. Após a descelularização, esse substrato pode ser utilizado para o cultivo e estudo de outras células cardíacas e interações célula-matriz.

Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda a descelularização de miocárdio humano para produzir hidrogel de matriz extracelular auto-montável. Este método preserva componentes da matriz e viabiliza ensaios celulares in vitro e in vivo para pesquisa cardíaca.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações (Vídeo) | JoVE Journal

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

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