Name: Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a expressar proteínas de superfície em micobactérias usando decoração com proteínas recombinantes via sistema avidina-biotina. Este método não genético oferece uma alternativa rápida às abordagens tradicionais para desenvolvimento de vacinas BCG.

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Agradecemos o Dr. R Stokes para a cepa BCG Pasteur e r. Talal para suporte técnico. Agradecemos também o GenScript para obter ajuda com a síntese do gene.

Todos os animais foram mantidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado Animal e comissões de utilização na Universidade da Colúmbia Britânica. Experimentos foram aprovados pelos comitês de uso e cuidado Animal e executados de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal. O número de bem-estar animal garantia é A11-0247.
1. geração de proteínas da fusão Avidin monomérico expressando plasmídeos
<ol><li>Clone sub avidin monomérico sequência12 em plasmídeo pDEST17 entre os sites "CTC" e "Ga", que corresponde a 133-134bp. (ou seja, entre o 6-histag e o site de recombinação Attr1 pDEST17) para obter p17-Avi. Nota: A sequência de DNA monomérico avidina é mostrada abaixo. As três mutações introduzidas no selvagem-tipo Avidin obter avidin monomérico são mostradas em caracteres em negrito. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Projetar primers ladeados com AttB1 e B2 Attsites correspondentes a óvulos polipeptídeo757-1035 (-Ab- e H-2_Kb-restrito epítopos) sequência de ADN. Primeira demão sequências são: Attb1-OVA B2-óvulos GregorioACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT e Att GregorioACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 e Attb2 sequências estão em negrito).<ol>
<li>PCR-amplificação de óvulos polipeptídeo757-1035 sequência de DNA com os primers acima usando o plasmídeo pUC57-óvulos como um modelo.</li>
		<li>Clone os produtos PCR em pDONR-221 através de uma site-specific em vitro recombinação reação (por exemplo, BP Clonase) para obter pDONR-óvulos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência do gene de interesse em p17-Avi usando a reação de Clonase LR para obter p17-Avi-óvulos. Nota: Para detalhes da BP e LR recombinação clonagem, consulte o manual do fabricante.</li>
</ol>2. expressão de proteínas de fusão monomérico Avidin, purificação e dobrar
<ol><li>Transformar o plasmídeo p17-Avi-óvulos em Escherichia coli BL21 e induzir a 250 mL de Escherichia coli BL21 cultura com IPTG (0,1 M) para 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>
Lise de bactérias e solubilização de corpos de inclusão
	<ol>
<li>Pelota a 250 mL de cultura de BL21 induzida por 30 min de centrifugação em 4.000 x g e a 4 ° C.</li>
		<li>Coletar pelotas em 10 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCL, NaCl, de 150 mM 6 M guanidina-HCL, pH 1,5-2,5) e incube por 15 min a 95 ° C. Incube durante uma noite em temperatura ambiente em rotacao.</li>
		<li>Centrífuga de 30 min em 15.000 x g e 4 ° C e coletar sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purifica o Avi-óvulos de sobrenadante (fração de corpos de inclusão solubilizado) usando colunas Ni-NTA.
	<ol>
<li>Dilua 1:2 de corpos de inclusão com Lise.</li>
		<li>Use 4 mL de resina Ni-NTA por 250 mL de cultura-derivada de corpos de inclusão.</li>
		<li>Lave 3x com 10 mL de tampão de lise (pH 7.0).</li>
		<li>Eluir com 10 mL de tampão de eluição (lise tampão pH 7,0 com imidazol 250 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Redobrar a proteína eluted por diluição gradual (01:10) e rápida num Vortex em tampão Tris (pH 7,5) contendo 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 mM Tween 80, arginina 500 mM e 200 mM de NaCl durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>De sal e troca de amortecedor dobrado proteína de tampão Tris em PBS com concentradores de proteína de acordo com os protocolos do fabricante.</li>
	<li>Remover agregados por centrifugação por 30 min em 3.500 x g e a 4 ° C e armazenar as alíquotas de proteína solúvel a-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylation da superfície celular de BCG
<ol><li>Crescer a BCG em Middlebrook 7H 9 caldo com 10% OADC (ácido oleico, solução de albumina e dextrose) e 0,05% de Tween 80 a 37 ° C em uma plataforma de abanador a 50 rpm até OD = 0.5-1. Nota: O BCG é um patógeno de nível 2 de biossegurança e todas as experiências relativas à BCG devem ser feitas em uma armário com equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.</li>
	<li>Lave 109 BCG 3 vezes com 500 µ l de PBS livre de endotoxinas gelada mais 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Suspenda a pelota de BCG na enciclopédia PBS estéril endotoxinas.</li>
	<li>
Imediatamente antes do uso, prepare-se 1 mL de biotina de Sulfo-NHS SS 10 mM em água filtrada estéril.
	<ol>
<li>Incube as bactérias com 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS em temperatura ambiente por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavagem rotulada bactérias 3 vezes com 500 µ l de PBST frio gelado para remover não reagidos biotinylation reagente.
	<ol>
<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para avaliar a eficiência de biotinylation, mancha 108 biotinilado BCG com Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µ l) em temperatura ambiente por 20 min.
	<ol>
<li>Incubar as bactérias coradas em 1 mL de 2% PFA por 20 min em temperatura ambiente e então examinar os níveis de biotinylation por análise de citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o fenótipo de micobactérias biotinilado: crescimento e sobrevivência
<ol><li>
Crescem as cepas de BCG em Middlebrook 7H 9 caldo com 10% OADC (ácido oleico, solução de albumina e dextrose) e 0,05% de Tween 80 a 37 ° C em uma plataforma de abanador a 50 rpm.
	<ol>
<li>Grave a densidade óptica (OD600) de cultura bacteriana ao longo de um período de 8 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Use o BCG-Luc (descrito anteriormente9) para detectar a sobrevivência de bactérias em macrófagos.
	<ol>
<li>Infectar células RAW264.7 com biotinilado BCG-Luc (MOI 10:1) ou não tratada BCG-Luc (controle) e incubadas a 37 ° C, mais um 48 h, período de tempo.</li>
		<li>Lave monocamadas de células e em seguida lyse com 0.025% SDS para liberar bactérias ingeridas.</li>
		<li>Medir a produção de bioluminescência com sistema de ensaio de Luciferase e luminómetro. Nota: O sinal de luminescência é indicativo de viabilidade bacteriana. Refira por favor o manual do fabricante para obter detalhes do ensaio de luciferase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ligação de proteína monomérica de avidina-fusão à superfície de BCG biotinilado
<ol><li>Misture 5 x 108 biotinilado BCG com Avi-proteína (final de 10 μg/mL em PBS-T) por 1h à temperatura ambiente na plataforma do agitador.</li>
	<li>Bactérias de lavagem 3 vezes com 500 µ l de PBST frio gelado e mancha com anticorpo de coelho antiavidina (Ab) (diluição 1: 100, descrito anteriormente10) por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, com FITC Conjugado IgG Ab nas mesmas condições de cabra anticoelho.</li>
	<li>Lavar as bactérias 3 vezes com 500 µ l de PBST e analisar por citometria de fluxo, para avaliar a extensão da decoração de superfície.</li>
</ol>6. liofilização de micobactérias
<ol><li>Biotinylate bactérias de acordo com o passo 3.1-3.4 e casaco biotinilado bactérias com Avi-óvulos conforme item 5.1.</li>
	<li>Alíquota biotinilado e bactérias revestidas (108), lavagem com PBS e ressuspender em mídia de liofilização de 0,5 mL (meio de Sauton de 25%, 75% H2O e 1,5% at-glutamato).</li>
	<li>Transferir as bactérias para frascos de vidro e congelar em um freezer-80 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lyophilize frascos de vidro enchido e congelados para 24 h, usando um secador de gelo.</li>
	<li>Armazenar as amostras secas à temperatura ambiente e reconstituir em PBS, quando necessário.</li>
	<li>Repita a etapa 3.5 avaliar biotinylation e superfície de revestimento estabilidade.</li>
</ol>7. fagocitose ensaio
<ol><li>Cresce 264.7 pilhas de macrófagos em pratos de cultura de diâmetro de 10 cm em DMEM médio contendo 5% FCS, 1% cada de L-glutamina, HEPES, não aminoácidos essenciais e penicilina e estreptomicina até a confluência de 70-80%.</li>
	<li>Sementes de 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos em uma placa de 6. Permitir que as células a aderir a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Gerar DsRed BCG (descrito anteriormente9) decorado com Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-óvulos) de acordo com passos 3.1-3.4 e 5.1.</li>
	<li>Infectar células crus com DsRed BCG-Avi-óvulos ou não tratada DsRed BCG em MOI 20:1 para 24h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavar as células três vezes e trypsinize com 1 mL de tripsina 0,25% a 37 ° C por 10 min para remover bactérias parcialmente isoladas.</li>
	<li>Corrigir em 2,5% PFA em PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 3x com PBS e analisar por citometria de fluxo.</li>
</ol>8. intracelular tráfico de óvulos decorado biotinilado BCG em macrófagos
<ol><li>
Microscopia de fluorescência
	<ol>
<li>Sementes de 3 x 105 RAW 264.7 células de macrófagos em lamelas em uma placa de 24. Permitir que as células a aderir a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Infectar células de macrófagos com micobactérias (MOI 10:1) em meios de manutenção sem antibióticos a 37 ° C e 5% de CO2 para 4 a 24 h.</li>
		<li>Lavar as células e trypsinize para remover as bactérias de superfície Unidas, não ingerido como na etapa 7.5.</li>
		<li>Células de reparo infectado em 2,5% PFA em PBS por 20 min em temperatura seguido de 3 lavagens com PBS.</li>
		<li>Permeabilize de células no buffer de bloqueio/permeabilização (0,1% Triton X-100, 3% BSA em PBS) por 20 min em temperatura ambiente.<ol>
<li>Anticorpos específicos de uso de interesse (por exemplo, coelho anti-avidin Ab) em 10 μg/mL em permeabilização buffer para 20 min à temperatura seguido de anticorpo secundário (por exemplo, IgG de anti-coelho FITC-bode) por 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavagem de células 3x com PBS, uma vez com água e monte nos slides em 10 μL de meio de montagem aquoso para minimizar fotobranqueamento fluorescência.</li>
		<li>Examinar lâminas de microscopia confocal digital usando um microscópio de epifluorescência equipado com 63 x / 1.4 plano-Apochromat objectivo. Gravar imagens usando uma câmera digital acoplada ao software do microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold coloração e microscopia eletrônica
	<ol>
<li>Sementes de 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos em placas 6-boas.</li>
		<li>Corrigir os macrófagos BCG infectado com 4% PFA para 4 horas em temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as amostras duas vezes com PBS.</li>
		<li>Incorporar amostras em agarose de baixo ponto de fusão de 4% e desidratar em etanol a 70%.</li>
		<li>Transferir amostras de resina acrílica e polimerizar a 50 ° C.</li>
		<li>Corte 60 seções nm com um micrótomo e recolher seções sobre grades de níquel.</li>
		<li>Etiquetar amostras com anticorpos de avidina 10 μg/mL por 1h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite em solução de incubação (PBS e 0,1% BSA) e em seguida lavar com incubação solução conjugada ouro F(ab')2 de ultra pequeno de cabra anticoelho IgG (1/20) por 1h no quarto temperatura em solução de incubação.</li>
		<li>Seções de lavagem em água destilada, mancha em glutaraldeído 2%, lavar, secar ao ar e examinar com microscópio eletrônico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. animal imunização e processamento de órgão
Nota: Todas as etapas devem ser feitas em uma armário de biossegurança.
<ol><li>Passe biotinilado e proteína revestido bactérias através de agulha de1/2G 27 10 vezes para fazer a suspensão de célula única.</li>
	<li>
Tomar 1 x 106 bactérias em 100 μL de PBS livre de endotoxinas e imunizar um feminino camundongos C57BL/6 (-A,b, H - 2Kb, 5-6 semanas) por via subcutânea na nuca do pescoço.
	<ol>
<li>Injete o controle de ratos com 100 μL de PBS sozinho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eutanásia em camundongos imunizados 20 dias pós-imunização por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical.
	<ol>
<li>Isolar o baço e transferi-lo para mídia RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mash-baço através de um filtro de célula de 70 µm com um êmbolo de seringa de 5 mL.
	<ol>
<li>Lavar com 5 mL de RPMI. Centrífuga (800 x g, 3 min) para isolar uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Empobrecem RBC com kit de selecção positiva de biotina rato com biotina-Ter119/eritroide células Ab.</li>
		<li>Centrifugue e ressuspender as células em 10 mL de RPMI completa (FCS de 10%, 1% L-glutamina, 1% penicilina, estreptomicina 1% e 2-ME da 50 μM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. eu-Ab tetrâmero coloração para determinar as frequências de antígeno-específicos CD4+ células T e coloracao intracelular de citocina para determinar as frequências de antígeno-específicas T células liberando citocinas em animais imunizados
<ol><li>
Tetrâmero de coloração
	<ol>
<li>Mancha splenocytes de controle e os ratos imunizados (~ 20 x 106 células) com PE-conjugados-Ab-tetrâmeros de323-339 de óvulos (diluição 1/12,5) para 1 h a 37 ° C em tampão de ligação (PBS com FCS 2% e 0,1% NaN3).</li>
		<li>Adicione AF647 CD4 Ab (01:25) e 7-AAD (para detectar células mortas) para splenocytes por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Analise as amostras por citometria de fluxo.</li>
		<li>Adquira 500.000 eventos na região de CD4 positivo para determinar a frequência de eventos positivos tetrâmero. Nota: Total splenocytes são definidos pelo Borrão de ponto SSC/FSC, células vivas pela exclusão dos eventos positivos 7-AAD e subconjuntos de CD4 por retenção de eventos positivos AF647.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frequência do antígeno específico Cytokine Intracellular liberando células T
	<ol>
<li>Transferência de cerca de 1 × 107 splenocytes em 4 mL de meio RPMI completo em seis poços chapas com ou sem óvulos recombinantes (10 µ g/mL) e incubar durante 16 h.</li>
		<li>Trate as células com A Brefeldin (1:1, 000) para um adicional 5 h.</li>
		<li>Lavagem com PBS e sujeitos a citocinas intracelulares de coloração como segue:<ol>
<li>Mancha de amostras de células CD8-PE ou PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 em tampão de ligação) em temperatura ambiente por 30 min.</li>
			<li>Corrigir em 4% PFA em temperatura ambiente por 20 min.</li>
			<li>Permeabilize usando solução de permeabilização, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
			<li>Lave as células e etiqueta com IFN-γ conjugados a AF647 Ab (01:50) por 20 min em temperatura ambiente.</li>
			<li>Lavar as células e sujeito a análise de citometria de fluxo, como descrito acima.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nós relatamos neste estudo uma abordagem não-genético para exibição rápida e eficaz de proteínas exógenas na superfície de BCG para adicionar propriedades funcionais específicas eficientemente melhore imunogenicidade da bactéria ou antígenos específicos. Demonstrámos que superfície celular BCG pode ser facilmente biotinilado para decoração de superfície instantânea com proteínas da fusão avidina. O procedimento total pode ser realizado até 2 horas, enquanto transformação genética e seleção de clones positivos requer 2 a ...

Várias estratégias têm sido propostas para substituir a atual vacina contra tuberculose BCG, incluindo sistemas de adjuvante da proteína, tecnologias em vetor virais, M.tb cepas atenuadas e cepas de BCG geneticamente modificadas, também para introduzir genes excesso, expressando antígenos de BCG que não são suficientemente expressa durante infecção1 ou Mtb-antígenos específicos, não presentes na BCG2. Engenharia genética, no entanto, enfrenta muitos obstáculos, incluindo o nível incerto de segurança, o processo demorado e a baixa eficiência de expressão vetores4,5. Com relação à melhoria da BCG, uma abordagem alternativa é necessário para melhorar a imunogenicidade sem a necessidade de alternações genéticas incertas.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia romance para exibição de proteínas recombinantes de interesse na superfície das células de BCG que baseia-se na interação conhecida avidin alta afinidade com biotina. Esta abordagem permite fixação rápida e reprodutível de proteínas recombinantes avidin da fusão na superfície do biotinilado BCG, o que facilita o amplas manipulações de BCG para alcançar a máxima melhoria da sua eficácia, mantendo sua segurança excelente grave, observada ao longo de décadas de uso.
Afinidade avidina biotina é extremamente alta (Kd = 10−15 M) e uma vez formado, o complexo biotina-avidina é muito estável e pode ser interrompido somente sob condições6de desnaturação. No entanto, para este tipo de interação para servir como uma alternativa de método de transferência genética, exposição a longo prazo mas reversível das proteínas recombinantes é necessária. Assim, apresentamos aqui uma avidina monomérica de baixa afinidade (Kd = 10−7 M) que leva à liberação reversível de proteína da superfície decorada BCG, uma vez ingerido dentro de células apresentadoras. A fim de fornecer uma prova de conceito, nós testamos esse método usando uma proteína quimérico avidin monomérico, correspondente a um antígeno substituto derivado de ovalbumina (OVA)7,8. Os resultados mostraram que a superfície da célula BCG pode ser facilmente e rapidamente decorada com proteínas da fusão avidin monoméricos e que essa ligação à superfície de BCG é estável e pode ser reproduzido sem alterações detectáveis no crescimento bacteriano e sobrevivência. Além disso, encontramos que a BCG decorado com avidin monomérico fundida com óvulos (AviOVA) pode induzir uma resposta imune semelhante àquela induzida por BCG geneticamente expressando o mesmo antígeno tanto in vitro e in vivo. Esta tecnologia de display reversível das proteínas de interesse na superfície bacteriana é, portanto, um substituto eficaz das abordagens de transferência do gene tradicional e pode fornecer uma plataforma para grandes manipulações de BCG e outras aplicações em vacina desenvolvimento.

<table><tbody><tr>Tecnologias de Células-Tronco <td>RPMI 1640 livres de endotoxinas</td><td>&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotina</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina conjugada com FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>I-Ab-OVA323-339 tetrâmero&nbsp;</td><td>MBL Internacional&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON resina de purificação poli-histidina-Tag&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 rato conjugado anti-camundongo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 rato anti-rato IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 rato anti-rato I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 rato anti-camundongo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE rato anti-camundongo CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 rato anti-rato H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com FITC</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 rato anti-rato CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Ultra-pequeno ouro - conjugado cabra anti-coelho IgG</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 caldo</td><td>BD Sistemas de Diagnóstico</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Sistemas de Diagnóstico</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 linhas celulares de macrófagos murinos</td><td>Tipo Americano Coleção</td><td></td><td></td>de Cultura</tr><tr><td>pDEST17 plasmídeo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pUC57-OVA&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>colunas Ni-NTA&nbsp;</td><td>Concentradores de proteína Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr> Microscópio de epifluorescência <tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II</td> Câmera digital CCD <td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Retiga EX, microscópio eletrônico QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV&nbsp;</td><td>FEI Empresa</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Filtro de células Falcon&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Kit de seleção positiva de biotina para camundongos EasyStep&nbsp;</td><td>Células-tronco</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotina-Ter119/anticorpo de células ertyroid</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit Cytofix/Cytoperm&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de Luciferase Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminômetro&nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 micrótomo</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 liofilizador</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro boroscilicado Wheaton</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão de antígenos exógenos a mycobacterium bovis bcg através da decoração de superfície non-genética com o sistema de avidina-biotina

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa grave e o bacilo da vacina disponível apenas M. bovis Calmette-Guérin (BCG) é segura e eficaz para proteção contra meningite de TB infantil grave e algumas formas de tuberculose disseminada, mas não consegue proteger contra a tuberculose pulmonar, que é a forma mais prevalente da doença. Promissoras para melhorar BCG atualmente confiam na sua transformação com genes que codificam imunodominantes M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos e/ou complementação com genes que codificam co-fatores que estimulam o antígeno apresentação de células. Maiores limitações para essas abordagens incluem baixa eficiência e baixa estabilidade do nível incerto de segurança de vetores de expressão. Neste estudo, apresentamos uma abordagem alternativa para melhoria da vacina, que consiste de complementação do BCG com proteínas exógenas de interesse na superfície de bactérias, ao invés de transformação com plasmídeos codificação de genes correspondentes. Primeiro, as proteínas de interesse são expressos em fusão com avidin monomérico em padrão Escherichia coli sistemas de expressão e, em seguida, usado para decorar a superfície de biotinilado BCG. Usando a superfície de BCG decorado com antígeno de ovalbumina substituto das experiências com animais demonstram que a bactéria modificada é totalmente imunogênicas e capazes de induzir respostas de célula T específica. No total, os dados aqui apresentados fortemente apoiar um romance e um método eficiente para remodelar a vacina BCG atual que substitui a abordagem convencional laboriosa de complementação com os ácidos nucleicos exógenos.

Com os procedimentos gerais descritos acima, foi examinada a viabilidade da superfície biotinylation BCG e decoração com substituto do antígeno óvulos. A imunogenicidade do BCG modificado foi então testado em vivo. A superfície bacteriana foi facilmente rotulada com biotina para exibição rápida dos antígenos quimérico de avidina sem qualquer alteração detectável em fenótipos bacterianas. A BCG modificada resultante é eficientemente ingerido pelas células de apresentação de antíge...

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

O objetivo geral deste procedimento é expressar proteínas de superfície em micobactérias usando decoração de superfície com proteínas recombinantes como uma alternativa às abordagens tradicionais baseadas em genética. Esses métodos podem ajudar a responder a importantes questões de pesquisa no campo da micobacteriologia, especialmente na área de interações hospitalares e desenvolvimento de vacinas. Essa técnica pode ser usada para rastrear possíveis fatores de interferência ou candidatos a antígenos.Pode ser rapidamente comparado a abordagens tradicionais baseadas em genética meticulosas e demoradas. Demonstrando este procedimento estará Amina Talal, assistente de pesquisa em meu laboratório. Esta parte do protocolo começa com a transformação do plasmídeo P17 Aviden OVA em E.Coli BL21.Para isso, induza 250 mililitros de cultura de E.Coli BL21 com IPTG por três horas a 37 graus Celsius. Após três horas, lise as bactérias para solubilizar os corpos de inclusão, primeiro peletizando a cultura BL21 induzida e descartando o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão de lise e deixe as células serem lisadas por 15 minutos.Em seguida, continue a incubação à

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos uma abordagem alternativa para a enumeração de...

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Este vídeo demonstra a indução de inflamação sistêmica em um camundongo anestesiado. A injeção de depósitos adjuvantes de antígenos micobacterianos desencadeia a liberação de citocinas e inflamação localizada. Os vasos linfáticos se abrem, permitindo a entrada de células imunes nos gânglios linfáticos e a ativação das células T, que liberam citocinas pró-inflamatórias, levando à inflamação generalizada.

Injeção subcutânea de antígeno bacteriano para induzir inflamação sistêmica em modelo murino

Este vídeo demonstra a preparação e quantificação do inóculo lux de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin usando ensaio de bioluminescência e a enumeração de unidades formadoras de colônias. O inóculo preparado pode ser usado para estudos de infecção.

Preparação e quantificação do inóculo de Mycobacterium bovis BCG lux para infecção

Este vídeo demonstra um método para gerar vacinas de vesícula de membrana externa (OMV) com exibição multivalente. As células de mamíferos são transfectadas para expressar e secretar antígenos virais fundidos a um SpyTag e a uma etiqueta de poli-histidina. Esses antígenos são então purificados usando uma coluna de afinidade de ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). O antígeno purificado é misturado com vesículas de membrana externa que expressam a proteína SpyCatcher (SC) ligada à superfície. Vários...

Gerando uma vacina de vesícula de membrana externa de exibição multivalente

O vídeo demonstra uma técnica de carregamento de antígenos no Mycobacterium bovis BCG para melhorar suas propriedades imunogênicas. O método usa o sistema avidina-biotina para revestir a superfície bacteriana com antígenos exógenos.

Uma técnica de conjugação Avidina-Biotina para Apresentação de Antígenos-Alvo em Mycobacterium bovis BCG

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Detalhamos aqui a metodologia seguida para comparar a eficácia protetora e a resposta imune pulmonar induzida pela imunização intranasal e subcutânea com BCG em modelo de camundongo. Nossos resultados mostram os benefícios da vacinação pulmonar e sugerem um papel da resposta mediada por IL17 na proteção induzida pela vacina.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Aprenda a expressar proteínas de superfície em micobactérias usando decoração com proteínas recombinantes via sistema avidina-biotina. Este método não genético oferece uma alternativa rápida às abordagens tradicionais para desenvolvimento de vacinas BCG.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina (Vídeo) | JoVE Journal

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

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