Imageamento ao vivo da mitose

Mitosis é a divisão altamente organizada e controlada de conteúdo nuclear que ocorre durante o ciclo celular. A mitose é fundamentalmente importante para o desenvolvimento do organismo adequado e para o crescimento, manutenção e reparação de tecidos. A interrupção desse processo tem sido indicada em certas doenças, como o câncer. A imagem de células vivas através da microscopia fluorescente de lapso de tempo é um dos métodos mais comuns de estudar mitose em laboratórios hoje.

Neste vídeo, apresentaremos brevemente as fases da mitose e, em seguida, discutiremos considerações experimentais para imagens de células vivas deste processo celular. Um protocolo detalhado de aquisição e análise de dados será mostrado, e vamos encerrar com algumas aplicações desta técnica.

Para entender melhor o que os cientistas estão procurando nesses experimentos de imagem, vamos primeiro caminhar pelos estágios da mitose.

O ciclo celular descreve o processo global de crescimento e divisão celular. A fase mitótica representa uma pequena parte deste ciclo, que pode ser ainda mais dividida em seis fases: prophase, prometaphase, metafase, anfáfase, telophase e citocinas.

Durante a prophase, o DNA se condensa em cromátides irmãs unidos no centromere. No citoplasma, duas organelas-chave referidas como centrosomos começam a montar estruturas de microtúbulos — comumente conhecidas como fibras de fuso — em um padrão semelhante a uma roda.

A próxima fase, prometaphase, vê a quebra da membrana nuclear, e a montagem de um complexo de proteínas, conhecido como kinetochore, nos centrosmers. Esta fase também testemunha a ligação das fibras do eixo com o kinetochore.

Em metafase, os cromossomos se alinham na placa de metafase, um avião imaginário equidistante dos dois centrosmers. Durante a anfase, os cromossomos "se quebram" no centromere, com cromátides irmãs individuais migrando para as extremidades opostas da célula. Em telophase, o fuso mitótico desmonta e a cromatina começa a descondense. Finalmente, durante a citocinese — através da contração de um anel de actina/miosina que forma o "sulco de decote" — a célula pai se divide em duas células filhas.

Com essa compreensão da progressão mitótica, vamos dar uma olhada nas considerações práticas para ver esse processo usando imagens de células vivas.

A primeira pergunta a se fazer é: como rotular células para visualizar a mitose? As "tags" mais comumente empregadas para este experimento são moléculas fluorescentes, que absorvem a luz em um comprimento de onda e emitem luz em outro comprimento de onda.

Para rotular ácidos nucleicos, pode-se usar um corante de ligação de DNA permeável celular, como Hoechst. Para rotular proteínas como microtúbulos, pode-se usar anticorpos fluorescentes marcados. Estas são geralmente impermeáveis da membrana e, portanto, técnicas de microinjeção são empregadas para inseri-las em amostras.

Outra estratégia é a rotulagem genética, na qual as células podem ser manipuladas para expressar proteínas fluorescentes marcadas que rotulam componentes ativamente envolvidos na mitose, como cromossomos. Ao trabalhar com moléculas fluorescentes, você deve evitar exposição excessiva à luz para evitar fotobleaching.

Escolher o microscópio certo é uma decisão igualmente importante. Os dois microscópios mais usados são epifluorescentes e confocal. A microscopia epifluorescente ou de campo largo passa luz sobre todo o campo de visão, enquanto a microscopia confocal usa lasers para concentrar a luz em pontos únicos.

Embora microscópios epifluorescentes sejam tipicamente mais baratos, microscópios confocal são preferidos, pois a iluminação de ponto fornece maior resolução óptica, produzindo imagens mais claras. O único ponto de iluminação também reduz a fototoxicidade, ou o aumento da morte celular causada pela exposição excessiva à luz.

Agora que revisamos algumas considerações experimentais, vamos ver como executar um experimento de imagem celular ao vivo para visualizar mitose.

As células devem ser cultivadas em pratos de fundo de vidro ou em tampas, o que permite a melhor visualização da mitose. Em seguida, devem ser mantidos em um envio controlado até que a rotulagem seja realizada. Como mencionado anteriormente, a escolha da técnica de rotulagem depende do experimento em questão. Após a rotulagem, coloque o prato de cultura celular na câmara especializada no microscópio. Isso permite que as condições de cultura celular sejam mantidas durante a imagem.

Em seguida, dependendo da molécula de rotulagem, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão no microscópio. Para aquisição de dados, configurar pontos de tempo e posição para captura de imagens. Nesse contexto, os pontos de tempo são os exemplos em que as imagens serão adquiridas para fornecer cobertura visual completa para todas as etapas mitóticas. As posições referem-se às coordenadas X-Y no prato de cultura. Além disso, para cada posição pode-se adquirir imagens em diferentes profundidades de campo. Cada imagem representa uma fatia óptica no eixo Z. Portanto, eles são coletivamente conhecidos como Z-stacks. Depois de inserir todos os parâmetros, teste as configurações e depois sente-se e aproveite!

Tendo adquirido os dados de lapso de tempo, existem várias maneiras de apresentá-los. Vamos discutir algumas dessas maneiras.

Uma montagem é uma das maneiras mais comuns de apresentar dados de lapso de tempo, onde várias imagens são dispostas em um padrão semelhante à grade com base no tempo. Estes podem mostrar claramente a progressão mitótica, e permitem que os pesquisadores determinem informações como o tempo gasto em fases mitóticas individuais. Combinar essas imagens sequencialmente para fazer um "filme" pode ser uma apresentação mais dinâmica.

Por fim, as pilhas Z obtidas usando um microscópio confocal podem ser combinadas para apresentar uma recriação 3D de uma amostra. Isso pode revelar com precisão as relações espaciais entre pedaços da maquinaria mitótica. Isso é importante, pois componentes que se olham um ao lado do outro em 2D podem realmente estar distantes em três dimensões.

Agora que você sabe como executar um experimento de imagem celular ao vivo, vamos rever algumas aplicações desta técnica.

A mitose é uma parte essencial do desenvolvimento. Aqui, pesquisadores isolaram cérebros de camundongos embrionários para observar mitose em células progenitoras neurais. A divisão controlada dessas células é fundamental para o crescimento e função cerebral adequados. Após o isolamento, os cérebros foram seccionados usando um vibratome, manchado com corante nucleico permeável de membrana, e imageado via microscopia confocal para visualizar claramente a mitose das células progenitoras neurais.

O reparo do DNA é um processo celular crítico que está envolvido no crescimento e divisão celular. Neste experimento, os pesquisadores estudaram uma proteína de reparação de DNA que forma focos, que são pontos pontuais criados em resposta a danos no DNA. Os resultados da imagem celular viva e da análise 3D destacaram a localização da proteína de reparação de DNA durante todo o processo de divisão celular.

Finalmente, os pesquisadores estudam pontos de verificação mitóticos, que são pontos de "pausa" onde as condições celulares são avaliadas antes da divisão continuar. Em mitose, o ponto de verificação de montagem do eixo, ou SAC, garante uma conexão adequada entre o fuso mitótico e os cromossomos. Para estudar isso, os cientistas microinjetaram reagentes indutores de SAC em embriões transgênicos e analisaram mitose usando imagens de células vivas. Os resultados mostram cinetochores presos, demonstrando células que não conseguem progredir através da mitose.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre imagens de células ao vivo de mitose. Após uma introdução aos estágios da mitose, este vídeo introduziu importantes considerações e técnicas de análise de dados para imagens de células vivas. Por fim, foram apresentadas aplicações dessa técnica. A imagem de células vivas tem ajudado substancialmente os cientistas na compreensão de mecanismos mitóticos relacionados ao desenvolvimento, manutenção de tecidos e doenças. Como sempre, obrigado por assistir!