Mitose é uma forma de divisão celular na qual o material genético de uma célula é dividido igualmente entre duas células filhas. A mitose pode ser dividida em seis fases, durante cada uma das quais os componentes da célula, como seus cromossomos, mostram características visualmente distintas. Os avanços na fluorescência de imagens de células vivas permitiram que os cientistas estudassem esse processo com grande detalhe, fornecendo insights importantes sobre o controle biológico desse processo e como ele pode dar errado em doenças como o câncer.
Começamos este vídeo quebrando as fases da mitose, e introduzindo algumas considerações importantes para a visualização ideal do processo usando imagens de células vivas. Em seguida, caminhamos através dos passos para executar um experimento de imagem de mitose celular ao vivo e discutimos vários métodos de análise, incluindo a geração de montagens, filmes e recreações 3D. Finalmente, damos uma olhada em como a visualização do processo mitótico pode ser aplicada à resposta a perguntas na biologia celular.
Mitosis é a divisão altamente organizada e controlada de conteúdo nuclear que ocorre durante o ciclo celular. A mitose é fundamentalmente importante para o desenvolvimento do organismo adequado e para o crescimento, manutenção e reparação de tecidos. A interrupção desse processo tem sido indicada em certas doenças, como o câncer. A imagem de células vivas através da microscopia fluorescente de lapso de tempo é um dos métodos mais comuns de estudar mitose em laboratórios hoje.
Neste vídeo, apresentaremos brevemente as fases da mitose e, em seguida, discutiremos considerações experimentais para imagens de células vivas deste processo celular. Um protocolo detalhado de aquisição e análise de dados será mostrado, e vamos encerrar com algumas aplicações desta técnica.
Para entender melhor o que os cientistas estão procurando nesses experimentos de imagem, vamos primeiro caminhar pelos estágios da mitose.
O ciclo celular descreve o processo global de crescimento e divisão celular. A fase mitótica representa uma pequena parte deste ciclo, que pode ser ainda mais dividida em seis fases: prophase, prometaphase, metafase, anfáfase, telophase e citocinas.
Durante a prophase, o DNA se condensa em cromátides irmãs unidos no centromere. No citoplasma, duas organelas-chave referidas como centrosomos começam a montar estruturas de microtúbulos — comumente conhecidas como fibras de fuso — em um padrão semelhante a uma roda.
A próxima fase, prometaphase, vê a quebra da membrana nuclear, e a montagem de um complexo de proteínas, conhecido como kinetochore, nos centrosmers. Esta fase também testemunha a ligação das fibras do eixo com o kinetochore.
Em metafase, os cromossomos se alinham na placa de metafase, um avião imaginário equidistante dos dois centrosmers. Durante a anfase, os cromossomos “se quebram” no centromere, com cromátides irmãs individuais migrando para as extremidades opostas da célula. Em telophase, o fuso mitótico desmonta e a cromatina começa a descondense. Finalmente, durante a citocinese — através da contração de um anel de actina/miosina que forma o “sulco de decote” — a célula pai se divide em duas células filhas.
Com essa compreensão da progressão mitótica, vamos dar uma olhada nas considerações práticas para ver esse processo usando imagens de células vivas.
A primeira pergunta a se fazer é: como rotular células para visualizar a mitose? As “tags” mais comumente empregadas para este experimento são moléculas fluorescentes, que absorvem a luz em um comprimento de onda e emitem luz em outro comprimento de onda.
Para rotular ácidos nucleicos, pode-se usar um corante de ligação de DNA permeável celular, como Hoechst. Para rotular proteínas como microtúbulos, pode-se usar anticorpos fluorescentes marcados. Estas são geralmente impermeáveis da membrana e, portanto, técnicas de microinjeção são empregadas para inseri-las em amostras.
Outra estratégia é a rotulagem genética, na qual as células podem ser manipuladas para expressar proteínas fluorescentes marcadas que rotulam componentes ativamente envolvidos na mitose, como cromossomos. Ao trabalhar com moléculas fluorescentes, você deve evitar exposição excessiva à luz para evitar fotobleaching.
Escolher o microscópio certo é uma decisão igualmente importante. Os dois microscópios mais usados são epifluorescentes e confocal. A microscopia epifluorescente ou de campo largo passa luz sobre todo o campo de visão, enquanto a microscopia confocal usa lasers para concentrar a luz em pontos únicos.
Embora microscópios epifluorescentes sejam tipicamente mais baratos, microscópios confocal são preferidos, pois a iluminação de ponto fornece maior resolução óptica, produzindo imagens mais claras. O único ponto de iluminação também reduz a fototoxicidade, ou o aumento da morte celular causada pela exposição excessiva à luz.
Agora que revisamos algumas considerações experimentais, vamos ver como executar um experimento de imagem celular ao vivo para visualizar mitose.
As células devem ser cultivadas em pratos de fundo de vidro ou em tampas, o que permite a melhor visualização da mitose. Em seguida, devem ser mantidos em um envio controlado até que a rotulagem seja realizada. Como mencionado anteriormente, a escolha da técnica de rotulagem depende do experimento em questão. Após a rotulagem, coloque o prato de cultura celular na câmara especializada no microscópio. Isso permite que as condições de cultura celular sejam mantidas durante a imagem.
Em seguida, dependendo da molécula de rotulagem, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão no microscópio. Para aquisição de dados, configurar pontos de tempo e posição para captura de imagens. Nesse contexto, os pontos de tempo são os exemplos em que as imagens serão adquiridas para fornecer cobertura visual completa para todas as etapas mitóticas. As posições referem-se às coordenadas X-Y no prato de cultura. Além disso, para cada posição pode-se adquirir imagens em diferentes profundidades de campo. Cada imagem representa uma fatia óptica no eixo Z. Portanto, eles são coletivamente conhecidos como Z-stacks. Depois de inserir todos os parâmetros, teste as configurações e depois sente-se e aproveite!
Tendo adquirido os dados de lapso de tempo, existem várias maneiras de apresentá-los. Vamos discutir algumas dessas maneiras.
Uma montagem é uma das maneiras mais comuns de apresentar dados de lapso de tempo, onde várias imagens são dispostas em um padrão semelhante à grade com base no tempo. Estes podem mostrar claramente a progressão mitótica, e permitem que os pesquisadores determinem informações como o tempo gasto em fases mitóticas individuais. Combinar essas imagens sequencialmente para fazer um “filme” pode ser uma apresentação mais dinâmica.
Por fim, as pilhas Z obtidas usando um microscópio confocal podem ser combinadas para apresentar uma recriação 3D de uma amostra. Isso pode revelar com precisão as relações espaciais entre pedaços da maquinaria mitótica. Isso é importante, pois componentes que se olham um ao lado do outro em 2D podem realmente estar distantes em três dimensões.
Agora que você sabe como executar um experimento de imagem celular ao vivo, vamos rever algumas aplicações desta técnica.
A mitose é uma parte essencial do desenvolvimento. Aqui, pesquisadores isolaram cérebros de camundongos embrionários para observar mitose em células progenitoras neurais. A divisão controlada dessas células é fundamental para o crescimento e função cerebral adequados. Após o isolamento, os cérebros foram seccionados usando um vibratome, manchado com corante nucleico permeável de membrana, e imageado via microscopia confocal para visualizar claramente a mitose das células progenitoras neurais.
O reparo do DNA é um processo celular crítico que está envolvido no crescimento e divisão celular. Neste experimento, os pesquisadores estudaram uma proteína de reparação de DNA que forma focos, que são pontos pontuais criados em resposta a danos no DNA. Os resultados da imagem celular viva e da análise 3D destacaram a localização da proteína de reparação de DNA durante todo o processo de divisão celular.
Finalmente, os pesquisadores estudam pontos de verificação mitóticos, que são pontos de “pausa” onde as condições celulares são avaliadas antes da divisão continuar. Em mitose, o ponto de verificação de montagem do eixo, ou SAC, garante uma conexão adequada entre o fuso mitótico e os cromossomos. Para estudar isso, os cientistas microinjetaram reagentes indutores de SAC em embriões transgênicos e analisaram mitose usando imagens de células vivas. Os resultados mostram cinetochores presos, demonstrando células que não conseguem progredir através da mitose.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre imagens de células ao vivo de mitose. Após uma introdução aos estágios da mitose, este vídeo introduziu importantes considerações e técnicas de análise de dados para imagens de células vivas. Por fim, foram apresentadas aplicações dessa técnica. A imagem de células vivas tem ajudado substancialmente os cientistas na compreensão de mecanismos mitóticos relacionados ao desenvolvimento, manutenção de tecidos e doenças. Como sempre, obrigado por assistir!
Mitosis is the highly organized and controlled division of nuclear contents that occurs during the cell cycle. Mitosis is fundamentally important for proper organismal development, and for tissue growth, maintenance, and repair. Disruption of this process has been indicated in certain diseases, like cancer. Live cell imaging via time-lapse fluorescent microscopy is one of the most common methods of studying mitosis in labs today.
In this video, we’ll briefly introduce the phases of mitosis, and then discuss experimental considerations for live cell imaging of this cellular process. A detailed data acquisition and analysis protocol will be shown, and we’ll wrap up with a few applications of this technique.
To better understand what scientists are looking for in these imaging experiments, let’s first walk through the stages of mitosis.
The cell cycle describes the overall process of cell growth and division. The mitotic phase represents one short portion of this cycle, which can be further broken down into six phases: namely prophase, prometaphase, metaphase, anaphase, telophase, and cytokinesis.
During prophase, the DNA condenses into sister chromatids joined at the centromere. In the cytoplasm, two key organelles referred to as centrosomes begin assembling microtubule structures—commonly known as spindle fibers—in a wheel-like pattern.
The next phase, prometaphase, sees the breakdown of the nuclear membrane, and assembly of a complex of proteins, known as the kinetochore, at the centromeres. This phase also witnesses the linkage of the spindle fibers with the kinetochore.
In metaphase, the chromosomes line up at the metaphase plate, an imaginary plane equidistant from the two centromeres. During anaphase, chromosomes “break apart” at the centromere, with individual sister chromatids migrating to the opposite ends of the cell. In telophase, the mitotic spindle disassembles and the chromatin begins to decondense. Finally, during cytokinesis—via contraction of an actin/myosin ring that forms the “cleavage furrow”—the parent cell divides into two daughter cells.
With this understanding of mitotic progression, let’s take a look at the practical considerations for viewing this process using live cell imaging.
The first question to ask is: how to label cells in order to visualize mitosis? The most commonly employed “tags” for this experiment are fluorescent molecules, which absorb light at one wavelength and emit light at another wavelength.
In order to label nucleic acids, one can use a cell permeable DNA binding dye, like Hoechst. For labeling proteins such as microtubules, one can use fluorescently tagged antibodies. These are generally membrane impermeable, and therefore microinjection techniques are employed to insert them into samples.
Another strategy is genetic labeling, in which cells can be manipulated to express fluorescently tagged proteins that label components actively involved in mitosis, such as chromosomes. When working with fluorescent molecules, you must avoid excessive exposure to light to avoid photobleaching.
Choosing the right microscope is an equally important decision. The two most commonly used microscopes are epifluorescent and confocal. Epifluorescent or wide field microscopy passes light over the entire field of view, while confocal microscopy uses lasers to focus light onto single points.
While epifluorescent microscopes are typically cheaper, confocal microscopes are preferred as the point illumination provides increased optical resolution, producing clearer images. The single point of illumination also reduces phototoxicity, or increased cell death caused by excessive exposure to light.
Now that we’ve reviewed some experimental considerations, let’s see how to run a live cell imaging experiment for visualizing mitosis.
Cells should be cultured on glass bottom dishes or on coverslips, which allows for the best visualization of mitosis. Next, they should be maintained in a controlled envioronment until labeling is performed. As mentioned earlier, the choice of labeling technique depends on the experiment at hand. After labeling, place the cell culture dish into the specialized chamber on the microscope. This allows cell culture conditions to be maintained during imaging.
Next, depending on the labeling molecule, set the excitation and emission wavelengths on the microscope. For data acquisition, setup time points and position for image capture. In this context, time points are the instances at which images will be acquired to provide complete visual coverage for all mitotic stages. Positions refer to the X-Y coordinates on the culture dish. In addition, for each position one can acquire images at different depths of field. Each image represents an optical slice on the Z-axis. Therefore, they are collectively known as Z-stacks. After entering all parameters, test the settings and then sit back and enjoy!
Having acquired the time-lapse data, there are several ways to present it. Let’s discuss a few of these ways.
A montage is one of the most common ways to present time-lapse data, where multiple images are arrayed in a grid-like pattern based on time. These can clearly show mitotic progression, and allow researchers to determine information such as time spent in individual mitotic phases. Combining these images sequentially to make a “movie” can be a more dynamic presentation.
Lastly, Z-stacks obtained using a confocal microscope can be combined to present a 3D recreation of a sample. This can accurately reveal spatial relationships between pieces of the mitotic machinery. This is important since components that look next to each other in 2D may actually be far apart in three dimensions.
Now that you know how to run a live cell imaging experiment, let’s review some applications of this technique.
Mitosis is an essential part of development. Here, researchers isolated embryonic mouse brains to observe mitosis in neural progenitor cells. Controlled division of these cells is critical for proper brain growth and function. Following isolation, brains were sectioned using a vibratome, stained with membrane permeable nucleic acid-binding dye, and imaged via confocal microscopy to clearly visualize mitosis of neural progenitor cells.
DNA repair is a critical cellular process that is involved in cell growth and division. In this experiment, researchers studied a DNA repair protein that forms foci, which are punctate spots created in response to DNA damage. Results of live cell imaging and 3D analysis highlighted the localization of the DNA repair protein throughout the cell division process.
Finally, researchers study mitotic checkpoints, which are “pause” points where cellular conditions are assessed before division continues. In mitosis, the spindle assembly checkpoint, or SAC, ensures proper connection between the mitotic spindle and the chromosomes. To study this, scientists microinjected SAC-inducing reagents into transgenic fly embryos, and analyzed mitosis using live cell imaging. Results show arrested kinetochores, demonstrating cells that fail to progress through mitosis.
You’ve just watched JoVE’s video on live cell imaging of mitosis. Following an introduction to the stages of mitosis, this video introduced important considerations and data analysis techniques for live cell imaging. Finally, applications of this technique were presented. Live cell imaging has substantially helped scientists in understanding mitotic mechanisms related to development, tissue maintenance, and disease. As always, thanks for watching!
