Name: Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a isolar células CD34+ de sangue de cordão umbilical humano para estudar diferenciação de megacariócitos e produção de plaquetas. Este método padronizado alcança pureza de 90-99% e permite investigar megacariopoiese e ativação plaquetária.

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Os autores reconhecem o apoio da saúde australiano e Medical Research Council (projeto concessão 1012409 ligado ao BHC).

Este protocolo foi aprovado pelo sul oriental Sydney humano pesquisa Comitê de ética e ratificado pela Comissão de ética de pesquisa humana a Universidade de New South Wales'. Sangue de cordão umbilical obtido de doadores saudáveis foi fornecido por o Sydney banco de sangue (Sydney, NSW, Austrália). Volumes de cerca de 100 mL foram utilizados para este procedimento.
Nota: Trabalho em uma segurança biológica classe II gabinete utilizando técnica asséptica. Descontaminar o exterior do saco de sangue de cordão com etanol a 70%. Use instrumentos esterilizados (tesouras, pinças) para este procedimento.
1. cabo de isolamento de CD34 e preparação de glóbulos+ células
<ol>
	<li>Prepare o tampão estéril de separação (SB) com solução salina tamponada fosfato (PBS), em pH 7,2 e contendo 0,5% bovina albumina de soro e 2 mM EDTA.</li>
	<li>Dispense 10 mL de SB em um tubo cónico de 50 mL (um tubo por 10 mL de sangue é necessário). Usando uma agulha montada em uma seringa de 10 mL G18, retirar 10 mL de sangue do saco e distribuir para os tubos de 50 mL contendo 10 mL de SB.</li>
	<li>Adicione 15 mL de mídia de separação de linfócitos (ver Tabela de materiais) para o fundo do tubo contendo o sangue diluído, criando duas camadas. Observação: Consomem mídia lentamente na parte inferior do tubo para evitar misturar as diferentes camadas.</li>
	<li>Centrifugar tubos em 1.200 × g por 30 min à temperatura ambiente (RT) sem interrupção e sem aceleração.</li>
	<li>Transferi a camada perto do centro do tubo contendo células mononucleares (aproximadamente 5-10 mL de cada tubo) em um novo tubo de 50 mL com uma pipeta Pasteur. Adicione SB para cada tubo para um volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 400 × g por 10 min a RT. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda pelotas célula cuidadosamente com uma pipeta Pasteur em 5-10 mL de SB Combine as células suspensas e trazer volume para 50 mL com SB.</li>
	<li>Contagem de células usando Trypan azul coloração e um hemocytometer ou automatizada de células contador (ver Tabela de materiais). Para determinar a porcentagem de CD34+ células na amostra, Ressuspender 2,5 × 105 em 100 µ l de SB e mancha, adicionando 10 µ l de anticorpo anti-CD34-PE por 15-30 min a 4 ° C. Análise por citometria de fluxo (figura 1A).</li>
	<li>Tubos de centrífuga a 400 × g por 10 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante. Nota: se não for necessário imediatamente, células mononucleares podem ser congeladas nesta fase.</li>
	<li>Ressuspender as células em 300 µ l de SB por 108 células. Adicione 100 µ l de IgG humana FcR (bloqueio de reagente, consulte Tabela de materiais) e 100 µ l de CD34 grânulos magnéticos por 108 células. Misture delicadamente e incubar a 4 ° C por 30-40 min. Nota: Uma suspensão de célula única é necessária (se necessário, passar as células embora um filtro 30 µm antes de adicionar os reagentes). Use os volumes de reagente descritos aqui por 10 células de8 ou menos. Para mais de 108 células, aumenta os reagentes (SB, bloqueando a solução e grânulos magnéticos CD34) conformemente.</li>
	<li>Prepare a coluna de separação é durante o período de incubação, colocando a coluna de LS em um suporte magnético e o efluente de lavagem com 3 mL de SB Discard. Nota: Colunas de separação de LS podem ser carregadas com até 2 × 108 células total. Colunas maiores e menores estão disponíveis.</li>
	<li>Adicionar 5-10 mL de SB para a mistura de células e centrifugar 400 × g por 10 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de SB e carregar a suspensão de eritrócitos (1,5 mL) para a coluna de LS. Colete o fluxo que contém as células sem rótulo em um tubo de coleta de 15 mL (fração negativa #1). Deixe o líquido escorrer e lavar a coluna com 1,5 mL de SB.</li>
	<li>Carregar o fluxo coletado através de (3 mL) volta para a coluna e coletar o fluxo através do tubo de coleta 15 mL mesmo (fração negativa #1). Lave a coluna de LS 3 vezes com 3 mL de SB. Nota: Se necessário, as células na fração negativa (12 mL) podem ser manchadas com anticorpo anti-CD34 para apurar a captura de CD34+ células pela coluna LS.</li>
	<li>Remover coluna a partir do separador magnético e irrigue células lentamente com um êmbolo da seringa para um novo tubo de 15 mL com 2 mL de SB.</li>
	<li>Coloque a coluna volta no separador magnético e carga a 2 mL de células volta para a coluna. Coletar o fluxo através de e lavar com 2 mL SB. Esta é a fração negativa #2 (4 mL).</li>
	<li>Remover coluna LS de separador magnético e adicionar 2 mL de SB Flush células firmemente e firmemente com um êmbolo da seringa para coletar o CD34+ fração de célula. Conte as células com coloração azul trypan e um hemocytometer ou contador automatizado de células.</li>
	<li>Tubo de centrífuga com a fração positiva a 400 × g por 15 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em media serum-free para CD34+ células (SFM, consulte Tabela de materiais). Nota: se não for necessário, imediatamente, as células podem ser congeladas em nitrogênio líquido nesta fase.</li>
</ol>
2. seleção pureza de CD34 isoladas células+
<ol>
	<li>Mancha de 2 x 104 células da fracção positiva com 10 µ l anti-CD34-PE anticorpo e anticorpo anti-CD45-PerCP de 20 µ l por 15 min a 4 ° C (use um separado tubo para controles do isotipo) (figura 1B).</li>
	<li>Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 × g por 10 min. Ressuspender pelota em 200 µ l de SB.</li>
	<li>Realizar análise de fluxo cytometric e portão a população de células vivas para excluir os detritos (figura 1B). Definir o portão para PE PerCP positivo as populações e usando os controles de isotipo PE e PerCP (figura 1B) e determinar a porcentagem de CD34+/CD45+ células.</li>
</ol>
3. megacariócito diferenciação
<ol>
	<li>Semente de 5 × 105 células/mL CD34+ em 2 mL de SFM suplementado com 50 ng/mL Trombopoietina humana recombinante (rhTPO) por bem em uma placa de 12 células. Incube as células a 37 ° C, 5% de CO2 em um ambiente umidificado. Se as células são confluentes, antes que eles são necessários para a análise, colher as células e dividir em vários poços com mídia fresca e rhTPO. Nota: Dois ou três poços devem ser preparados especificamente para monitorar a diferenciação em pontos de tempo diferente (por exemplo, dias 7, 9 e 10).</li>
	<li>Colher células dos poços reservou para monitorar diferenciação sem perturbar as células em outros poços.</li>
	<li>Mancha de células com anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC de 20 µ l e 10 µ l anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 anticorpo um volume final de 100 µ l. configurar um controle tubo usando anticorpos respectivos do isotipo controle. Incubar durante 15-30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Adicione 1 mL de SB para lavar.</li></ol>Centrifugar a 400 × g por 10 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 200-300 µ l de SB Analyze por citometria de fluxo.
	<li>Para cada fluoróforo, analise os isotipo controles para definir o canal para FITC e Alexa farinha 647 populações positivas. Analisar as amostras de células coradas para determinar a porcentagem de CD41+/CD42a+ duplo células positivas, que representam MK maduro (Figura 1).</li>
	<li>Para visualização microscópica de célula marcadores de superfície mancham células conforme descrito no ponto 3.3.<ol>
		<li>Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 × g por 10 min. resuspenda o pellet em 100 µ l de SB e girar numa lâmina de vidro a 1.000 x g, durante 5 min. Fix células no slide mergulhando em metanol por 30 s. ar seco, adicionar 20 µ l de mídia contendo DAPI de montagem (ver Tabela de materiais) , cobrir com uma lamela e Visualizar usando um microscópio fluorescente (Figura 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para visualização dos antígenos intracelulares, Ressuspender as células em PBS e corrigir com paraformaldeído (concentração final de 1%) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para permeabilize as células, adicionar o triton-X100 (0,1%) e incube por 15 min. células de lavagem com 2 mL PBS/0.1% triton-X100. Resuspenda em 100 µ l de PBS/0.1% triton-X100, adicionar anti vWf e anti CD62p anticorpos (diluição de 1: 200) e incube por 30 min à temperatura ambiente.<ol>
		<li>Lavar com 2 mL PBS/0.1% triton-X100 e centrifugar a 400 × g por 10 min, resuspenda em 100 µ l de buffer mesmo e adicionar anti-mouse IgG-Alexa 594 e anti-coelho IgG-Alexa 488 (1: 100). Incubar durante 30 min à temperatura ambiente, lave com 2 mL PBS/0.1% triton-X100, resuspenda em 100 µ l de buffer mesmo e adicionar 20 µ l de anti CD42b-APC. Em seguida girar as células em lâminas de vidro, conforme descrito na etapa 3.6.1 e preparar amostras para visualização microscópica, conforme descrito na etapa 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para determinação da ploidia, colha células no dias 12 ou 13 de diferenciação. Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 × g por 10 min e mancha com anticorpo de anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µ l em um volume final de 100 µ l. Incubar a 4 ° C por 30 min.<ol>
		<li>Lave uma vez com 1 mL de SB e resuspenda o pellet em 300 µ l de citrato hipotônica tampão (citrato de sódio 1,25 mM, 2,5 mM de cloreto de sódio, glicose de 3,5 mM) contendo 20 µ g/ml propidium iodeto e 0,05% Triton X 100. Incube por 15 min a 4 ° C, protegido da luz.</li>
		<li>Adicionar RNase a uma concentração final de 20 µ g/mL e incube por 30 min a 4 ° C, protegido da luz. Determine a intensidade de iodeto de propidium por citometria de fluxo através da recolha de 30.000 a 50.000 eventos da população CD41-FITC+ (Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet contagem, Enumeração plaquetária e Ativação plaquetária
<ol>
	<li>Colheita de células (da etapa 3.1) cada dias 8 ou 9 da diferenciação e da semente no 1 × 104 células/poço em placas boas 48 em 200 µ l de SFM fresco suplementado com 50 ng/mL rhTPO. Cultura durante 5 dias a 37 ° C, 5% CO2. Nota: Para fins de quantificação, semente wells em triplicado. Esta baixa densidade é necessária para a visualização e contagem dos proplatelet-rolamento Proplatelets MK geralmente começam a aparecer depois de 2 dias de cultura. O pico é entre os dias 4 e 5.</li>
	<li>Conte o número de proplatelet-rolamento MK no poço inteiro em um microscópio invertido usando 10 X ou 20 X de objectivos. Nota: Um palco de microscópio aquecida (37 ° C) é preferível, desde que manter as células à temperatura ambiente por períodos prolongados provoca encolhimento das extensões de proplatelet. Proplatelets são observados como longas extensões do corpo MK. Cada MK pode ter várias saliências proplatelet. Como desenvolver proplatelets, o corpo do MK diminui de tamanho.</li>
	<li>Colheita de células e centrifugar a 400 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Mancha de células com anticorpo anti-humano CD41-FITC 20 µ l como descrito nos passos 3.3 e 3.4. Calcular a porcentagem de MK proplatelet-rolamento (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-rolamento MKs/bem) / (Total CD41+ células / bem)] x 100</li>
	<li>Para contar as plaquetas lançadas no meio de cultura, delicadamente misture as células com uma pipeta Pasteur e coletar 100 µ l em dias 14 ou 15 da cultura.<ol>
		<li>Mancha com 20 µ l anti-humano CD41-FITC de anticorpos para 20-30 min a 4 ° C. Configure um tubo de controle usando o respectivo do isotipo controle anticorpo.</li>
		<li>Adicione 150 µ l de SB e 50 µ l de contagem de grânulos.</li>
		<li>Para análise de fluxo cytometric, defina o FSC e SSC para escala de log. Uso normais plaquetas sanguíneas humanas do plasma rico em plaquetas manchado com CD41-FITC, conforme descrito na seção 4.4.1 para definir o canal para plaquetas (Figura 3A).</li>
		<li>Analise as plaquetas manchadas com a contagem de grânulos por citometria de fluxo. Colete 1.000 eventos de contagem de contas usando o FSC contra SSC gráfico de dispersão (Figura 3A). Calcule o número de plaquetas com base em eventos positivos CD41-FITC (Figura 3B) usando a fórmula: Plaquetas por µ l = [(número de eventos positivos CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/volume de amostra)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para analisar a ativação plaquetária, delicadamente misture as células com uma pipeta Pasteur e coletar 100 µ l em dias 14 ou 15 da cultura. Adicione 1 mL do Tyrode buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12mm NaHCO3, 5,5 mM D-glicose, pH 6,5) e centrifugar a 200 x g por 5 min para células de Pelotas.<ol>
		<li>Recolha o sobrenadante e centrifugar a 800 x g durante 10 minutos para as plaquetas de tamanho de partículas de Pelotas.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender em 100 µ l de tampão de Tyrode. Adicionar 20 µ l de anticorpo PAC1-FITC e difosfato de adenosina (ADP) a uma concentração final de 20 µM. Incubar à temperatura ambiente por 20 min. análise por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de eventos positivos FITC. Uso de plaquetas humanas frescas trataram da mesma maneira como um controle positivo (Figura 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
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<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
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<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui é adequado para uma produção consistente de MK e plaquetas na cultura do sangue do cordão umbilical. Estas células podem ser usadas para estudar vários processos tais como o efeito de drogas ou atividades biológicas na MK proliferação, diferenciação, proplatelet de formação e produção de plaquetas.
Uma variedade de meios de cultura e combinações de citocinas foram apresentados na literatura. Adição de citocinas, como fator de células-tronco, ligante de Flt-3, IL-3 e I...

Isolamento de números adequados de megacariócitos humanos primários (MK) para uso em laboratório regular não é viável devido a sua baixa frequência na medula óssea, onde eles representam ~0.01% de células nucleadas1. Uma alternativa conveniente é a expansão ex vivo e diferenciação de tronco hematopoiético e células progenitoras na presença de fatores de crescimento específicos. Um número de citocinas, incluindo o fator de células-tronco (SCF; c-kit ligand) e interleucina (IL) -3 e IL-11 foram empregadas nos sistemas de cultura para produzir MKs. Thrombopoietin (TPO) é o fator mais eficaz de crescimento e diferenciação para culturas megakaryocytic e é eficaz, sozinho ou com outras citocinas, tais como SCF e IL-32. TPO pode agir sobre as populações de células-tronco para ocasionar a proliferação e a maturação dos MKs2.
E MK produzem plaquetas de protrusões citoplasmáticas, chamados proplatelets, in vivo, aproximadamente 1 x 1011 plaquetas formada diariamente para manter a contagem de plaquetas de 150-400 x 109plaquetas /L. produção em vitro é até 1000 -Dobre inferior a na vivo estima3, e isto tem dado origem a inúmeras condições de cultura usando CD34+ células progenitoras hematopoiéticas para melhorar MK e plaquetas produção em vitro. A fonte inicial de CD34+ células utilizadas para diferenciação de MK foi sangue periférico humano4. Outras fontes de célula incluem a medula óssea5,6, células-tronco embrionárias/induzida (ESC/iPSC) as células-tronco pluripotentes7e cordão umbilical sangue (UCB)8,9,10 . Medula óssea humana CD34+ 11 e mouse linhagem negativa da medula óssea células5 produtos MK e plaquetas in vitro; no entanto, a falta de disponibilidade de medula óssea humana limita a sua utilização como fonte de CD34+ células. Em contraste, ESC e iPSC representam uma fonte ilimitada de células para a produção de plaquetas em vitro . Produção de plaquetas a partir dessas células requer alimentador células como murino células OP9 e períodos mais longos de cultura. As plaquetas derivadas no alimentador-free condições parecem ser menos funcional12. iPSC-derivado de plaquetas são susceptíveis de ser de uso em ambientes clínicos desde que eles podem ser expandidos para grande escala. Este processo requer transdução mediada por Lentivirus de fatores de transcrição e de cultura de células a longo prazo13.
UCB é uma fonte acessível de CD34+ células que podem ser facilmente usadas em configurações de pesquisa. TPO sozinho pode promover a diferenciação da medula hemoderivados CD34+ células e isto dá origem a MKs altamente puro, maduro, sem a necessidade de suplementação de soro ou co-cultura com células do alimentador. Outras citocinas tais como SCF pode diminuir a diferenciação da UCB CD34+ células, enquanto o ligante Flt-3 e IL-11 promovem a produção de megacariócitos imaturo14. Este protocolo descreve a produção de culturas de MK altamente puras do sangue do cordão CD34+ células em condições de livre de soro.

<table><tbody><tr><td>Reagentes de Cultura de Células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Meio sem soro para células CD34+</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td> Reagentes de Isolamento CD34</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 Kit MicroBead ultrapuro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Este kit inclui o reagente bloqueador de IgG humano FcR e microesferas CD34. Essas esferas contêm o clone de anticorpo anti-CD34 QBEND / 10. Use um clone anti-CD34 diferente para verificação de pureza (por exemplo, clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Meios de separação de linfócitos (densidade 1,077 g/mL)</td></tr><tr><td>Tampão de separação estéril (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Este tampão contém solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 contendo 0,5% de albumina de soro bovino e 2 mM de EDTA. Pode ser preparado usando componentes estéreis de grau de cultura de células. Desgaseifique antes de usar porque as bolhas de ar podem bloquear a coluna.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Citometria de fluxo e reagentes de coloração celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. Isso pode ser usado para verificação de pureza CD34. Concentração final de anticorpos diluição de 1:10.</td></tr><tr><td>PerCP camundongo anti-humano CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>diluição 1:10</td></tr><tr><td>PerCP controle isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>diluição 1:10</td></tr><tr><td>FITC Camundongo anti-humano CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Concentração final de anticorpos diluição 1:5.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-humano CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Este anticorpo também pode ser usado para detectar MK maduro (a porcentagem de células positivas geralmente é menor do que com anti CD42a). Concentração final de anticorpos diluição de 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Atualmente distribuído pela Bio-Rad. Concentração final de anticorpos diluição de 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Controle Negativo</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Atualmente distribuído pela Bio-Rad. Anticorpo de controle de isotipo</td></tr><tr><td>Anti fator von Willebrand coelho policlonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>V450 camundongo anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1:20 diluição</td></tr><tr><td>V450 controle isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>diluição 1:20</td></tr><tr><td>PAC1-FITC anticorpo</td> BD <td>Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 diluição</td></tr><tr><td>Anti CD62p camundongo monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>diluição 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti camundongo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>diluição 1:100</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Anticorpo de controle de isotipo</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Sondas Moleculares, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Contas de contagem</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Colunas menores e maiores também estão disponíveis comercialmente</td></tr><tr><td>Ímã separador MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL tubos FACS de polipropileno de fundo redondo, com tampa de pressão, tecnologias estéreis</td><td>in vitro</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>lâminas</td> <td>de vidroMídia de montagem Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Mídia de montagem antifade com DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Leica</td><td>DMIRB microscópio</td><td></td>invertido</tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analisador celular</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Cytospin ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Catálogo Número</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td>Software analisador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>células</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de células únicas</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Software para microscópio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados cd34 células+

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A produção de plaquetas ocorre principalmente na medula óssea em um processo conhecido como thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, células progenitoras hematopoiéticas diferenciam de precursores de plaquetas de formulário chamados megacariócitos, que diferenciam terminal para liberar as plaquetas de processos citoplasmáticos tempo denominados proplatelets. Megacariócitos são células raras confinadas à medula óssea e, portanto, são difíceis de colheita em número suficiente para uso em laboratório. Produção eficiente de megacariócitos humanas pode ser alcançada em vitro por cultivo CD34+ células sob condições apropriadas. O protocolo detalhado aqui descreve o isolamento de CD34+ células por célula magnética, classificação de amostras de sangue de cordão umbilical. São descritos os passos necessários para produzir megacariócitos altamente puros, maduros, em condições de livre de soro. Detalhes de análise fenotípica de diferenciação megacariócito e determinação da produção proplatelet de formação e plaquetas também são fornecidos. Efetores que influenciam a diferenciação do megacariócito e/ou formação proplatelet, tais como anticorpos anti-plaquetários ou mimetics trombopoietina, podem ser adicionados às células cultivadas para examinar a função biológica.

Este protocolo permite a preparação das culturas de MK altamente puras do cordão hemoderivados CD34+ células. A porcentagem de CD34+ células na medula sangue é, aproximadamente, 1,3%15 (figura 1A) e o número total de células mononucleares (passo 1.8) intervalos de 90-300 x 106 por unidade da UCB. A pureza do CD34 + / CD45 + células após intervalos de isolamento de 90 a 99% (figura 1...

Uma população altamente pura de megacariócitos pode ser Obtida de cordão hemoderivados CD34+ células. Um método para CD34+ diferenciação de isolamento e megacariócito célula está descrita aqui.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

O objetivo geral deste procedimento é usar amostras de sangue do cordão umbilical humano para isolar células CD34-positivas puras para estudar os efeitos de drogas específicas de interesse na diferenciação de megacariócitos, formação de plaquetas e produção de plaquetas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o campo de megacariócitos e plaquetas, como quais são os efeitos de um tratamento específico na diferenciação de megacariócitos e na produção e função de plaquetas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método para o isolamento consistente de células CD34-positivas viáveis do sangue fresco do cordão umbilical.Através deste método pode fornecer informações sobre a megacariopoiese, outros tipos de células, como linfócitos, eritrócitos e macrófagos, também podem ser estudados. Comece adicionando 10 mililitros de tampão de separação em um tubo cônico de 150 mililitros por 10 mililitros de sangue do cordão umbilical. Usando uma agulha romba de calibre 18 montada em uma seringa de 10 mililitros, transfira 10 mililitros de sangue para cada tubo, seguido pela adição de 15 mililitros de meio de separação de linfócitos no fundo de cada tubo.Separe as células por centrifugação de gradiente de densidade e, no final da centrifugação, colete cuidadosamente cinco a 10 mililitros de célula mononuclear contendo camada de revestimento leucocitário em um novo tubo por amostra. Aumente o volume total em cada tubo para 50 mililitros com um novo tampão de separação e centrifugue as células novamente. Ressuspenda os pellets em cinco a 10 mililitros de tampão de separação fresco e agrupe as amostras de células.Ajuste o volume para 50 mililitros com tampão de separação fresco para contagem e reserve 100 microlitros de células para determinar a porcentagem de células CD34 positivas por citometria de fluxo. Centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de separação, 100 microlitros de reagente bloqueador de IgG humano receptor FC e 100 microlitros de esferas magnéticas CD34 por uma vezes 10 elevado às oitavas células. Misture as células delicadamente antes de colocá-las a quatro graus Celsius para uma incubação de 30 a 40 minutos.Durante a incubação, coloque uma coluna de separação de esferas magnéticas de tamanho apropriado no suporte magnético correspondente e lave a coluna com três mililitros de tampão de separação. No final da incubação, remova os grânulos não ligados por centrifugação em cinco a 10 mililitros de tampão de separação e ressuspenda o grânulo magnético e o pellet da célula em 1,5 mililitros de tampão de separação fresco. Carregue as células marcadas na coluna e colete o fluxo não rotulado em um tubo de coleta de 15 mililitros.Carregue o efluente de volta na coluna e colete a segunda rodada de fluxo no mesmo tubo de coleta. Em seguida, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de separação e remova a coluna do ímã. Usando o êmbolo da coluna, lave gradualmente dois mililitros de tampão de separação através da coluna em um novo tubo de 15 mililitros e retorne a coluna ao ímã.Carregue as células liberadas de volta na coluna. Colete o fluxo e lave a coluna com dois mililitros de tampão de separação, conforme demonstrado. Depois de remover a coluna do ímã, lave a coluna com dois mililitros de tampão de separação fresco para coletar a fração de células CD34-positivas, como acabamos de demonstrar, e colete as células CD34-positivas por centrifugação.Em seguida, ressuspenda o pellet em meio sem soro para células CD34-positivas. Para diferenciação de megacariócitos, semear cinco x 10 até a quinta células CD34-positivas por mililitro em 2 mililitros de meio livre de soro, suplementado com trombopoetina humana recombinante por poço em uma placa de 12 poços para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, em uma atmosfera umidificada. Nos pontos de tempo de monitoramento de diferenciação apropriados, colha as células de dois a três poços por ponto de tempo sem perturbar as células nos outros poços e cove as células coletadas com anticorpos anti-CD41 e anti-CD42a para determinar a porcentagem de megacariócitos maduros dentro das culturas.Para visualização microscópica nos marcadores da superfície celular, lave as células colhidas em 1 mililitro de tampão de separação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão fresco. Use um citospin para semear as células em uma lâmina de vidro e fixe as células na lâmina com uma submersão de 30 segundos em metanol. Após a secagem ao ar, rotule as células com 20 microlitros de meio de montagem suplementado com DAPI e cubra as células com uma lamínula para visualização por microscopia fluorescente.Para contar as plaquetas, colha as células no oitavo ou nono dia de diferenciação e semeie as células coletadas em uma x 10 até a quarta célula por 200 microlitros de meio fresco livre de soro, suplementado com trombopoetina humana recombinante por poço em uma placa de 48 poços. Após cinco dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, conte o número de megacariócitos portadores de plaquetas por poço em um microscópio de luz invertida, usando a objetiva de 10 ou 20 vezes. Para analisar a ativação plaquetária, no dia 14 ou 15 de cultura, misture suavemente as células com uma pipeta Pasteur e colete 100 microlitros de células.Adicione 1 mililitro de tampão de Tyrode às células e pelete-as por centrifugação. Colete o sobrenadante para centrifugação para pellet as partículas do tamanho de plaquetas e ressuspenda as partículas em 100 microlitros de tampão de Tyrode fresco, depois rotule as partículas com anticorpo anti-PAK1, ative-as com o difosfato de adenosina por 20 minutos à temperatura ambiente e analise a porcentagem de eventos positivos para PAK1 por citometria de fluxo. A porcentagem típica de células CD34-positivas no sangue do cordão umbilical é de aproximadamente 1,3% e a pureza das células CD34-positivas CD45-positivas após o isolamento varia de 90 a 99% Os megacariócitos CD41-positivos são observados precocemente em culturas de células CD34-positivas sem soro, com a porcentagem de megacariócitos CD41-positivos CD42a-positivos maduros atingindo 30 a 40% no dia 7, e os níveis mais altos de células duplamente positivas observados entre os dias 10 e 12 de diferenciação.Os megacariócitos cultivados aparecem como células grandes, geralmente multinucleadas, que expressam o fator de Von Willebrand CD42b e a P-selectina em seu citoplasma. Pelo menos três classes de ploidia também são comumente observadas nessas culturas de células. A porcentagem de megacariócitos que carregam proplaquetas, fibras longas que se estendem do corpo do megacariócito, é tipicamente em torno de 1,3%A maioria das plaquetas no sobrenadante da cultura de células cai dentro da porta analítica das plaquetas do sangue periférico, são positivas para o marcador plaquetário CD41, podem ser ativadas por agonistas plaquetários como o difosfato de adenosina, conforme demonstrado por uma ligação aumentada do anticorpo monoclonal PAK1 específico de ativação.Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como isolar células CD34-positivas do sangue do cordão umbilical. Você também poderá configurar culturas de diferenciação de megacariócitos, contar proplaquetas e analisar plaquetas e megacariócitos produzidos in vitro. Não se esqueça de que trabalhar com amostras humanas pode ser perigoso, e precauções, como trabalhar em um gabinete de segurança biológica classe II, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. As células-tronco progenitoras hematopoiéticas - isoladas do sangue do cordão umbilical humano - diferenciam-se em megacariócitos maduros na presença de trombopoietina. Os megacariócitos maduros produzem extensões citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dão origem a plaquetas individuais.

Um método in vitro para a diferenciação de megacariócitos e formação de plaquetas

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Este protocolo descreve em detalhes todas as etapas envolvidas na obtenção de progenitores hematopoiéticos derivados de leucofilter e sua diferenciação in vitro e maturação em megacaiócitos portadores de proplatelet que são capazes de liberar plaquetas no meio da cultura. Este procedimento é útil para uma análise aprofundada dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a megacaripoiese.

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Diferenciação e Formação de Plaquetas

Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.

Imunofenoftipagem e Triagem celular de MKs humanos de fontes primárias humanas ou in vitro diferenciados de progenitores hematopoiéticos

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

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Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Aprenda a isolar células CD34+ de sangue de cordão umbilical humano para estudar diferenciação de megacariócitos e produção de plaquetas. Este método padronizado alcança pureza de 90-99% e permite investigar megacariopoiese e ativação plaquetária.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células⁺

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